Preparazione individuale Drosophila Egg Chambers per l'imaging dal vivo

Lo scopo del seguente esperimento è registrare i processi dinamici nei siti U di drosophile vive. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto ovari integri da femmine ben nutrite di due giorni. Come secondo passaggio, singoli filamenti vengono estratti dagli ovari per acquisire immagini delle camere ovariche.

Successivamente, se esprimono una proteina fluorescente appropriata, singole camere ovariche possono essere analizzate direttamente oppure sottoposte a ulteriori manipolazioni, come la microiniezione di marcatori fluorescenti prima dell'analisi. Infine, attraverso l'analisi delle sequenze video, è possibile rivelare l'interazione dinamica dei componenti intracellulari. Questo metodo ci ha aiutato a rispondere ad alcune domande fondamentali nel campo del trasporto dell'RNA e della traduzione localizzata.

Ad esempio, come viene regolata nel tempo e nello spazio l'espressione delle proteine che definiscono il piano corporeo nell'organismo vivente? In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà poiché è richiesta una notevole rapidità e destrezza. Solo con la pratica si otterranno risultati migliori.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le manipolazioni delle camere ovariche sono difficili da descrivere a parole e richiedono competenza tecnica e mano ferma. Iniziare la procedura ponendo una piccola goccia di olio al carburo di alogeno su un coprioggetto e metterla da parte. Quindi anestetizzare le mosche preparate con anidride carbonica.

Usare una pinzetta fine e affilata per afferrare una femmina grassa all'estremità anteriore dell'addome. Non afferrare al centro dell'addome. Tenere la femmina a circa due o tre centimetri sopra il vetrino preparato.

Utilizzando una seconda coppia di pinzette, rimuovere il tessuto all'estremità posteriore estrema della femmina. Questo di solito include tessuti intestinali, usando pinzette pulite. Massaggiare delicatamente l'addome dall'estremità anteriore a quella posteriore, come se si spremesse il dentifricio da un tubetto.

Le ovaie appaiono come strutture opache di grandi dimensioni e aderiranno alla punta della pinzetta. Raccogliere le ovaie toccandole con l'olio di carbonio in rilievo sul vetrino. Ripetere quindi il procedimento fino a quando non vengono raccolte quattro-sei ovaie.

Prima di isolare le parti aeree, regolare la sorgente luminosa del microscopio in modo che l'illuminazione colpisca il vetrino con un angolo ridotto, creando ombre contrastanti sui tessuti. Durante la dissezione delle mosche, è molto importante utilizzare gli strumenti adatti.

Il puntatore che utilizziamo non è troppo appuntito in modo da non danneggiare il tessuto, ma abbastanza smussato da permetterci di afferrare le pinzette che usiamo. Ancora una volta, non troppo appuntite per evitare di danneggiare i tessuti, ma sufficientemente sottili da consentirci di manipolare gli oggetti senza piegare lo strumento. È inoltre molto importante avere strumenti puliti, quindi li puliamo regolarmente durante tutta la procedura con le pinzette chiuse.

Separare le due ovaie rimuovendo il tessuto connettivo all'estremità posteriore. L'estremità posteriore contiene le camere ovariche più mature. Orientare un'ovaia in orizzontale con le camere ovariche più giovani rivolte verso la mano dominante.

Quindi afferrare delicatamente l'estremità posteriore tramite il tessuto connettivo residuo e utilizzare un ago da dissezione o al tungsteno per estrarre le singole camere ovariche. Le camere ovariche individuali, dallo stadio Jamar allo stadio 10, si separeranno l'una dall'altra, mentre quelle più mature rimarranno attaccate all'ovaio. Con la sonda, trascinare con attenzione 15-25 camere ovariche separate al centro della goccia d'olio. Se è necessario dissezionare più di un ovaio, sceglierne uno proveniente da una diversa mosca.

Eliminare qualsiasi tessuto ovarico in eccesso e procedere rapidamente poiché le cellule inizieranno a mostrare cambiamenti fenotipici dovuti allo stress. Dopo 40 minuti dal distacco dall'ovaio, rimuovere il tessuto ovarico in eccesso dall'olio utilizzando strumenti puliti per l'iniezione di cellule a stadio intermedio, orientando gli aghi perpendicolarmente all'asse lungo del vetrino. Per isolare camere ovariche a stadio avanzato.

È richiesto un metodo diverso per afferrare la parte posteriore dell'ovaio, come descritto in precedenza. Introdurre la sonda dissezionatrice nell'estremità posteriore dell'ovaio, vicino alla pinzetta. Per evitare di perforare le camere ovariche, inserire la sonda tra le camere ovariche allo stadio avanzato.

Estrarre l'ago da dissezione attraverso l'ovaio fino a quando non esce nei camere ovariche in stadio precoce. Se eseguito correttamente, la sonda rimuoverà il tessuto connettivo che trattiene le ariele e le camere ovariche in stadio avanzato. Ripetere questo passaggio fino a quando le ariele non sono ben distese sul vetrino coprioggetto.

Quando le camere ovariche non sono più sovrapposte l'una sull'altra, questo passaggio è completato. Utilizzando una sonda da dissezione, separare le camere ovariche dello stadio avanzato per facilitare l'acquisizione delle immagini, posizionando lo stadio 14. Per le camere del collo, utilizzare pinzette per afferrare i loro appendici dorsali.

Preparare le soluzioni da iniettare centrifugando brevemente il campione ad alta velocità. Questo passaggio formerà un precipitato di eventuali depositi solidi che potrebbero ostruire l'ago di iniezione. Quindi caricare l'ago di iniezione utilizzando una punta di carico e fissare con attenzione l'ago di iniezione carico all'injector.

Ora posizionare un piccolo pezzo di vetro adiacente ai campioni e montare il vetrino sul palchetto del microscopio. Il vetro fungerà da parete per interrompere o disfare. Scollegare l'ago.

Preparare il microscopio e l'apparato di iniezione per l'esperimento. Avere cura di non rompere la punta dell'ago. Se possibile, utilizzare un portapreparati automatizzato dotato di funzionalità di visita dei punti per marcare tutte le cellule allo stadio otto e allo stadio nove da iniettare.

Ora, abbassare l'ago di iniezione fino a quando non tocca l'olio. Selezionare il primo punto nell'elenco dei punti marcati e mettere a fuoco il citoplasma. Abbassare manualmente l'ago fino a quando non si trova nello stesso piano di messa a fuoco del citoplasma.

Utilizzando i comandi del manipolatore, spostare la punta dell'ago di iniezione fino a posizionarla all'interno del sito U. Un movimento rapido e pungente è spesso più efficace di uno lento. Una volta all'interno, espellere un piccolo volume dall'ago e valutare visivamente gli effetti.

È richiesta una ripetizione. Se l'iniezione ha successo, il citoplasma all'interno della cellula verrà spostato. La quantità esatta di fluido iniettato è difficile da quantificare.

Per aumentare il volume iniettato, regolare la pressione o la durata dell'impulso di iniezione. Spezzare la punta dell'ago per aumentare leggermente l'apertura, oppure utilizzare semplicemente più impulsi di iniezione prima di selezionare il successivo mark.Cyte. Sollevare l'ago di iniezione abbastanza in alto nell'olio in modo che non urti contro altri cytes.

Pungere eccessivamente o trattenere a lungo l'ago all'interno della cellula danneggia gravemente la camera dell'uovo. Pertanto, agire rapidamente. L'iniezione deve richiedere meno di 10 secondi.

Se si commette un errore, passare al segno successivo in un sito. Non perdere tempo su un punto danneggiato alla vista. Quando l'ago si ottura, spostare l'ago sulla scheggia di vetro rotto.

Con il vetro e l'ago nello stesso piano focale, spingere delicatamente l'ago contro il vetro. Verificare che l'ago non sia ostruito premendo il pulsante di iniezione e osservando se fuoriesce del liquido dalla punta dell'ago. Una volta iniettati tutti i siti US, spostare manualmente l'ago dall'olio e posizionarlo fuori dal percorso del fascio del microscopio.

Assicurarsi che sia in un'orientazione sicura per evitare danni agli occhi e spegnere le luci. Per facilitare l'acquisizione di immagini in fluorescenza, la velocità è fondamentale. Se è trascorso un'ora o più tra l'isolamento della camera ovariaca e l'iniezione delle cellule, queste risulteranno difficili da iniettare ed esprimeranno cambiamenti fenotipici associati allo stress.

Possono sorgere problemi simili a causa di un manipolazione troppo brusca della cellula o dell'iniezione di volumi eccessivi. Le camere embrionali che esprimono proteine fluorescenti transgeniche possono essere osservate senza la necessità di iniezione. L'etichettatura MS2 dell'RNA endogeno può essere visualizzata con buoni risultati utilizzando le procedure di isolamento dei tessuti secondo il protocollo completo sintetizzato in vitro.

Un RNA Alexa, 5 46 kin, è stato iniettato in una camera dell'ovaio ME 31 BGFP; l'RNA si è localizzato nella regione anteriore dorsale della citocellula e ha formato un cappuccio attorno al nucleo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 10 minuti, dal momento della dissezione fino all'inizio dell'acquisizione delle immagini. Durante il tentativo di questa procedura, è necessario prestare attenzione al tessuto lavorando rapidamente ma con cautela. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come registrare processi dinamici in citocellule vive di Drosophila.