High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell'influenza

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare in modo efficiente i titoli virali dell'influenza nelle vie aeree di topi infetti. I topi vengono innanzitutto inoculati per via intranasale con il virus dell'influenza in momenti selezionati dopo l'infezione.

Gli M vengono sacrificati e viene raccolto il lavaggio broncoalveolare o liquido BAL. Successivamente, il liquido BAL viene utilizzato per infettare cellule MDCK. Le cellule infette possono quindi essere colorate per rilevare la presenza di proteine virali mediante anticorpi primari specifici, seguiti da anticorpi secondari coniugati con infrarosso.

I segnali infrarossi vengono rilevati utilizzando lo scanner Lycor Odyssey e il software Odyssey può essere impiegato per determinare i titoli virali. Mediante una curva standard, è possibile ottenere una determinazione quantitativa dei titoli virali. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti sono la quantificazione precisa dei titoli virali, la riproducibilità e il piccolo volume necessario per eseguire il saggio.

Le implicazioni di questa tecnica possono essere estese alla diagnosi e alla terapia di varie malattie virali respiratorie, poiché può essere utilizzata per quantificare i titoli virali in campioni clinici seguendo questa procedura. Altri metodi, come la QPCR, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, come il numero di copie virali. Nel tentativo di applicare questa tecnica, è importante ricordare di verificare il virus di controllo del titolo standard dopo questo sviluppo.

Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della logica virale per esplorare il titolo virale o colorare le proteine virali in campioni clinici. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 17 ore. Infettare con precisione i topi per via intranasale con 5.000 unità formanti placche o PFU del virus dell'influenza PR8 in 30 microlitri di PBS sterile o con PBS da solo come controllo negativo per la raccolta del liquido BAL da animali sacrificati; innanzitutto, aprire la cavità toracica e praticare un'incisione di un centimetro parallela alla trachea per esporla con pinzette sterili fini.

Eseguire una piccola incisione nella trachea, infondere la trachea con 0,5 millilitri di PBS contenente l'1% di BSA ed aspirare delicatamente il liquido di lavaggio. Conservare i fluidi di BAL a meno 20 gradi centigradi per quantificare i titoli virali nei fluidi di lavaggio. Il giorno successivo, coltivare prima 5 milioni di cellule MDCK in 20 millilitri di RPMI completo in un’aliquota T75 durante la notte a 37 gradi centigradi, raccogliere le cellule e seminarle in una piastra nera a 96 pozzetti con fondo ottico piatto a 10.000 cellule per pozzetto.

Quindi incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi centigradi dopo l'incubazione. Aspirare delicatamente il soprannatante e lavare le cellule due volte in DMEM completo ma privo di siero, contenente lo 0,2% di BSA al posto di FBS. Dopo aver lavato le cellule, aggiungere 50 microlitri di liquido BAL o 50 microlitri di una sospensione contenente una concentrazione nota di virus per pozzetto.

Quindi aggiungere 50 microlitri per pozzetto di DMEM, un mezzo contenente tripsina trattata con TPCK a 0,2 microgrammi per millilitro, per potenziare l'attacco, l'ingresso e la replicazione virale. Incubare le cellule per un'ora a 37 gradi centigradi per consentire l'assorbimento del virus. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di RPMI completo contenente FBS in ogni pozzetto e coltivare le cellule durante la notte per permettere la propagazione dell'infezione dopo l'incubazione notturna.

Lavare le cellule con 100 microlitri di PBS al 1% contenente BSA. Una volta lavate le cellule, aggiungere 100 microlitri per pozzetto di paraformaldeide al 1% e incubare le piastre per cinque minuti a temperatura ambiente per fissare le cellule. Successivamente, lavare con 100 microlitri per pozzetto di PBS al 1% contenente BSA e incubare le cellule per ulteriori 30 minuti per il blocco. Una volta bloccate le cellule, aggiungere 50 microlitri per pozzetto di anticorpo primario anti-virale M2 diluito 1:1000 e incubare le piastre per un'ora a temperatura ambiente per rivelare eventuali proteine virali presenti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte in PBS al 1% contenente BSA e incubarle con 100 microlitri per pozzetto di anticorpo secondario coniugato con colorante infrarosso, diluito 1:200, per un'ora a temperatura ambiente al buio. Una volta colorate le cellule, lavarle tre volte come precedentemente descritto.

Posizionare quindi le piastre sulla piattaforma di lettura del lettore infrarosso Licor Odyssey. Selezionare l'impostazione per piastra a 96 pozzetti sul lettore utilizzando il software Licor Odyssey. Identificare i pozzetti di controllo negativo vuoti, quindi quantificare la fluorescenza proveniente dall'intera piastra.

Utilizzare lo strumento forma automatica per disegnare la regione di interesse o ROI al centro di un test. Useremo la ROI di un controllo negativo, al fine di stabilire il valore di fluorescenza di base per il saggio, quindi introdurre i due assi incrociati opposti forniti dal software Odyssey all'interno della ROI per misurare l'intensità della fluorescenza attraverso il pozzetto.

Successivamente, scansionare la piastra utilizzando il canale a 780 nanometri per il rilevamento e quello a 680 nanometri come lunghezza d'onda di riferimento. Una volta attivato il comando di lettura, verranno misurate le intensità fluorescenti a intervalli uniformi della regione di interesse (ROI). Quindi, i punti dati raccolti verranno integrati.

Un moltiplicatore della deviazione standard determinerà il livello di segnale rispetto al valore di base che viene incluso nell'area di interesse; assicurarsi di selezionare l'opzione intensità integrata per i calcoli, poiché rappresenta il volume netto dei pixel per aree definite indipendentemente dalla dimensione. La fluorescenza di fondo verrà quantificata partendo dai controlli con infezione fittizia e verrà utilizzata per stimare l'intensità integrata nelle pozzette di prova. La fluorescenza nell'infrarosso proveniente da pozzette duplicate contenenti diluizioni seriali di virus titolato viene utilizzata per costruire una curva standard.

La curva standard può quindi essere utilizzata per determinare i titoli del liquido BAL proveniente da topi infetti. In questo esperimento, è stato osservato un aumento significativo del carico virale al secondo e al quarto giorno. Il virus è stato eliminato entro il giorno 10 successivo all'infezione, come mostrato qui.

I titoli virali misurati utilizzando questo saggio mostrano una buona correlazione con la perdita di peso nei topi dopo l'infezione. Questa tecnica può essere applicata anche a campioni umani. Qui viene mostrata una quantificazione del virus H1N1 da un tampone nasale umano.

Il limite di rilevamento qui è di 10 alla terza TCID, o dose infettiva per coltura tissutale. Dopo aver visto questo video, si avrà anche una buona comprensione di come stimare il titolo del virus dell'influenza mediante saggio basato su colorante infrarosso. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale perché l'utilizzo del lettore a immagini può risultare difficoltoso, e ciò contribuirà a semplificare e illustrare i nostri metodi per la quantificazione dei titoli virali in una piastra da 96 o 384 pozzetti.

E infine, non dimenticare che lavorare con virus può essere estremamente pericoloso e precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.