Modelli per MAME 4D Live-Imaging cellule di tumore: Interazioni microambiente che Impact progressione maligna

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire modelli 3D di co-coltura denominati architettura mammaria e ingegneria del microambiente, o MAM, per l'uso nell'imaging di cellule vive di interazioni cellulari in tempo reale. Ciò si ottiene rivestendo prima i vetrini di copertura con un fibroblasto D spento o uno di collagene DQ. Collagene a matrice unica.

Successivo D collagene spento. Quattro. La matrice della membrana basale ricostituita viene aggiunta sopra quella di collagene DQ solidificato, la matrice di collagene uno con fibroblasti incorporati. Nella terza fase, una sospensione epiteliale o di cellule tumorali viene stratificata sopra i vetrini coprioggetti, consentendo alle cellule di attaccarsi al collagene DQ, alla matrice di quattro membrane basali ricostituite, e quindi viene aggiunto il terreno.

Infine, la microscopia confocale viene utilizzata per eseguire l'imaging a quattro D, che analizza un'immagine in tre dimensioni spaziali, più il tempo delle colture mam co dal vivo. In definitiva, l'imaging a quattro D consente la visualizzazione e l'analisi dell'interazione dinamica tra le cellule tumorali della mammella e altre cellule del microambiente tumorale che possono influire sulla progressione verso un fenotipo invasivo. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'imaging intravitale, è che le interazioni osservate nel nostro modello sono tra cellule di una specie, cioè cellule tumorali umane e cellule tumorali umane associate, piuttosto che, ad esempio, tra cellule tumorali umane e cellule stromali di topo.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché l'assemblaggio delle principali culture di base deve prima essere visualizzato e poi richiede abilità moderate e pratica per il successo. Inizia posizionando una copertura di plastica rettangolare sterilizzata con alcol. Infilalo in un piatto di coltura da 35 millimetri o usa un albero IBI, piatto mu da 35 millimetri.

Quindi mescolare il numero desiderato di fibroblasti con il collagene DQ. Successivamente, utilizzando un micropipettatore da 100 microlitri, pipettare con cura e distribuire 70 microlitri di collagene DQ di fibroblasti, una matrice di collagene su tutta la superficie del vetrino coprioggetti e posizionare il piatto di coltura nell'incubatore umidificato a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica per 30 minuti. Dopo che le matrici si sono solidificate, lasciare equilibrare per 10 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Quindi posizionare il piatto sotto una cappa fino a quando non raggiunge la temperatura ambiente. Aggiungere 60 microlitri di collagene DQ, quattro matrici di membrana basale ricostituite sopra il collagene DQ solidificato, una matrice di collagene con fibroblasti incorporati. Quindi, utilizzando una punta per pipetta, distribuire con cura la matrice della membrana basale ricostituita DQ collagen four in modo uniforme, evitando di graffiare i fibroblasti: DQ collagen one, collagen one matrix.

Quindi trasferire il piatto e il vetrino di copertura nell'incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 10 minuti, mentre la matrice della membrana basale ricostituita DQ collagen four sta solidificando gli occhi della tripsina e contando le cellule per la co-coltura. Ora posiziona 50 microlitri di sospensione cellulare sul vetrino coprioggetti rivestito e posiziona il piatto in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 40-60 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi al collagene DQ. Quattro, ricostituire una matrice di membrana basale dopo che le cellule si sono attaccate alla matrice, aggiungere due millilitri di terreno di coltura contenente il 2% di membrana basale ricostituita al piatto da 35 millimetri.

Quindi incubare per il periodo di tempo desiderato prima dell'imaging dopo il lavaggio con PBS, incubare le cocolture con cinque micromolari di cellule tracker arancioni in terreno MEGM in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica per 45 minuti dopo l'incubazione, lavare nuovamente le cocolture con PBS e incubarle con terreno MEGM preriscaldato per 30 minuti in un'immagine dell'incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica. Le cocolture vivono a basso ingrandimento. Ad esempio, a 10 x con una lente per immersione in acqua su un microscopio confocale, catturare sezioni ottiche a intervalli di 10 micron per l'intera profondità delle strutture.

Utilizza le sezioni ottiche per ricostruire le immagini in 3D utilizzando un software di velocità o un programma simile. Realizza filmati delle ricostruzioni 3D in modo che le strutture, le interazioni tra cellule cellulari e le interazioni con la matrice circostante possano essere visualizzate. In questo diagramma schematico rappresentativo di una co-coltura di mutilazione, un piatto di trattamento IBI mu è stato prima rivestito con collagene, uno contenente collagene DQ, uno in fibroblasti come si vede qui in magenta.

Quindi è stato aggiunto un secondo strato di membrana basale ricostituita contenente collagene DQ quattro. Successivamente, le cellule tumorali in rosso sono state piastrate sulla parte superiore e la membrana basale ricostituita al 2%. Nella cultura.

I media rappresentati dai punti color crema venivano sovrapposti ad ogni cambio di media. I prodotti fluorescenti di scissione del collagene DQ uno e quattro sono rappresentati in verde. Nel corso dei 23 giorni di questo MCF 10 DCIS rappresentativo e della cocoltura WS 12 TI, c'è stata una proliferazione delle cellule qui ritratte e nelle figure seguenti, in rosso, così come la degradazione del collagene DQ quattro e uno osservati qui, e nelle figure seguenti, matrici verdi e collagene, come indicato dalla riduzione del volume delle co-colture.

Le stesse cocolture vive sono state osservate nei 23 giorni con immagini catturate dalla microscopia confocale al terzo, 16° e 23° giorno di co-coltura. Le interazioni nelle culture Mame co sono dinamiche e possono cambiare nel tempo. Ad esempio, come si vede in questo modello 3D della mam cellulare, co-coltura il terzo giorno, le cellule stanno appena iniziando a proliferare nelle matrici in questo momento, ancora abbastanza stabili come evidenziato dalla mancanza di fluorescenza verde.

Tuttavia, entro il giorno 16, poiché le cellule hanno continuato a proliferare, hanno anche iniziato a degradare la struttura della matrice come osservato qui dal collagene DQ, uno e quattro prodotti di scissione in verde, e la rottura attiva della matrice da parte delle cellule in cui la matrice e le cellule sono fluorescenti come osservato in giallo. Al giorno 23, quasi la metà della matrice è stata degradata dalle cellule in rapida proliferazione rispetto al terzo giorno, quando il volume di co-coltura era di 110.000 micrometri cubi. Dal giorno 16 al 23, il volume è stato ridotto a soli 46.250 micrometri cubi in questo giorno.

16, si possono osservare la proteolisi del collagene DQ quattro sulla superficie delle cellule DCIS in rosso e la proteolisi diffusa del collagene DQ, uno nelle aree vicine ai fibroblasti in bianco. La colorazione differenziale utilizzata in questa co-coltura consente anche di osservare i distinti modelli di migrazione e proliferazione dei due tipi di cellule dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del cancro al seno per esplorare gli effetti del macroambiente tumorale sulla progressione del cancro, perdendo l'imaging delle cellule vive delle interazioni dinamiche tra le cellule tumorali e le cellule stromali circostanti.