Analisi della migrazione cresta neurale e la differenziazione delle specie da Cross-trapianto

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di innestare un tubo neurale dorsale da un embrione di quaglia in un embrione di pollo abbinato in stadi, in modo da tracciare la migrazione e il destino delle cellule della cresta neurale. Ciò si ottiene strappando prima un piccolo foro nella membrana IGN dell'embrione di pollo ospite per accedere al tubo neurale. L'embrione di quaglia donatrice viene quindi rimosso dal suo ovulo per prepararlo all'escissione del trapianto.

Nella fase successiva, la regione di interesse viene asportata dal tubo neurale dell'embrione ospite. Una regione simile viene quindi asportata dal tubo neurale del donatore per l'innesto. Successivamente, il tubo neurale del donatore viene trapiantato nel tubo neurale ospite.

Infine, l'embrione chimerico viene incubato allo stadio desiderato per il rilevamento delle cellule arrivate dalla cresta neurale nell'organo di scelta. In definitiva, la migrazione e la differenziazione delle cellule della cresta neurale derivate dal donatore in varie posizioni dell'embrione ospite possono essere visualizzate attraverso la microscopia a immunofluorescenza. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le fasi di micro dissezione e innesto richiedono capacità motorie molto fini, rendendole difficili da imparare.

Inizia lavando i detriti delle uova di pollo con acqua tiepida. Disporre le uova orizzontalmente su un vassoio e poi segnare i lati rivolti verso l'alto con la matita per indicare la regione in cui verrà localizzato l'embrione. Per la preparazione X ovo di embrioni di donatore, incubare le zampe di quaglia con il lato smussato.

Successivamente, metti le uova in un'incubatrice umidificata a 38 gradi Celsius e attiva la funzione di dondolo. Dopo che le uova hanno finito, l'incubazione sterilizza le parti superiori spruzzandole con etanolo al 70% e poi asciugandolo rapidamente con una salvietta kim Per evitare qualsiasi assorbimento attraverso l'uovo, il guscio posiziona ogni uovo sterilizzato su un singolo portauova, simile alla capsula di Petri foderata con salviette Kim piegate che vedi qui. Quindi, utilizzando una pinza AA sterilizzata, picchiettare un piccolo foro sulla superficie superiore del guscio dell'uovo all'estremità appuntita dell'uovo.

Equipaggiare una siringa da cinque millilitri con un ago ipodermico calibro 18 e mezzo. Quindi, con lo smusso rivolto verso l'estremità appuntita dell'uovo, inserire l'ago verticalmente nel foro del guscio dell'uovo. Per evitare di danneggiare accidentalmente il tuorlo tramite aspirazione, pulire il foro con etanolo al 70% come prima e sigillare il foro con nastro adesivo.

Quindi, con la doppia pinza A, picchiettare un altro foro nella superficie superiore contrassegnata della gamba orizzontale, non proprio all'apice. Quindi, inserisci un lato della pinza dell'iride curva nel foro parallelo all'uovo. Il guscio quindi pizzica il guscio e lavora con un movimento circolare.

Rompere una finestra, due centimetri di diametro nell'uovo di gallina, sgusciare il guscio d'uovo rimosso. L'embrione dovrebbe apparire come un disco opaco sopra il tuorlo. Scartare le uova non fecondate identificate da una piccola macchia bianca sulla superficie del tuorlo o dall'assenza del derma blaster.

Ora, mentre indossi un'adeguata protezione per gli occhi, piega un ago ipodermico calibro 26 e mezzo con un angolo di 45 gradi partendo dalla base dell'ago. Dopo aver attaccato il lato smussato dell'ago piegato a una siringa da un millilitro, riempire l'ago con inchiostro di china diluito. Forare la membrana del vitellino al di fuori del perimetro del blaster e far scorrere la punta dell'ago sotto l'embrione, vicino alla superficie del tuorlo, ma non negli strati embrionali.

Quindi iniettare quanto basta di inchiostro per delineare l'embrione ed evitare di iniettare bolle. Estrarre con cautela l'ago. Ora utilizza uno stereomicroscopio e una sorgente luminosa con un carico termico limitato, come la lampada a collo d'oca a fibra ottica mostrata qui.

Mettere in scena gli embrioni secondo hamburger e Hamilton. Registra il palco sui gusci d'uovo. Quindi applicare due o tre gocce di soluzione calda sterile sulla superficie degli embrioni per prevenire la disidratazione e la contaminazione.

Quindi stendere la pellicola para sulla superficie delle uova per sigillare temporaneamente le finestre. Quindi, prepara le uova di quaglia per il trapianto. Prima di togliere le uova dall'incubatrice, riempire una capsula di Petri con una soluzione di ringer.

Quindi apri le uova sul lato smussato con una pinza curva per rivelare l'embrione. Usando le forbici da dissezione, fai quattro tagli a forma di quadrato attraverso la membrana del vili e fai esplodere il derma all'esterno dell'embrione, assicurandoti che tutti i tagli corrispondano. Quindi, usando una pinza a iride curva, afferra delicatamente un bordo tagliato e solleva l'embrione dall'uovo e trasferiscilo nella capsula di Petri preparata.

Infine, rimuovere delicatamente la membrana vitellina con una pinza numero cinque, quindi mettere in scena gli embrioni al microscopio da dissezione. Rimuovere la para pellicola dall'embrione di pollo ospite. Quindi, utilizzando un ago di tungsteno affilato, strappare un piccolo foro nella membrana VII nella regione desiderata del tubo neurale.

Aggiungere una goccia di soluzione di ringer all'embrione. Successivamente, per gli innesti unilaterali, come quello eseguito in questo video, utilizzare un ago di vetro colato per praticare con cura incisioni trasversali rostrali e cordali nella regione del mesencefalo del tubo neurale, che non si estendono oltre il lume. Quindi tagliare bilateralmente tra il tubo neurale dorsale e il mesoderma pariale.

Infine, separare con cura l'ex explan asportato dal tubo neurale, quindi rimuoverlo dall'embrione aspirandolo in una micropipetta di vetro. Innanzitutto, usa un embrione di quaglia abbinato allo stadio. Quindi asportare una regione del tubo neurale di dimensioni simili come appena mostrato e aspirare l'explan X del donatore in una micropipetta di vetro contenente la soluzione di ringers.

Trasferire l'explan X adiacente alla regione asportata del pulcino ospite. Quindi, utilizzando un ago di vetro tirato, orientare l'ex explan guidandolo delicatamente nella regione ablata. Aggiungere con cura alcune gocce di soluzione di ringer all'embrione per prevenire la disidratazione.

Infine, sigillare la finestra con del nastro adesivo, assicurandosi che il nastro sigilla l'intera regione dell'uovo finestrato, rimettere l'uovo nell'incubatrice fino allo stadio desiderato, disattivando la funzione di oscillazione durante l'incubazione del kyira, la X può essere ruotata delicatamente a mano due volte al giorno per aumentare la loro vitalità. Se si prendono di mira gli stadi successivi dello sviluppo, questa immagine rappresentativa della regione innestata del tubo neurale dopo sei ore di reincubazione a HH 11, mostra l'incorporazione prevista del tessuto donatore di quaglia innestato nel tubo neurale del pulcino ospite. Questa sezione trasversale attraverso la regione innestata a HH 11 mostra cellule della cresta neuronale marcate con hnk, una che migra lateralmente lontano dal tubo neurale.

Le cellule di quaglia che contribuiscono al flusso migratorio delle cellule della cresta neurale e al tubo neurale sono chiaramente marcate con QCPN. Nelle fasi successive, le cellule derivate dalle cellule della cresta neurale delle quaglie possono essere rintracciate nel loro tessuto bersaglio finale. Come si può vedere in questa figura, le cellule marcate con QCPN sono intervallate all'interno dell'embrione di pollo meen chi del processo mascellare A E cinque, l'anticorpo QCPN può essere facilmente combinato con altri anticorpi per esaminare la differenziazione delle cellule della cresta neurale derivate dalla quaglia.

Nell'ambiente host. Come si vede qui, i neuroni sensoriali trigeminali derivati dalle cellule della cresta neurale delle quaglie sono marcati dagli anticorpi QCPN e T UJ one. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunoistochimica e l'ibridazione in situ per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio a quali tessuti danno origine le cellule della cresta neuro e quali geni esprimono le cellule della cresta neuro mentre si differenziano in vari tessuti.