Name: Ibridazione In situ Delle ghiandole salivari, ovaie, e gli embrioni di Vector zanzare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Scopri l'ibridazione in situ per l'analisi dell'espressione genica nelle zanzare. Questo metodo consente di visualizzare la localizzazione degli mRNA in tessuti come ghiandole salivari, ovaie ed embrioni.

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Gli autori desiderano ringraziare Marika Walters per la consulenza in ibridazione in situ lo sviluppo di metodi per i tessuti molli e Goltsev Yury per la discussione di protocolli per l&#39;ibridazione in situ su embrioni Anopheles gambiae, che sono stati successivamente adattati e modificati per sviluppare il protocollo descritto qui per ibridazione in situ di Aedes e di embrioni Culex. Riconosciamo anche utili raccomandazioni fornite da Adam e David Paré Kosman. Ringraziamo Osvaldo Marinotti per la discussione scientifica e la modifica del testo del protocollo.

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</ol>

Gli autori non hanno informativa.

L&#39;ibridazione in situ protocollo di colorazione e colorimetrico qui presentati per intero montaggio tessuti zanzare ed embrioni è una tecnica utile per la localizzazione di organi specifici entro trascritti e tipi di cellule. Queste procedure sono un miglioramento rispetto i nostri metodi precedentemente riportati, sia nel razionalizzare le fasi di lavaggio ampi e fornire ulteriori dettagli tecnici e le fonti dei reagenti. Nella nostra esperienza, la rilevazione colorimetrica dei segnali di ibridazione è superiore in sensibilità e la chiarezza del segnale di ibridazione rispetto a fluorescenza a base di schemi di rilevazione. Inoltre rilevamento colorimetrico elude le questioni connesse con la discriminazione del segnale in embrioni, che sono intrinsecamente auto-fluorescente. Limitazioni di rilevare segnali di ibridazione si verificano, quando a bassa abbondanza trascrizioni sono mirate e colorazione di fondo è evidente. Aumentando la temperatura di ibridazione a 65 ° C è stato trovato per ridurre indietroterra segnali di ibridazione, ma non è un sostituto suggerito per la progettazione di destinazione univoco sonde specifiche RNA. Questo protocollo è stato utilizzato per eseguire ibridazione in situ whole-mount di ghiandole salivari di Aedes aegypti, e ovaie ed embrioni di Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti e Culex quinquefasciatus. Questo metodo è applicabile anche ad altri tessuti zanzara, e presumibilmente quelli di altri insetti. Inoltre, abbiamo compilato per la prima volta le linee guida di confronto per la messa in scena dello sviluppo embrionale in tre zanzare vettore, Ae. aegypti, An. gambiae e Cx. fatigans. Le osservazioni sono state riportate per i ceppi specifici di queste tre specie di allevamento, in condizioni discrete. È importante notare che il decorso di tempo di sviluppo può variare per i diversi ceppi di specie di zanzara e in diverse condizioni di allevamento. Ibridazioni in situ supplemento in corso sforzi per anaLyze le trascrittomi di zanzare ed altri artropodi, e può fornire un quadro migliore della regolazione dell&#39;espressione genica in questi organismi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH8.0 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> Provette per microcentrifuga da 1,5 ml </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Meno opaco di tubi standard; aiuti a visualizzare campioni </td></tr><tr><td> Formammide deionizzata </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Conservazione a 4 ° C </td></tr><tr><td> DEPC acqua </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinasi K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> Ipoclorito di sodio 5,25% </td><td> Austin </td><td></td><td> A-1 Marca </td></tr><tr><td> RNA polimerasi T3-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> Conservazione a -20 ° C </td></tr><tr><td> T7 RNA polimerasi </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> Conservazione a -20 ° C </td></tr><tr><td> 95% etanolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> FISHERBRAND usa e getta in polietilene pipette di trasferimento </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37% formaldeide </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC-grade metanolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesio cloruro </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio copertura in vetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td> 18 x18 millimetri </td></tr><tr><td> N-eptano </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-xilene </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex 9-Spot e piastra </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 millimetri </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> Idrossido di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost / Plus vetrini </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 millimetro </td></tr><tr><td> Davlyn Rosso trasparente-liner Toupee tape </td><td> Capelli diretta </td><td> RED-75R12 </td><td> Poly / base materiale della pelle in 0,75 x 12 rotolo di nastro m </td></tr><tr><td> Kit per la clonazione TOPOTA Sequening con un solo colpo Top10 chimicamente competenti E. coli </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 reazioni 40 reazioni </td></tr><tr><td> Sonicato salmone DNA degli spermatozoi </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> Conservazione a -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digossigenina-AP frammenti Fab </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1093274 </td><td> Conservazione a 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG RNA etichettatura mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073 </td><td> Conservazione a -20 ° C </td></tr><tr><td> NBT / BCIP soluzione stock </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1681451 </td><td> Conservazione a 4 ° C </td></tr><tr><td> Occidentale Reagente Bloccante </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11921673001 </td><td> Conservazione a 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech poliestere mesh (330,130) </td><td> Saati Print </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 fili / cm, diametro della filettatura 34 micron, colore arancio </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma </td><td> G6279-1 </td><td> 70% in PBT </td></tr><tr><td> Sale di sodio eparina </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37% formaldeide </td><td> Ted Pella </td><td> 18508 </td><td> Aliquote da 10 ml in fiale color ambra </td></tr><tr><td> 16 once Contenitori di carta Solo con coperchi </td><td> Il Paper Company </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro borosilicato scintillatfiala di ioni con tappo a vite senza legami </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 20 ml di 500 caso </td></tr><tr><td> Sealed Air Bubble Wrap celluar materiale ammortizzante </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> 10 piedi / roll 0,188 pollici di spessore </td></tr><tr><td> Siero di pollo </td><td></td><td></td><td> Il sangue intero è stato raccolto dalla vena o ala o mediante puntura cardiaca da un pollo giovanile. Il sangue è stato incubato a 37 ° C per 1 h fino coagulata e poi poste su ghiaccio per 30 min. Il siero è stato raccolto e centrifugato a 3000 xg per 10 min. Il supernatante risultante (chiarificato siero) è stato raccolto e conservato a -20 ° C fino all&#39;uso. </td></tr></tbody></table> Tabella 4. Tabella dei reagenti e attrezzature specifiche per l&#39;ibridazione in situ.

ibridazione<em&gt; in situ</em&gt; delle ghiandole salivari, ovaie, e gli embrioni di vector zanzare

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Le zanzare sono vettori di un insieme diversificato di agenti patogeni tra cui arbovirus, parassiti protozoi e nematodi. Indagine su trascrizioni e regolatori genici, che si espresse in tessuti in cui l&#39;host zanzara e interagiscono patogeno, e in organi coinvolti nella riproduzione di grande interesse per le strategie per ridurre trasmessa dalle zanzare trasmissione della malattia e interrompere lo sviluppo delle uova. Un certo numero di strumenti sono stati impiegati per studiare e convalidare la regolazione temporale e tessuto-specifica dell&#39;espressione genica. Qui, descriviamo protocolli che sono stati sviluppati per ottenere informazioni spaziali, che aumenta la nostra comprensione di geni specifici in cui sono espressi e loro prodotti accumulano. Il protocollo descritto è stato usato per convalidare espressione e determinare i modelli di accumulo di trascritti in tessuti correlate a dalle zanzare trasmissione del patogeno, come femmina ghiandole salivari, nonché compartimenti subcellulari di ovaie e embrioni, che ritardi per la riproduzione della zanzara e dello sviluppo. Le procedure che seguono rappresentano un metodo ottimizzato che migliora l&#39;efficienza di vari passaggi del protocollo senza perdita di bersaglio-specifici segnali di ibridazione. Linee guida per la preparazione sonda di RNA, la dissezione dei tessuti molli e procedura generale per la fissazione e l&#39;ibridazione sono descritte nella parte A, mentre i passi specifici per la raccolta, fissazione, pre-ibridazione e ibridazione di embrioni zanzare sono dettagliati nella Parte B.

Temporali e spaziali analisi di espressione genica hanno un ruolo cruciale nella genomica funzionale. Whole-mount ibridazione<em&gt; In situ</em&gt; È utile per determinare la localizzazione dei trascritti all&#39;interno dei tessuti e compartimenti subcellulari. Qui delineare una ibridazione<em&gt; In situ</emProtocollo&gt; con modifiche di tessuti specifici in zanzare.

Ibridazione<em&gt; In situ</em&gt; Delle ghiandole salivari, ovaie, e gli embrioni di Vector zanzare

Le zanzare sono vettori per un insieme diversificato di patogeni, tra cui arbovirus, parassiti protozoari e nematodi. L'indagine sui trascritti e sui geni...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è condurre un'ibridazione in C due per determinare i modelli di localizzazione e accumulo di trascritti specifici all'interno dei tessuti e degli embrioni di zanzara. Questo viene ottenuto fissando innanzitutto i tessuti o gli embrioni di zanzara in modo che l'ultrastruttura del tessuto e gli RNA messaggeri bersaglio vengano preservati e resi disponibili per l'ibridazione con sonde a RNA antisenso. Successivamente, le sonde a RNA antisenso vengono ibridate ai trascritti bersaglio all'interno dei tessuti o degli embrioni fissati.Successivamente vengono eseguiti metodi di colorazione con anticorpi colorimetrici per l'RNA messaggero al fine di rilevare i modelli di localizzazione e di accumulo dell'mRNA bersaglio. Si ottengono risultati che mostrano i modelli spaziali di accumulo dell'RNA basati sull'ibridazione in C2 e sui metodi di rivelazione colorimetrica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della genomica funzionale, come determinare quando e dove i prodotti genici si accumulano nel morso.Questa procedura ci permette inoltre di ottenere informazioni sulla localizzazione spaziale, utili per comprendere meglio come l'espressione genica sia regolata in processi biologici come lo sviluppo della riproduzione e le interazioni tra il vettore e i patogeni. Per prepararsi all'ibridazione di sonde di RNA marcate con digossigenina, iniziare dissezionando le ovaie e le ghiandole salivari. Successivamente, fissare il tessuto e trattarlo con proteinasi K, se necessario.Dopo che i tessuti sono stati fissati ulteriormente, equilibrarli in un millilitro di una miscela uno a uno di soluzione di ibridazione PBT o HIB PBT per 30 minuti con mutazione, attendere che il tessuto si depositi, quindi eliminare per decantazione la maggior quantità possibile di HI PBT. Aggiungere quindi un millilitro di HIB in ogni provetta campione. Avvolgere la provetta campione in un imballaggio protettivo sigillato contro l'aria, come carta bolle, e posizionarla all'interno di una bottiglia per ibridazione.Sigillare la provetta con un tappo da ibridazione e incubare a 55 gradi Celsius per 30 minuti con rotazione. Dopo aver rimosso la provetta dall'incubatore e aver lasciato sedimentare il tessuto, decantare con attenzione il tampone di pre-ibridizzazione, lasciando 50 microlitri di soluzione nel tubo per evitare la perdita del campione. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di tampone High pre-riscaldato allo stesso campione e posizionarlo in un blocco termico impostato a 55 gradi Celsius; denaturare la sonda RNA precedentemente preparata a 85 gradi Celsius per cinque minuti.Quindi posizionarlo immediatamente sul ghiaccio per cinque minuti. Successivamente, pipettare la sonda RNA nel tubo del campione. La sonda RNA galleggerà sulla superficie della soluzione HI.Mescolare agitando leggermente il tubo. Incubare delicatamente i campioni in un rack fisso per microcentrifuga all'interno di un fornetto di ibridazione a 55 gradi Celsius per 16-24 ore. Dopo il trattamento con RNAsi e la colorazione con anticorpo, come descritto nel protocollo scritto.Montare i campioni di tessuto utilizzando prima una punta da pipetta da 200 microlitri per trasferirli in singole pozzette rotonde di una piastra Pyrex. Rimuovere la maggior quantità possibile di PBT e ricoprire il campione con glicerolo al 70% in acqua. Lasciare che la glicerolo permei il campione a quattro gradi Celsius per tutta la notte.Per preparare i vetrini, iniziare pulendo la superficie del vetrino con salviette Kim. Successivamente, applicare due pezzi di nastro trasparente paralleli tra loro in modo da formare un canale stretto utilizzando un pennello da artista. Prelevare i campioni uno alla volta e posizionarli lungo il canale, orientando ciascun campione nella stessa direzione rispetto agli allineamenti anteriore, posteriore e dorso-ventrale.Dopo aver posizionato ogni campione, utilizzare un batuffolo di carta Kim per assorbire la soluzione di glicerolo in eccesso intorno ai tessuti. È importante rimuovere il glicerolo in eccesso per evitare la formazione di bolle durante la sigillatura dei campioni montati sul vetrino sotto un coprioggetto; posizionare con attenzione un coprioggetto sopra il canale contenente i campioni allineati. Fissare il coprioggetto in modo semi-permanente sul vetrino applicando con delicatezza dello smalto per unghie trasparente agli angoli. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, dispensare lentamente il 70% di glicerolo in una delle estremità del canale per riempire completamente il canale e la zona sotto il coprioggetto in modo permanente.Sigillare i campioni montati applicando lo smalto per unghie lungo tutti e quattro i lati del coprioggetto. Attendere che lo smalto si asciughi completamente prima di acquisire le immagini dei campioni. Dopo aver raccolto gli embrioni da una gabbia contenente 300 femmine adulte di zanzare accoppiate e averli lasciati sviluppare fino alle fasi desiderate, trasferirli dal contenitore di raccolta a un tubo di raccolta con rete in tylene per embrioni degli anni ottanta.Posizionare il tubo di raccolta in un becher riempito con acqua distillata in quantità sufficiente affinché il volume del tubo di raccolta sia riempito a metà. Utilizzare un pennello da artista per staccare gli embrioni dalla maglia di tylene e trasferirli nel tubo di raccolta pieno d'acqua. Per facilitare il distacco degli embrioni, staccare la maglia di tylene dal contenitore di raccolta e piegare con cura la maglia per formare un imbuto, tenendo l'imbuto di maglia con una mano.Utilizzare l'altra mano per spruzzare acqua lungo i lati del imbuto per lavare gli embrioni nel tubo di raccolta. Questo metodo può essere applicato agli embrioni anomali perché privi della sostanza adesiva presente sulla superficie degli embrioni degli anni ottanta, che permette alle uova di aderire a substrati in posizione elevata. Preparare 40 millilitri di soluzione di dissezione e versare la soluzione in una piastra di Petri da 100 millimetri.Aggiungere 50 millilitri di acqua distillata in un becher da 100 millilitri e metterlo da parte. Successivamente, posizionare gli embrioni nella piastra di Petri contenente la soluzione di decolorazione. Utilizzare una pipetta di trasferimento monouso in polietilene per lavare gli embrioni, agitando delicatamente il vial in modo che gli embrioni rimangano immersi e in movimento nella soluzione di decolorazione.La decorticazione è uno dei passaggi più delicati del protocollo, e un'eccessiva prolungata esposizione al trattamento con ipoclorito di sodio degli embrioni di "eighties" impedirà una corretta formazione dell'endo corion. È richiesto un tempo massimo di 35 secondi per la decorticazione degli embrioni di "eighties", mentre 75 secondi sono sufficienti per gli embrioni di "awfully in QX". Utilizzando un microscopio stereoscopico a basso ingrandimento, verificare la decorticazione. Gli embrioni di "eighties" risulteranno privi dell'exo corion a rete e presenteranno soltanto la superficie liscia e levigata del nero endo corion, mentre negli embrioni di "anomaly" si osserverà una diversa conformazione.I galleggianti esocoriacei e le strutture a cresta saranno assenti una volta che gli embrioni saranno ricoperti. Procedere con la fissazione e la rottura dell'endo corion secondo il procedimento descritto nel protocollo scritto. Per rimuovere l'endo corion rotto, posizionare un pezzo di nastro adesivo doppia faccia al centro di una piastra di Petri da tre centimetri utilizzando una punta per pipetta da 200 microlitri con orifizio largo.Trasferire gli embrioni dal metanolo sul nastro adesivo doppio. Attendere uno o due minuti affinché gli embrioni si depositino e aderiscano alla superficie del nastro; eliminare il metanolo in eccesso e lasciare asciugare leggermente la superficie per uno o due minuti. Quindi aggiungere etanolo al 95% nella piastra di Petri per immobilizzare ulteriormente gli embrioni sul nastro; pipettare 600 microlitri di acqua distillata nell'etanolo e mescolare ruotando la piastra.Successivamente, utilizzare un ago da 27,5 collegato a una siringa da un millilitro per rimuovere l'endocorione screpolato. Dopo aver liberato l'embrione bianco dai residui neri dell'endocorione mediante un pennello da artista con punta fine, trasferire immediatamente gli embrioni dal nastro al serbatoio di etanolo della piastra di Petri. Quindi, utilizzando una punta da pipetta da tre millimetri, trasferire gli embrioni in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di etanolo al 100%. Infine, lavare gli embrioni due o tre volte in etanolo al 100% e conservarli in etanolo anidro a meno 20 gradi Celsius.In questa figura, in C, ibridazioni su ghiandole salivari intere di femmine di Aedes aegypti con sonde mRNA specifiche per amilasi 1D7S2 e D7L2 mostrano l'accumulo di questi trascritti rispettivamente nei lobi laterali prossimali, laterali distali e mediale distale. In questo esperimento, campioni interi di tre specie di zanzare sono stati ibridati con sonde mRNA specifiche per i rispettivi trascritti autologhi di Oscar. Qui, in C, è stata effettuata l'ibridazione su embrioni interi di Anopheles gambiae, Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus mediante sonde RNA antisenso dirette contro i rispettivi trascritti autologhi di Oscar nelle diverse zanzare.Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un'esperimento di ibridizzazione in situ in C due per determinare la localizzazione e l'accumulo di trascritti in specifici tessuti o embrioni di zanzara.

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Questa metodologia, che includeva l'alimentazione orale e l'infezione da iniezione intratoracica, potrebbe valutare efficacemente l'influenza delle barriere dell'intestino medio e / o delle ghiandole salivari sull'infezione da arbovirus.

Infezione virale sperimentale nelle zanzare adulte mediante alimentazione orale e microiniezione

Data la loro semplice anatomia, i testicoli Anopheles offrono un buon modello citologico per lo studio della spermatogenesi. Questo protocollo descrive l'ibridazione in situ a fluorescenza intera , una tecnica utilizzata per studiare questo processo biologico, nonché il fenotipo di ceppi transgenici che ospitano mutazioni nei geni coinvolti nella produzione di spermatozoi.

Ibridazione in situ a fluorescenza a montaggio intero per studiare la spermatogenesi nella zanzara Anopheles

L'articolo descrive i metodi e i reagenti necessari per eseguire la reazione a catena di ibridazione RNA a fluorescenza intera in situ (HCR, RNA, WM-FISH) per rivelare informazioni sulla risoluzione spaziale e cellulare dei geni dei recettori chemiosensoriali nell'antenna della zanzara e nel palpo mascellare.

Reazione a catena di ibridazione RNA Fluorescenza a montaggio intero Ibridazione in situ di geni chemiosensoriali nelle appendici olfattive delle zanzare

Le comunità microbiche nelle zanzare sono molto promettenti per le strategie di biocontrollo dei vettori. La maggior parte dei simbionti non sono coltivabili e richiedono analisi metagenomiche. Descriviamo un metodo per sezionare le zanzare femmine e separare le ovaie, l'intestino medio e le ghiandole salivari prevenendo la contaminazione incrociata, facilitando gli studi sul microbioma a livello di organo e migliorando la comprensione dei ruoli dei microrganismi nella biologia delle zanzare.

Dissezione delle ovaie, dell'intestino medio e delle ghiandole salivari delle zanzare per l'analisi del microbioma a livello d'organo

Questo protocollo descrive un semplice nastro adesivo a base di approccio per il campionamento di pomodoro e di altre superfici di prodotti freschi, seguita da una rapida individuazione cellule intere...

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ</emIbridazione> per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

Scopri l'ibridazione in situ per l'analisi dell'espressione genica nelle zanzare. Questo metodo consente di visualizzare la localizzazione degli mRNA in tessuti come ghiandole salivari, ovaie ed embrioni.

Ibridazione

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