Amide hydrogène / deutérium Analyse Bourse & MALDI-TOF spectrométrie de masse de PAK2 activation

Cette expérience montre comment utiliser la spectrométrie de masse pour suivre l'échange hydrogène-deutérium associé aux protéines. Les changements structuraux menant à des états d'activation consistent d'abord à cliver la protéine kinase PAC deux avec la caspase trois, puis à activer PAC deux par autophosphorylation en utilisant le TP comme substrat. Dans un second temps, digérer PAC deux avec la pepsine et analyser les fragments protéiques de PAC deux par spectrométrie de masse en tandem. Procéder ensuite à l'analyse des profils d'échange hydrogène-deutérium de PAC deux par une surveillance « mold off » du niveau de chaque fragment de PAC deux, et déterminer précisément le degré d'échange hydrogène-deutérium à l'aide d'une analyse par « mold to ». Ces données fournissent des informations importantes sur le clivage par la caspase trois et l'autophosphorylation de PAC deux.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions relatives à la dynamique des protéines, telles que les changements conformationnels des protéines, les interactions entre protéines et ligands, et les interactions protéine-protéine. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la spectrométrie de masse LCQ avec échange de HD, est d'ordre instrumental. Cette procédure ne nécessite pas de spectrométrie de masse couplée à une HPLC pour analyser les résultats d'échange de HD, et elle est facile à mettre en œuvre. Pour cliver 0,6 microgramme de PAC deux.

Ajoutez la caspase 3 et incubez la réaction à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes. Vérifiez la PAC 2 et la clivaison complète de la PAC 2 par analyse des produits par électrophorèse SDS-PAGE. Pour la réaction d'activation, ajoutez la PAC 2 clivée à 20 microlitres de tampon d'activation B et incubez à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Utilisez un gel SDS pour confirmer l'autophosphorylation par la migration des fragments P 34 et P 27. Commencez par laver deux fois les billes d'agro conjuguées à la purine avec un millilitre d'acide trifluoroacétique (TFA) 0,1 %, puis diluez deux microlitres de 10 milligrammes par millilitre. Prélevez deux fois 100 microlitres de TFA 0,1 %, ajoutez 30 microlitres des billes d'agro conjuguées à la Pepsi lavées et incubez pendant cinq minutes.

Procédez à l'équilibration d'une colonne en phase inverse HPLC-C18 avec 0,1 % de TFA à pH 2,5. Chargez ensuite le digest de Pepin et diluez à l’aide d’un gradient linéaire de 100 minutes. Récoltez les fractions toutes les deux minutes, après avoir séché les fractions HPLC à l’aide d’un évaporateur sous vide rapide.

Suspendre les échantillons dans cinq microlitres d'acétonitrile et de 0,1 % de TFA à pH 2,5. Comme tamisage initial, analyser chaque fraction pour les peptides par moldy afin de détecter toutes les fractions contenant des peptides.

Identifier les fragments par spectrométrie de masse en tandem. Utiliser la fonction produit MS dans Protein Prospector pour faire correspondre les ions fils aux rapports théoriques M/Z basés sur la séquence primaire de PAC deux. Équilibrer d'abord toutes les solutions et réactifs pour l'échange hydrogène-deutérium.

Initier l'échange hydrogène-deutérium en ajoutant 18 microlitres de tampon D deux O à deux microlitres de 10 milligrammes par millilitre. Conditionner deux, effectuer les réactions en triple exemplaire selon un cours temporel. Arrêter la réaction d'échange hydrogène-deutérium avec 180 microlitres de TFA à 0,1 % glacé à pH 2,2.

Répartissez maintenant des aliquotes de 100 microlitres d'hydrogène deutérié. Ajoutez deux aliquotes pour chaque 30 microlitres de billes agrégées conjuguées de pépine activées. Incubez cette digestion à la pépine sur de la glace pendant cinq minutes.

Vortexez toutes les 30 secondes pour interrompre efficacement les réactions de digestion par une centrifugation permettant d'éliminer rapidement la pépsine. Congelez les échantillons dans l'azote liquide en vue d'une analyse ultérieure. Préparez la matrice et conservez-la à zéro degré Celsius, puis décongelez partiellement chaque échantillon rapidement.

Mélanger un microlitre d'échantillon avec un microlitre de matrice, puis déposer sur une plaque cible moisie à quatre degrés Celsius 30 secondes avant l'analyse. Appliquer un vide modéré sur la plaque pour sécher. Les taches continuent d'acquérir des spectres de masse moyennant 100 balayages en deux minutes.

Procédez à l'utilisation du programme informatique Data Explorer 4.0 pour calculer la durée de chaque fragment. Calculez ensuite l'échange arrière en fonction du rapport entre l'incorporation réelle due à un nombre après 24 heures d'échange hydrogène-deutérium divisé par tous les sites échangeables possibles, qui sont les amides du squelette, à l'exception de l'amide terminal. Dans cet exemple, la clivaison et l'autophosphorylation de CASP Bay sont vérifiées par électrophorèse sur gel SDS et coloration au Kumasi.

Le PAC deux inactif non phosphorylé est une bande unique de 58 kilodaltons CASP bay. Le clivage du PAC deux est complet et produit deux fragments : P 27, le domaine régulateur, et P 34, le domaine catalytique, suite à l'auto-phosphorylation. La migration des fragments P 27 et P 34 auto-phosphorylés montre un recouvrement sur le gel protéique en raison de la migration retardée du fragment P 27 entièrement phosphorylé par rapport au PAC deux non phosphorylé.

Ce spectre de masse montre un suivi temporel de l'incorporation de deutérium pour la PAC inactive deux. Le pic MZ 1697,85 est composé de plusieurs pics isotopiques, comme illustré par le déplacement de l'enveloppe de masse. Au fil du temps, la ligne pointillée rouge indique la moyenne de l'enveloppe de masse, et le déplacement de cette enveloppe indique la durée d'un peptide une fois maîtrisée.

Cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement. N'oubliez pas que le travail avec de l'azote liquide peut être extrêmement dangereux ; prenez donc des précautions, telles que percer un trou dans le bouchon du tube EOL de 1,5 ml avant de le placer dans l'azote liquide.