High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell'influenza

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare in modo efficiente i titoli virali dell'influenza nelle vie aeree dei topi infetti. I topi vengono prima inoculati per via intranasale con il virus dell'influenza in un momento selezionato. Punti dopo l'infezione.

Gli M vengono sacrificati e viene raccolto il lavaggio broncoalveolare o il liquido BAL. Successivamente, il fluido BAL viene utilizzato per infettare le cellule MDCK. Le cellule infette possono quindi essere colorate per la presenza di proteine virali utilizzando anticorpi primari specifici, seguiti da anticorpi secondari coniugati all'infrarosso.

I segnali a infrarossi vengono letti utilizzando lo scanner Lycor Odyssey e il software Odyssey può essere utilizzato per determinare i titoli virali. Utilizzando una curva standard, è possibile ottenere la determinazione quantitativa dei titoli virali. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti sono la quantificazione precisa dei titoli virali, la riproducibilità e il piccolo volume necessario per eseguire questo test.

Le implicazioni di questa tecnica possono essere estese alla diagnosi e alla terapia di varie malattie virali respiratorie perché può essere utilizzata per quantificare i titoli virali in campioni clinici Seguendo questa procedura. Altri metodi come la QPCR possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come il numero di copie virali. Durante il tentativo di questa tecnica, è importante ricordare di controllare il virus di controllo standard del titolo dopo questo sviluppo.

Questa tecnica apre la strada al ricercatore nel campo della logica virale per esplorare la proteina virale del titolo virale o della colorazione a torsione in campioni clinici. Una volta padroneggiata questa tecnica, questa tecnica può essere eseguita in 17 ore. Ha eseguito con precisione Infettare i topi per via intranasale con 5.000 unità di piattaforma o PFU di PR otto virus dell'influenza in 30 microlitri di PBS sterile o con PBS da solo come controllo negativo per la raccolta di fluidi BAL da animali soppressi prima, tagliare che la cavità toracica aprire e praticare un'incisione di un centimetro parallela alla trachea per esporla con sottili forbici sterili.

Praticare una piccola incisione nella trachea, infondere la trachea con 0,5 millilitri di BSA all'1% contenente PBS e aspirare delicatamente il liquido di lavaggio. Conservare i liquidi BAL a una temperatura negativa di 20 gradi centigradi per quantificare i titoli virali nei liquidi di lavaggio. Per prima cosa, coltura di 5 milioni di cellule MDCK in 20 millilitri di RPMI completo in una fiaschetta T 75 per una notte a 37 gradi centigradi il giorno successivo, raccolta delle cellule e piastra in una piastra ottica nera a fondo piatto a 96 pozzetti a 10.000 cellule per pozzetto.

Quindi incubare la piastra per una notte a 37 gradi centigradi dopo l'incubazione. Aspirare delicatamente il surnatante e lavare le cellule due volte in DMEM completo ma privo di siero contenente lo 0,2% di BSA invece di FBS. Una volta lavate le cellule, aggiungere 50 microlitri di fluido BAL o 50 microlitri di una sospensione contenente una concentrazione nota di virus per pozzetto.

Quindi aggiungere 50 microlitri per pozzetto di DMEM, terreno contenente tripsina trattata con TPCK a 0,2 microgrammi per millilitro per migliorare l'attaccamento, l'ingresso e la replicazione virale. Incubare le cellule per un'ora a 37 gradi centigradi per consentire al virus di assorbirsi. Quindi aggiungere 100 microlitri di FBS contenente RPMI completo a ciascun pozzetto, coltivare le cellule durante la notte per consentire all'infezione di propagarsi dopo l'incubazione notturna.

Lavare le cellule con 100 microlitri di 1%B-S-A-P-B-S. Una volta lavate le cellule, aggiungere 100 microlitri per pozzetto di para formaldeide all'1% e incubare le piastre per cinque minuti a temperatura ambiente per fissare le cellule Successivamente lavare con 100 microlitri per pozzetto di 1% B-S-A-P-B-S e incubare le cellule per altri 30 minuti per il blocco. Una volta che le cellule sono state bloccate, aggiungere 50 microlitri per pozzetto di anticorpo primario antivirale M 2 diluito a 1 a 1000 e incubare le piastre per un'ora a temperatura ambiente per colorare qualsiasi proteina virale presente dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte in 1%B-S-A-P-B-S e incubarle con 100 microlitri per pozzetto di anticorpo secondario coniugato con colorante a infrarossi a una diluizione da uno a 200 per un'ora a temperatura ambiente Al buio una volta che le cellule sono colorate, lavatele tre volte come in precedenza.

Posizionare quindi le piastre sulla piattaforma del vetro di lettura dello scanner a infrarossi Licor Odyssey. Selezionare l'impostazione della piastra a 96 pozzetti sul lettore utilizzando il software Licor Odyssey. Identificare i pozzetti di controllo negativi in bianco, quindi quantificare la fluorescenza dall'intera piastra.

Utilizza lo strumento forma automatica per disegnare l'area di interesse o il ROI nel mezzo di un test. Bene utilizzare il ROI da un controllo negativo. Bene, per impostare il valore di fluorescenza di base per il saggio, quindi introduci i due mirini opposti forniti dal software Odyssey all'interno del ROI per misurare l'intensità della fluorescenza attraverso il pozzetto.

Quindi, scansiona la lastra utilizzando il canale a 780 nanometri per il rilevamento e 680 nanometri come lunghezza d'onda di riferimento. Una volta attivato il comando di lettura, verranno misurate le intensità fluorescenti a intervalli uniformi della ROI. E poi i punti dati raccolti sono stati integrati.

Un moltiplicatore di deviazione standard determinerà il livello di segnale rispetto alla linea di base inclusa nel ROI, assicurati di selezionare l'opzione di intensità integrata per i calcoli poiché rappresenta il volume netto di pixel per aree definite indipendentemente dalle dimensioni. La fluorescenza di fondo sarà quantificata dai controlli infetti simulati e sarà utilizzata per stimare l'intensità integrata nei pozzetti di prova. La fluorescenza infrarossa proveniente da pozzetti duplicati contenenti diluizioni seriali di virus titolato viene utilizzata per costruire una curva standard.

La curva standard può quindi essere utilizzata per determinare i titoli di fluido BAL da topi infetti. In questo esperimento, è stato osservato un aumento significativo della carica virale al secondo e al quarto giorno. Il virus post-infezione è stato eliminato entro il giorno 10, come mostrato qui.

I titoli virali misurati con questo test sono ben correlati con la perdita di peso del topo dopo l'infezione. Questa tecnica può essere applicata anche a campioni umani. Qui è mostrata una quantificazione del virus H one N one da un tampone nasale umano.

Il limite di rilevabilità è di 10 alla terza dose infettiva di TCID o coltura tissutale. Dopo aver visto questo video, hai anche una buona comprensione di come stimare il titolo del virus dell'influenza utilizzando il test basato su die a infrarossi. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale perché l'uso dell'imager corp può essere difficile e questo aiuterà a semplificare e dimostrare i nostri metodi per quantificare i titoli virali in una piastra da 96 o 384 pozzetti.

E infine, non dimenticare che lavorare con i virus può essere estremamente pericoloso e che i precursori come i dispositivi di protezione individuale devono sempre essere assunti durante l'esecuzione di questa procedura.