Name: High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dellinfluenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Scopri un metodo ad alto rendimento per rilevare il virus dell'influenza H1N1 nel liquido di lavaggio broncoalveolare di topi infetti. Questa tecnica basata su imaging a infrarossi offre alta sensibilità e richiede piccoli volumi campione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è sostenuto in parte A1064826 sovvenzioni NIH R01-01, U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (a SM). Ringraziamo i nostri membri di laboratorio per la discussione e aiuto tecnico, Tina Heil per la revisione critica del manoscritto. Vorremmo ringraziare David Bina, Milwaukee Dipartimento di Sanità Laboratorio per la cultura virus e PCR.

<ol><li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li>
<li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%25+or+plaque+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li>
<li>Kalter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinating+Behavior+of+Mouse+and+Egg-adapted+Type+A+%28PR8%29+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus.</a> Science. 110, 184-184 (1949).</li>
<li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Plaques+in+Monolayer+Tissue+Cultures+by+Single+Particles+of+an+Animal+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).</li>
<li>Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+markers+of+antiviral+resistance+in+influenza+A+%28H5N1%29+viruses+using+a+pyrosequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).</li>
<li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%25+or+plaque+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li>
<li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+Directigen+flu+A%2BB+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li>
<li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A%2BB+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li>
<li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR%3A+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+%28FLU+OIA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+into+the+infrared%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li>
<li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+%28H1N1%29+pandemic+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Lo scoppio recente epidemia di influenza aviaria nel Sud-Est asiatico e la paura globale della pandemia di influenza suina impongono enormi preoccupazioni per la salute e la sicurezza pubblica. Attenzione critica è stata dedicata nel generare vaccini per i ceppi esistenti e nuovi di virus influenzale. Disponibilità di rapide tecnologie high-throughput per la rilevazione precisa ed accurata calcoli titolo virale sarà migliorare enormemente il trattamento. Le tecniche più comunemente utilizzate per il calcolo impiegati titolo virale comprendono saggi emoagglutinazione la formazione della placca e l&#39;influenza. Il saggio la formazione della placca è stato inizialmente sviluppato per stimare i titoli batteriofagi ed è stato adottato da Renato Dulbecco per calcolare animali titoli virali 4. Per eseguire questo saggio, 10-diluizioni di archivio di influenza o di esemplari di animali, quali fluidi BAL sono preparati e 0,1 ml sono inoculate sul monostrato di cellule MDCK in 6-pozzetti. Il virus è permesso di adsorbire sulle cellule MDCK seguite da l&#39;annunciodizione di un mezzo nutriente e agarosio. Durante l&#39;incubazione, le celle originali infette rilasciare progenie virale che si diffuse solo per le cellule vicine. L&#39;effetto citopatico dell&#39;infezione influenzale virale produce una zona circolare di cellule infettate chiamato una targa. Ogni placca viene presumibilmente formata dopo infezione di una singola cella con una particella virus singolo seguito da replicazione del virus. Contrasto tra le cellule viventi e delle targhette possono essere arricchito da coloranti come la violetta cristallo. Un inconveniente principale di questo saggio è la mancanza di riproducibilità e di enormi variazioni all&#39;interno di esperimenti. Un&#39;altra dosaggio utilizzato per determinare il titolo virale influenzale è il dosaggio emoagglutinazione. La presente proteina emoagglutinina sulla superficie del virus influenzale si lega in modo efficiente per N-acetilneuraminico-proteine ​​contenenti su mammiferi e aviaria globuli rossi 1. Questa interazione tra il virus influenzale e gli eritrociti conduce al agglutinazione in forma di un reticolo. Il lEvel di agglutinazione viene utilizzato per stimare il titolo del virus dell&#39;influenza in campioni. Test di agglutinazione degli eritrociti viene utilizzata solo per determinare la titolazione di un virus noto e non può essere utilizzato a fini di identificazione estensimetri. Dal momento che questo test non fa differenza fra la vita e la morte dei virus, è difficile ottenere un calcolo preciso di titoli virali. Attuali diagnosi cliniche di infezioni influenzali si basano su test sierologici, reazione a catena della polimerasi, immunofluorescenza diretta del campione e la cultura delle cellule 1,6. Il nuovo metodo descritto qui ha anche clinico e di laboratorio potenziale diagnostico. Influenza rilevamento kit Directigen FLU-A (BD Biosciences, San Jose, CA) e BinaxNOW (Binax, Inc., Scarborough, ME) immunocromatografia test utilizzare per rilevare l&#39;antigene virale, come nucleoproteina 7. L&#39;utilizzo di questi kit, il rilevamento di virus possono essere raggiunti entro 15 minuti, tuttavia, tutti i campioni negativi devono essere ulteriormente screened dal metodo coltura cellulare. Diversi studi hanno anche riportato bassa sensibilità di questi kit, in particolare, quando l&#39;infezione era lieve o basso 8. Nel nostro metodo, abbiamo costantemente rilevare a partire da 100 PFU di virus. Questo suggerisce la nostra tecnica è utile per rilevare virus H1N1 in campioni clinici, anche quando l&#39;infezione è mite. Un metodo basato sulla fluorescenza per rilevare antigeni virali è stata riportata, in cui sia campioni di aspirato nasofaringeo sono stati analizzati direttamente o sono state inoculate su un monostrato di cellule sensibili alla moltiplicazione del virus e le analisi successive 9. Tuttavia, questi metodi sono limitati per scopi diagnostici e non sono adatti per calcoli titolo virale. Q-PCR aiuta a identificare la presenza di RNA virale e non stimare la infettività di virus vivi. Rispetto a questi saggi, IR dye-based sistema di analisi aiuterà nella ricerca e la conta titolo virale in campioni clinici e di laboratorio. In caso di focolaio di influenza, ècritico per diagnosticare migliaia di campioni in un periodo di tempo breve. Il nostro metodo basato su una piastra a 384-bene e scanner IR possibile eseguire la scansione 6-piastre alla volta (&gt; 2.000 campioni), offrendo pertanto un vantaggio maggiore rispetto ad altri metodi diretti fluorescenti. Fattibilità di un trattamento rapido di migliaia di campioni clinici potrebbero ridurre la variabilità di prova, la durata del tempo di saggio e di costi. L&#39;uso di un M2-specifico anticorpo offre il vantaggio di essere indipendente di differenze di ceppi in proteine ​​H e N. La proteina M2 è relativamente conservata nella maggior parte dei ceppi influenzali che infettano gli esseri umani. Se gli anticorpi specifici per macchie circolanti sono combinati con il nostro sistema uno può misurare sia il titolo di virus e identificare il ceppo. Tuttavia, poiché M2 è l&#39;obiettivo per i farmaci come amantadina, i mutanti possono nascere che potrebbe cambiare il sito di legame per l&#39;anticorpo monoclonale usato qui. Questo rappresenta una potenziale limitazione di questo sistema negli individui che vengono trattati con questi farmaci. Multiplosaggi vengono utilizzati per enumerare i titoli influenzali nei campioni di prova. Per calcolare virus titolo, 50% della dose coltura tissutale infettiva (TCID 50) e uova allantoici fluido-saggi basati sono ampiamente utilizzati 1,10. Tuttavia, i requisiti di più giorni rendono questi metodi meno affidabile. Inoltre, in questi metodi calcoli basati sulla variazione 50% nel il numero di placche fornire titolazioni virali teoriche ma non accurate. La formazione della placca analisi può essere eseguita entro 96 ore, tuttavia, la mancanza di riproducibilità è un problema importante nei calcoli titolo virale. La presente tecnica descritta qui ha diversi vantaggi. In primo luogo, essa è una tecnica altamente riproducibile con esiti coerenti. In secondo luogo, i calcoli titolo virale si basano sulla quantificazione semplice intensità di fluorescenza che vengono confrontati con le curve standard definiti. Terzo, due o più anticorpi primari può essere utilizzato per diagnosticare sierotipi multipli in un dato campione. Inoltre, IR dye-anticorpi coniugati sono minimal autofluorescenza e sono stati utilizzati per cella l&#39;imaging 11. UV o visivo radiazioni (300-600 nM) risultati in alta autofluorescenza cellulare dovuta alla presenza di elevati quantistica fluorofori rendimento endogene. Questi includono gli amminoacidi aromatici, lipo-pigmenti, nucleotidi pyridinic (NADPH), elastina, collagene e coenzimi Flavin. Questa proprietà intrinseca di cellule rende difficile utilizzare queste fonti di radiazioni come sonde per quantificare l&#39;espressione di proteine ​​specifiche. Al contrario, near-IR coloranti emozionare ed emettono tra i 670-1000 nm. Molte molecole host cellulari e gli idrocarburi policiclici aromatici non eccitano a questa lunghezza d&#39;onda e grazie alla riduzione della dispersione della luce, emettono fluorescenza di fondo estremamente basso. Inoltre, la finestra tra lo sfondo e rilevazione specifico è molto migliorato a causa di un coefficiente elevato di estinzione delle vicino-IR fluorofori. Fotostabilità, superiore rapporto segnale-rumore, è estremamente rilevante nella quantificazione dei titoli virali. Uso di microflcamere uidic automatizza il processo di screening attraverso controlli robotici, e potrebbe consentire di testare campioni clinici altamente contagiose con facilità. Così, l&#39;utilizzo di vicino-IR coloranti in questi metodi è ideale e altamente affidabile per enumerare titoli virali in campioni di tessuto.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Bovina albumina sierica </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8 virus </td><td></td><td></td><td> Dal Dr Thomas Moran M </td></tr><tr><td> Capra anti-topo IRDye @ 800 </td><td> LI-COR bioscienze </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200 diluizione </td></tr><tr><td> LI-COR Odyssey IR scanner </td><td> LI-COR-bioscienze </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384 pozzetti della piastra di fondo piatto </td><td> Nalge Nunc internazionale </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-pozzetti della piastra di fondo piatto </td><td> Nalge Nunc internazionale </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM media </td><td> Invitrplasminogeno </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> Medium RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato di sodio </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutammina 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio Piruvato </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-M-2 anticorpo </td><td></td><td></td><td> Dal Dr Thomas Moran M </td></tr><tr><td> Anti-NP mAb </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> Ottenuto con un MTA </td></tr></tbody></table>

high-throughput metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Il virus influenzale è un patogeno respiratorio che provoca un elevato livello di morbilità e mortalità ogni anno in più parti del mondo. Pertanto, la diagnosi precisa del ceppo infettante e rapida high-throughput screening di un gran numero di campioni clinici è fondamentale per controllare la diffusione delle infezioni pandemiche. Attuali diagnosi cliniche di infezioni influenzali si basano su test sierologici, reazione a catena della polimerasi, immunofluorescenza diretta del campione e la cultura delle cellule 1,2. Qui, segnaliamo lo sviluppo di una nuova tecnica diagnostica utilizzata per rilevare virus influenzali vivi. Abbiamo usato il mouse adattato umana A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 per testare l&#39;efficacia di questa tecnica utilizzando cellule MDCK 4. Cellule MDCK (10 4 o 5 x 10 3 per pozzetto) sono state coltivate in 96 - o piastre da 384 pozzetti, infettati con PR8 e proteine ​​virali sono stati rilevati utilizzando anti-M2 seguita da uno IR colorante-coniugato secanticorpale secondaria. M2 5 e emoagglutinina 1 sono due proteine ​​marker principali usati in molti diversi saggi diagnostici. Che impiegano anticorpi secondari IR-dye-coniugati minimizzato l&#39;autofluorescenza associata ad altri coloranti fluorescenti. L&#39;uso di anti-M2 anticorpo ci ha permesso di utilizzare l&#39;antigene-specifica intensità di fluorescenza come una metrica diretta di quantità virale. Per enumerare l&#39;intensità di fluorescenza, abbiamo usato il LI-COR Odyssey scanner basato su IR. Questo sistema utilizza due canali laser basati su rilevamenti a raggi infrarossi per identificare fluorofori e differenziarli dal rumore di fondo. Il primo canale eccita a 680 nm ed emette a 700 nm per contribuire a quantificare lo sfondo. Il secondo canale rileva fluorofori che eccitano a 780 nm ed emette a 800 nm. Scansione delle cellule MDCK PR8-infetti nello scanner IR indicato un titolo virale-dipendente fluorescenza. Una correlazione positiva di intensità di fluorescenza a titolo virale a partire dal 10 2 -10 5 PFU potrebbe essere conconsistentemente osservato. Positività Minimal ma rilevabile sempre visto con 10 2 -10 3 PFU PR8 titoli virali dimostrato l&#39;elevata sensibilità delle near-IR coloranti. Il rapporto segnale-rumore è stata determinata confrontando i mock-infettate o cellule MDCK anticorpi isotipo-trattati. Utilizzando le intensità di fluorescenza da 96 - o formati piastra da 384 pozzetti, abbiamo costruito curve di titolazione standard. In questi calcoli, la prima variabile è il titolo virale mentre la seconda variabile è l&#39;intensità di fluorescenza. Pertanto, abbiamo usato la distribuzione esponenziale per generare una curva-fit per determinare la relazione polinomiale tra i titoli virali e intensità fluorescenza. Collettivamente, possiamo concludere che IR dye-based sistema di rilevazione delle proteine ​​può aiutare a diagnosticare infettare i ceppi virali e precisamente enumerare il titolo degli agenti patogeni infettanti.

Questo metodo descrive l&#39;utilizzo di Infrared sistema colorante di imaging based per il rilevamento di H1N1 in bronchioalveolar lavaggio (BAL) fluido di topi infettati ad una sensibilità elevata. Questa metodologia può essere eseguita in uno 96 - o 384-bene piastra, richiede &lt;10 volume pl di materiale di prova e ha il potenziale per lo screening concomitante di agenti patogeni multipli.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Il virus dell'influenza è un patogeno respiratorio che causa ogni anno un elevato grado di morbilità e mortalità in diverse parti del mondo. Pertanto, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare in modo efficiente i titoli virali dell'influenza nelle vie aeree di topi infetti. I topi vengono innanzitutto inoculati per via intranasale con il virus dell'influenza in un momento selezionato. Punti temporali successivi all'infezione.Gli M vengono sacrificati e viene raccolto il lavaggio broncoalveolare o liquido BAL. Successivamente, il liquido BAL viene utilizzato per infettare cellule MDCK. Le cellule infette possono quindi essere colorate per rilevare la presenza di proteine virali mediante anticorpi primari specifici, seguiti da anticorpi secondari coniugati con infrarosso.I segnali infrarossi vengono letti utilizzando lo scanner Lycor Odyssey e il software Odyssey può essere impiegato per determinare i titoli virali. Mediante una curva standard, è possibile ottenere una determinazione quantitativa dei titoli virali. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti sono la quantificazione precisa dei titoli virali, la riproducibilità e il piccolo volume richiesto per eseguire questo saggio.Le implicazioni di questa tecnica possono essere estese alla diagnosi e terapia di diverse malattie virali respiratorie, poiché può essere utilizzata per quantificare i titoli virali in campioni clinici seguendo questa procedura. Altri metodi, come la QPCR, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, come il numero di copie virali. Nel tentativo di applicare questa tecnica, è importante ricordare di verificare il virus di controllo del titolo standard dopo questo sviluppo.Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della logica virale per esplorare il titolo virale o marcare con colorazione le proteine virali in campioni clinici. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in 17 ore. Viene eseguita inoculando con precisione i topi per via intranasale con 5.000 unità formanti placca o PFU del virus dell'influenza PR8 in 30 microlitri di PBS sterile o con PBS da solo come controllo negativo per la raccolta del liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL) dagli animali sacrificati; innanzitutto, si apre la cavità toracica e si pratica un'incisione di un centimetro parallela alla trachea per esporla con pinzette e forbici sterili finemente affilate.Eseguire una piccola incisione nella trachea, infondere la trachea con 0,5 millilitri di PBS contenente l'1% di BSA ed aspirare delicatamente il liquido di lavaggio. Conservare i fluidi di BAL a meno 20 gradi centigradi per quantificare i titoli virali nei fluidi di lavaggio. Il giorno successivo, coltivare prima 5 milioni di cellule MDCK in 20 millilitri di RPMI completo in un’aliquota T75 durante la notte a 37 gradi centigradi, raccogliere le cellule e seminarle in una piastra ottica nera a fondo piatto da 96 pozzetti, con 10.000 cellule per pozzetto.Quindi incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi centigradi dopo l'incubazione. Aspirare delicatamente il soprannatante e lavare le cellule due volte in DMEM completo ma privo di siero, contenente 0,2% di BSA al posto di FBS. Dopo aver lavato le cellule, aggiungere 50 microlitri di liquido BAL o 50 microlitri di una sospensione contenente una concentrazione nota di virus per pozzetto.Quindi aggiungere 50 microlitri per pozzetto di DMEM, mezzo contenente tripsina trattata con TPCK a 0,2 microgrammi per millilitro per favorire l'attacco, l'ingresso e la replicazione virale. Incubare le cellule per un'ora a 37 gradi centigradi per consentire l'assorbimento del virus. Quindi aggiungere 100 microlitri di RPMI completo contenente FBS a ogni pozzetto e coltivare le cellule durante la notte per permettere la propagazione dell'infezione dopo l'incubazione notturna.Lavare le cellule con 100 microlitri di PBS al 1% contenente BSA. Dopo aver lavato le cellule, aggiungere 100 microlitri per pozzetto di paraformaldeide al 1% e incubare le piastre per cinque minuti a temperatura ambiente per fissare le cellule. Successivamente, lavare con 100 microlitri per pozzetto di PBS al 1% contenente BSA e incubare le cellule per ulteriori 30 minuti per il blocco. Una volta bloccate le cellule, aggiungere 50 microlitri per pozzetto di anticorpo primario anti-virale M2 diluito 1:1000 e incubare le piastre per un'ora a temperatura ambiente per rivelare eventuali proteine virali presenti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte in PBS al 1% contenente BSA e incubarle con 100 microlitri per pozzetto di anticorpo secondario coniugato con colorante infrarosso, diluito 1:200, per un'ora a temperatura ambiente al buio. Dopo la colorazione delle cellule, lavarle tre volte come precedentemente descritto.Quindi posizionare le piastre sulla piattaforma di lettura del lettore infrarosso Licor Odyssey. Selezionare l'impostazione per piastra a 96 pozzetti sul lettore utilizzando il software Licor Odyssey. Identificare i pozzetti di controllo negativo vuoti, quindi quantificare la fluorescenza proveniente dall'intera piastra.Utilizzare lo strumento forma automatica per disegnare la regione di interesse o ROI al centro di un test. Useremo la ROI di un controllo negativo, al fine di stabilire il valore di fluorescenza di base per il saggio, quindi introdurre i due mirini incrociati opposti forniti dal software Odyssey all'interno della ROI per misurare l'intensità della fluorescenza attraverso il pozzetto.Successivamente, scansionare la piastra utilizzando il canale a 780 nanometri per il rilevamento e quello a 680 nanometri come lunghezza d'onda di riferimento. Una volta attivato il comando di lettura, verranno misurate le intensità fluorescenti a intervalli uniformi dell'area di interesse (ROI). Quindi, i punti dati raccolti verranno integrati.Un moltiplicatore della deviazione standard determinerà il livello di segnale rispetto alla linea di base da includere nell'area di interesse (ROI); assicurarsi di selezionare l'opzione intensità integrata per i calcoli, poiché rappresenta il volume totale dei pixel per aree definite indipendentemente dalla dimensione. La fluorescenza di fondo sarà quantificata dai controlli non infettati e verrà utilizzata per stimare l'intensità integrata nelle pozzette di prova. La fluorescenza nell'infrarosso proveniente da pozzette duplicate contenenti diluizioni seriali di virus titolato viene utilizzata per costruire una curva standard.La curva standard può quindi essere utilizzata per determinare i titoli del liquido BAL proveniente da topi infetti. In questo esperimento, è stato osservato un aumento significativo del carico virale al secondo e al quarto giorno. Il virus è stato eliminato entro il decimo giorno successivo all'infezione, come mostrato in questo caso.I titoli virali misurati utilizzando questo saggio mostrano una buona correlazione con la perdita di peso nei topi dopo l'infezione. Questa tecnica può essere applicata anche a campioni umani. Qui viene mostrata una quantificazione del virus H1N1 da un tampone nasale umano.Il limite di rilevamento qui è di 10 alla terza TCID, o dose infettiva per coltura tissutale. Dopo aver visto questo video, si ha anche una buona comprensione di come stimare il titolo del virus dell'influenza mediante saggio basato su colorante infrarosso. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale perché l'utilizzo del lettore di immagini può risultare difficoltoso e questo aiuterà a semplificare e illustrare i nostri metodi per la quantificazione dei titoli virali in una piastra da 96 o 384 pozzetti.E infine, non dimenticare che lavorare con i virus può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale durante l'esecuzione di questa procedura.

high-throughput-detection-method-for-influenza-virus

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Salvataggio di virus dell'influenza A dal DNA plasmide è una tecnica di base ed essenziale sperimentale che consente ai ricercatori di generare virus influenzali ricombinanti per studiare i molteplici aspetti della biologia del virus dell'influenza, e da utilizzare come potenziali vettori o vaccini.

Generazione di influenza da virus ricombinante del DNA plasmidi

ampliPHOX tecnologia di rilevamento colorimetrico viene presentato come un'alternativa economica a fluorescenza per microarray. Sulla base di fotopolimerizzazione, ampliPHOX produce spot polimero solido visibile ad occhio nudo in pochi minuti. I risultati sono poi ripreso e interpretato automaticamente con un pacchetto software semplice ma potente.

ampliPHOX rilevazione colorimetrica su un DNA microarray per l&#39;influenza

Questo studio descrive la diagnosi dell'influenza aviaria nei volatili selvatici utilizzando un portatile rRT-PCR sistema. Il metodo si avvale di liofilizzati reagenti per lo screening degli uccelli selvatici in un non-laboratorio di impostazione, tipica di uno scenario di un'epidemia. L'uso di strumenti molecolari fornisce alternative accurata e sensibile per la diagnosi rapida.

La diagnosi rapida del virus dell&#39;influenza aviaria nei volatili selvatici: l&#39;uso di un Portable rRT-PCR e liofilizzato reagenti nel campo

In questo video, discutiamo la correlazione tra il CIT50 e la molteplicità delle infezioni virali. Le cellule infettate dal virus mostrano effetti citopatici, causando la loro morte e il distacco dal microelettrodo d'oro, che a sua volta riduce l'impedenza.

Saggio cellulare basato sull'impedenza per misurare la molteplicità dell'infezione da virus influenzale

Il video mostra un test per quantificare i virus influenzali A e B. Questo test utilizza l'amplificazione dell'endonucleasi con primer specifici per l'influenza e il rilevamento del bersaglio mediante sonde beacon molecolari.

Un test su base molecolare per la quantificazione dei virus dell'influenza A e B

Integrato chip microfluidica termoplastico è stato sviluppato per l'utilizzo come diagnostica molecolare. Il chip esegue l'estrazione di acido nucleico, la trascrittasi inversa e PCR. Metodi per la fabbricazione e l'esecuzione del chip sono descritti.

Chip Fabrication Microfluidic e metodo per rilevare l&#39;influenza

Utilizzando una strategia di microarray di glicani stampati, è stato miniaturizzato un test convenzionale su piastra a 96 pozzetti per l'analisi dell'avidità e della specificità dell'emoagglutinina del virus dell'influenza A per i recettori contenenti acido sialico.

Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine

Descriviamo un test rapido, molecolare a base di Influenza A e B. Il saggio Influenza rileva ogni bersaglio entro 15 minuti utilizzando l'amplificazione isotermica con primer specifici per l'influenza seguita da rilevamento di target con sonde segnale molecolare. Il saggio e influenza A B è facile da usare e richiede minimi hands-on tempo per eseguire.

Rilevazione rapida molecolare e la differenziazione dei virus influenzali A e B

test high-throughput di DNA e RNA patogeni a base di nanoscala PCR è descritto con un cane sindromica e equini pannello PCR respiratorio.

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Questo studio descrive un   di imaging basata su test di micro-neutralizzazione per analizzare le relazioni antigeniche tra virus. Il protocollo impiega uno scanner piano ed ha quattro fasi, tra cui la titolazione, la titolazione quantificazione, neutralizzazione, e la neutralizzazione quantificazione. Il test funziona bene con corrente circolante pdm09 influenza A (H1N1), A (H3N2), e virus B.

Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay

Descriviamo l'uso di un test di inibizione della neuraminidasi basato sulla fluorescenza fenotipica per valutare la suscettibilità del virus dell'influenza A e B alla classe degli inibitori della neuraminidasi di antivirali.

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

Scopri un metodo ad alto rendimento per rilevare il virus dell'influenza H1N1 nel liquido di lavaggio broncoalveolare di topi infetti. Questa tecnica basata su imaging a infrarossi offre alta sensibilità e richiede piccoli volumi campione.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell'influenza

Esplora altri video