Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo

L'obiettivo generale di questa procedura è generare una finestra cranica sottile e stabile sul cervello del topo per consentire ripetute sessioni di imaging senza alterare l'ambiente intracranico. Questo risultato si ottiene innanzitutto fissando un supporto per la testa che permetta di mantenere stabilmente la testa sotto l'apparato di imaging. Successivamente, si riduce con attenzione lo spessore del cranio in una regione della superficie dorsale del cervello e si lucida la superficie con una grana fine.

Quindi coprire la finestra con una piccola goccia di colla cianoacrilica e un vetrino per rinforzare l'apertura. L'ultimo passaggio consiste nel preparare l'animale per l'acquisizione delle immagini mediante microscopio a due fotoni. In definitiva, la microscopia a due fotoni in vivo viene utilizzata per visualizzare strutture fini come arteriole, vene capillari e dendriti neuronali, che possono essere immaginate fino a una profondità di 250 micrometri nella corteccia per periodi di diverse settimane.

Il vantaggio principale di questa tecnica di finestra cranica è che il cranio sovrastante la corteccia rimane intatto. Innanzitutto, si riduce lo spessore del cranio per ottenere una buona trasparenza ottica, quindi si rinforza il cranio con colla di cianocrilato e con un vetrino di copertura. Questo metodo si rivela utile per lo studio di una varietà di topi transgenici fluorescenti negli stati anestetizzati o OIC.

Per iniziare questa procedura, sterilizzare in autoclave gli strumenti chirurgici necessari e anestetizzare un topo di circa tre-sei settimane seguendo i metodi descritti nel manoscritto allegato. Verificare il riflesso mediante pizzicamento delle dita dei piedi per assicurarsi che il topo si trovi nel piano chirurgico di anestesia. Successivamente, fissare il topo in un telaio stereotassico.

Mantenere la temperatura corporea del topo a 37 gradi Celsius. Utilizzare una sonda rettale regolata a feedback e un cuscinetto riscaldante. Applicare un unguento oftalmico agli occhi per mantenerli umidi.

Quindi rasare il cuoio capelluto con il rasoio elettrico piccolo. Successivamente, pulire il cuoio capelluto con Betadine, seguito dall'abbigliatura con alcol isopropilico al 70%. Quindi riscaldare un'aliquote di fluido cerebrospinale artificiale sterile a 37 gradi Celsius sotto un microscopio.

Rimuovere il cuoio capelluto dall'intera superficie dorsale del cranio utilizzando un paio di forbici chirurgiche. Tagliare lateralmente la pelle fino ai margini dei muscoli temporali su entrambi i lati del cranio e posteriormente ai muscoli del collo. Successivamente, utilizzare una lama di bisturi per rimuovere il sottile periostio dalla superficie del cranio.

Quindi asciugare e pulire il cranio. Successivamente, applicare uno strato sottile di colla a base di cianoacrilato sulla superficie del cranio. Lasciare asciugare completamente la colla.

Questo strato di colla è necessario per l'adesione corretta del cemento dentale. Nei passaggi successivi, per la preparazione all'immagine in animali svegli, praticare fori e inserire due viti autofilettanti di dimensione 0 0 0 nella superficie del cranio controlaterale.

Quindi fissare un connettore rigido su misura con due punti di attacco al cranio. Questo riduce notevolmente i gradi di libertà e semplifica la rilocalizzazione dello stesso campo di imaging in studi longitudinali. Una larga barra trasversale offre inoltre ampio spazio per il posizionamento degli elettrodi e la stimolazione della vibrazione.

Successivamente, ricoprire tutta la superficie del cranio, esclusa la posizione della finestra, con uno strato di cemento dentale, assicurandosi che tutti i bordi esposti della pelle siano ricoperti dal cemento. Prima di assottigliare il cranio, verificare che le frese del trapano siano affilate ed evitare di riutilizzarle. Utilizzare un trapano dentale a bassa velocità per assottigliare una regione di due millimetri per due millimetri sulla corteccia somatosensoriale, usando una fresa di un millimetro e mezzo.

Quindi assottigliare la superficie del cranio secco per pochi secondi alla volta, raffreddando periodicamente il cranio con liquido cerebrospinale (CSF) per evitare surriscaldamento. Successivamente assottigliare ulteriormente l'osso. Passare poi a una velocità più lenta del trapano e rasare la superficie cranica con semplici leggeri contatti.

Il trapano deve avvicinarsi alla superficie con un angolo di circa 30 gradi rispetto alla verticale. Continuare ad assottigliare l'osso oltre il livello vascolare, fino al secondo strato osseo, al di sopra della superficie cerebrale.

Tenere il trapano con piccoli movimenti controllati e applicare la forza solo in direzione laterale. Quando lo spessore dell'osso è di circa 50 micron, i vasi schiacciati devono essere chiaramente visibili attraverso l'osso umido. A questa profondità, piccoli punti bianchi all'interno dell'osso diventeranno visibili per alcuni secondi.

Immediatamente dopo che la superficie asciutta del cranio viene inumidita, lo spessore finale dell'osso dovrebbe essere di circa 10-15 micrometri. Quando l'osso è sufficientemente sottile, le piccole macchie bianche nell'osso non saranno più visibili dopo l'inumidimento della superficie asciutta del cranio. A questo punto, lucidare la finestra con polvere di ossido di stagno.

Utilizzare una piccola quantità di polvere, circa un quarto della dimensione della finestra, agitare una sospensione della polvere con un liquido cerebrospinale (CSF) usando una punta da trapano preesistente con frusta in silicone. Levigare la superficie per 10 minuti, rimuovere completamente la polvere di ossido di stagno dalla finestra e asciugare l'osso. Questo processo dovrebbe contribuire a ridurre eventuali bordi irregolari lasciati dalla punta del trapano durante la procedura di assottigliamento.

Successivamente, ritagliare alcuni quadratini di vetrino coprioggetto numero zero con dimensioni leggermente inferiori rispetto a quelle della finestra. Utilizzare uno scriber per tracciare delicatamente delle linee orizzontali e verticali separate sul vetrino. Scorrere con un bordo dritto senza rompere il vetro.

Quindi posizionare il vetrino coprioggetto in una piastra di Petri. Separare i frammenti di vetro battendo la piastra contro il bordo di un tavolo. Successivamente, applicare una piccola quantità di colla Sano ACRL sulla finestra utilizzando l'estremità di legno di un bastoncino cotonato rotto.

Posizionare rapidamente un pezzo di vetrino coprioggetto pre-tagliato sopra la colla. Evitare di creare bolle sotto il vetrino coprioggetto dopo che la colla è stata lasciata asciugare completamente per 15 minuti. Rimuovere l'eccesso di colla di cianoacrilato dalla superficie superiore del vetrino coprioggetto con una lama di bisturi.

Sigillare i bordi della finestra con cemento dentale. Successivamente, formare una camera leggermente rialzata per contenere l'acqua per l'obiettivo a immersione alla fine. Collocare l'animale in una gabbia riscaldata fino a quando non si sarà completamente ripreso dall'anestesia.

In questo passaggio, stabilizzare l'animale su una piastra ottica per l'acquisizione delle immagini e utilizzare la struttura come supporto per la testa. La nostra piastra separata consente di trasportare l'animale e tutti i dispositivi di monitoraggio fisiologico assemblati come un'unica unità tra il sito chirurgico e quello di imaging a due fotoni. Se si desidera effettuare l'imaging del flusso sanguigno, iniettare 0,05 millilitri di colorante al destrano fluorescente al 5% attraverso la vena infraorbitaria per etichettare il siero sanguigno.

Questo deve essere eseguito sotto anestesia generale e il colorante di solito rimane in circolazione per diverse ore. Iniettare soluzione di Ringer lattato per via intraperitoneale in un volume di tre microlitri per grammo ogni due ore per mantenere i liquidi corporei e i fabbisogni energetici. Risvegliare il topo interrompendo l'isoflurano.

Un'ora dopo il risveglio, il topo è pronto per l'imaging. Chiudere la gabbia sopra il microscopio per evitare contaminazioni luminose. Qui viene mostrato un esempio della vascolatura corticale di una coscia, in un topo YFP marcato mediante iniezione endovenosa di dextrano coniugato con Texas red; i vasi durale sono spesso visibili leggermente al di sopra della superficie corticale nella dura madre.

Le arterie di grosso calibro e i vasi es si trovano sulla superficie corticale. I vasi penetranti si diramano da questa rete superficiale e si estendono all'interno della corteccia, dove si ramificano in un denso letto capillare che fornisce nutrimento al tessuto corticale. Questo filmato mostra la vascolarizzazione sulla superficie del distacco in un topo sveglio.

Si possono osservare oscillazioni spontanee del diametro arterioso quando l'animale si trova in uno stato di riposo tranquillo. Questo metodo dovrebbe risultare utile per lo studio di una vasta varietà di animali transgenici fluorescenti in stato anestetizzato o vigile.