Name: מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: למד ליצור חלון דליל ויציב בגולגולת עכבר לדימוי לטווח ארוך של קליפת המוח. שיטה זו מאפשרת דימוי חוזר של מבנים עד עומק 250 מיקרומטר ללא דלקת מוחית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקני (פוסט דוקטורט מלגה כדי AYS) לבין המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב (MH085499, EB003832, ו OD006831 אל DK). אנו מודים בית פרידמן פבלו Blinder על הערות על כתב היד.

<ol><li>Cetin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1, 3166-3173 (2006).</li>
<li>Kleinfeld, D., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+representation+of+vibrissa+movement+in+the+upper+layers+of+somatosensory+cortex+revealed+with+voltage+sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes.</a> Journal of Comparative Neurology. 375, 89-108 (1996).</li>
<li>Driscoll, J. D. Quantitative two-photon imaging of blood flow in cortex. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDriscoll%2C+JD+%22Imaging+in+Neuroscience+and+Development%22">Imaging in Neuroscience and Development</a>. Yuste, R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 927-937 (2011).</li>
<li>Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuating+and+sensory-induced+vasodynamics+in+rodent+cortex+extends+arteriole+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extends arteriole capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 108, 8473-8473 (2011).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+2-Photon+Imaging+of+Blood+Flow+in+the+Neocortex+through+a+Cranial+Window%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window.</a> J. Vis. Exp. (12), e678-e678 (2008).</li>
<li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reversible+changes+in+dendritic+spine+structure+in+vivo+gated+by+the+degree+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid reversible changes in dendritic spine structure in vivo gated by the degree of ischemia.</a> Journal of Neuroscience. 25, 5333-5338 (2005).</li>
<li>Takano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-mediated+control+of+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 9, 260-267 (2006).</li>
<li>Drew, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Marker, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> Journal of Visualized Experiments. (43), e2059-e2059 (2010).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+neural-hemodynamic+coupling+and+the+hemodynamic+response+function+in+the+awake+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Investigating neural-hemodynamic coupling and the hemodynamic response function in the awake rat.</a> Neuroimage. 32, 33-48 (2006).</li>
<li>Shih, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Kobat, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17, 13354-13364 (2009).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10, 549-551 (2007).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li>
<li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Ascenzi, A., Fabry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+dissection+and+measurement+of+refractive+index+of+osteons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Technique for dissection and measurement of refractive index of osteons.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 6, 139-142 (1959).</li>
<li>Stosiek, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li>
<li>Dunn, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+cerebral+blood+flow+using+laser+speckle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of cerebral blood flow using laser speckle.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, 195-201 (2001).</li>
<li>Villringer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+perfusion+of+the+rat+brain+cortex%3A+An+in+vivo+confocal+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Capillary perfusion of the rat brain cortex: An in vivo confocal microscopy study.</a> Circulation Research. 75, 55-62 (1994).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
<li>Srinivasan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+for+the+quantitative+study+of+cerebrovascular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography for the quantitative study of cerebrovascular physiology.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31, 1339-1345 (2011).</li>
<li>Hu, S., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+imaging+and+characterization+of+the+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature.</a> Journal of Biomedical Optics. 15, 011101-011101 (2010).</li>
<li>Flecknell, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlecknell%2C+PA+%22Laboratory+animal+anesthesia%22">Laboratory animal anesthesia</a>. , Academic Press. San Diego. (1987).</li>
</ol>

אין מה לחשוף.

שני פוטונים הדמיה דרך החלון בנמלי הים דורש שידור דרך העצם דליל ואת דורה, אשר פוחתת אור לייזר ומוסיף סטיות אופטיות בעומקים גדולים יותר 8. עם זאת, למרות החיסרון הזה, במעמקי הדמיה עד 250 מיקרומטר מתחת לפני השטח pial ניתן להשיג עם עירור 900 ננומטר. בעומק הדמיה גדולים יותר יכולים באופן עקרוני להיות אפשרי עם אורכי גל ארוכים יותר עירור 13. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא העדר דלקת קליפת המוח שעלולה להתקיים זמני בשיטות הכרוכות craniotomy מלא 14, 15. חלון בנמל...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סוכן </td><td> מסלול של משלוח </td><td> מינון של העכבר </td><td> משך </td><td> הערות </td><td> מקור </td><td> Ref Ref </td></tr><tr><td> Pentobarbital (נמבוטל) </td><td> ה-IP </td><td> 90 מיקרוגרם / g </td><td> 15-60 דקות </td><td> בטיחות צמצם את השוליים. לעבוד עד מינון נכון של הרדמה לאט. תוספת 10% במינון אינדוקציה כנדרש. </td><td> 036093; באטלר שיין </td><td> 7 </td></tr><tr><td> קטמין (Ketaset) מעורבב עם Xylazine (Anased) </td><td> ה-IP </td><td> 60 מיקרוגרם / g (K) 10 מיקרוגרם / g (x) (לערבב אותו במזרק) </td><td> 20-30 דקות </td><td> Xylazine הוא שותף מוזרק כמו להרפיית שרירים כאבים. להשלים רק קטמין על 50% במינון אינדוקציה כנדרש. </td><td> (K) 010177, (X) 033,198; באטלר שיין </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Isoflurane (Isothesia) </td><td> שאיפה </td><td> 4% כלומר ריכוז מכתשיים (MAC) לזירוז; 1-2% MAC לצורך תחזוקה </td><td> 4-6 שעות. </td><td> בתנאי בתערובת של חמצן 70% ו 30% תחמוצת החנקן. הרדמה ממושכת גורמת להאטת ההתאוששות. </td><td> 029403; באטלר שיין </td><td> 26 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. הצעה בחומרי הרדמה ללימודים הישרדות. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> החברה </td><td><strong&gt; קטלוג # / דגם </td></tr><tr><td> בבטאדין </td><td> שיין באטלר </td><td> 6906950 </td></tr><tr><td> עצירות (Buprenex) </td><td> שיין באטלר </td><td> 031919 </td></tr><tr><td> Fluorescein isothiocyanate dextran, 2 משקל מולקולרי מד&quot;א </td><td> סיגמא </td><td> FD2000S </td></tr><tr><td> איזופרופיל אלכוהול </td><td> דיג </td><td> AC42383-0010 </td></tr><tr><td> לקטט רינגר של פתרון </td><td> שיין באטלר </td><td> 009846; </td></tr><tr><td> לידוקאין פתרון, 2% (V / V) </td><td> שיין באטלר </td><td> 002468 </td></tr><tr><td> מלוח </td><td> שיין באטלר </td><td> 009861 </td></tr><tr><td> כירורגי חלב </td><td> שיין באטלר </td><td&gt; 014325 </td></tr><tr><td> טקסס אדום dextran, משקל מולקולרי 70 kDa </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Maxizyme </td><td> שיין באטלר </td><td> 035646 </td></tr><tr><td> Disposables </td></tr><tr><td> קרביד הקוצים, גודל עצה 1/2 מ&quot;מ </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 19007-05 </td></tr><tr><td> עצה applicators בצמר גפן </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 23-400-100 </td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית, לא. 0 עובי </td><td> תומאס מדעי </td><td> 6661B40 </td></tr><tr><td> Cyanoacrylate דבק </td><td> ND תעשיות </td><td> 31428 H04308 </td></tr><tr><td> גז מטלית </td><td> Newegg </td><td> N82E16848043429 </td></tr><tr><td> המלט גריפ אבקת </td><td> Dentsply </td><td> 675571 </td></tr><tr><td> המלט גריפ ממס </td><td> Dentsply </td><td> 675572 </td></tr><tr><td> מזרק אינסולין, נפח 0.3 מ&quot;ל עם מחט מד 29.5 </td><td> שיין באטלר </td><td> 018384 </td></tr><tr><td> אגוז בורג כדי לאבטח את ראש </td><td> Digikey </td><td> אגוז, H723-ND, בורג, R2-56X1/4-ND </td></tr><tr><td> Opthalmic משחה </td><td> שיין באטלר </td><td> 039886 </td></tr><tr><td> להבי אזמל הניתוחים </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-460-448 </td></tr><tr><td> ברגים, עצמית הקשה # 000 </td><td> JI החברה מוריס </td><td> FF000CE125 </td></tr><tr><td> סיליקון איטום האקווריום </td><td> פרפקטו ייצור </td><td> 31001 </td></tr><tr><td> אבקת תחמוצת בדיל </td><td> אמא של מינרלים </td><td> EQT-TINOX </td></tr><tr><td> ציוד </td></tr><tr><td> זכוכית סופר </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 08-675 </td></tr><tr><td> לנתח מיקרוסקופ </td><td> Carl Zeiss </td><td> OPMI-1 FC </td></tr><tr><td> מקדח חשמלי המופעל </td><td> Foredom או Osada </td><td> K.1020 (Foredom) או EXL-M40 (Osada) </td></tr><tr><td> סכין גילוח חשמלית </td><td> וואהל </td><td> סדרה 8900 </td></tr><tr><td> מלקחיים, Dumont לא. 55 </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> החום מוסדר משוב כרית </td><td> Fhc </td><td> 40-90-8 (thermistor פי הטבעת, 40-90-5D-02, Hלאכול כרית, 40-90-2-07) </td></tr><tr><td> Isoflurane מאדה </td><td> Ohmeda </td><td> IsoTec4 </td></tr><tr><td> הדופק oximeter </td><td> סטאר מדעי החיים </td><td> MouseOx </td></tr><tr><td> מברג, בזעיר אנפין </td><td> גארט ווייד </td><td> 26B09.01 </td></tr><tr><td> Stereotaxic מסגרת </td><td> קופף מכשירים </td><td> דגם 900 (עם מסכת העכבר הרדמה שאינם הקרע מוטות אוזניים) </td></tr><tr><td> מספריים כירורגיות, סוף בוטה </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 14078-10 </td></tr><tr><td> Ultrasonic Cleaner </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 15-335-30 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. רשימת חומרים כימיים מסוימים, disposables וציוד.

מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo הדמיה של תפקוד קליפת המוח דורש גישה אופטית למוח ללא הפרעה של הסביבה תוך גולגולתי. אנו מציגים שיטה ליצירת הגולגולת דליל מלוטשת מחוזק (יציאות) חלון בגולגולת העכבר החובקת כמה מילימטרים בקוטר והוא יציב במשך חודשים. הגולגולת הוא דליל עד 10 עד 15 מיקרומטר עובי עם יד שנערך תרגיל כדי להשיג בהירות אופטית, והוא מעולף ואז עם דבק cyanoacrylate וכוס כיסוי ל: 1) לספק קשיחות, 2) לעכב לצמיחה מחודשת העצם 3) להפחית את פיזור אור מ חריגות על פני העצם. מאז הגולגולת לא פרוץ, דלקת העלולה להשפיע על תהליך הנלמד מופחת במידה ניכרת. בעומק הדמיה של עד 250 מיקרומטר מתחת לפני השטח של קליפת המוח יכולה להיות מושגת באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיית לייזר. חלון זה הוא גם מתאים ללמוד זרימת הדם במוח ותפקוד הסלולר ההכנות הן הרדים ו ער. זה עוד יותר מציעה אופportunity לתמרן פעילות התא באמצעות optogenetics או לשבש את זרימת הדם בכלי ממוקדות על ידי הקרנה של מחזורי פוטוסנסיטייזרים.

אנו מציגים שיטה ליצירת חלון הדמיה בגולגולת העכבר החובקת מילימטרים והוא יציב במשך חודשים ללא דלקת של המוח. שיטה זו גם מתאים מחקרים ארוכי טווח של זרימת דם, דינמיקה סלולריים, ותא / מבנה כלי הדם באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ.

דימוי *in vivo* של תפקוד קורטיקלי דורש גישה אופטית למוח ללא הפרעה לסביבה התוך-גולגולתית. אנו מציגים שיטה להיווצרות...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ליצור חלון גולגולת דק ויציב מעל קורטקס העכבר כדי לאפשר דימות חוזר מבלי להפר את הסביבה התוך-גולגולית. דבר זה מושג תחילה על ידי חיבור תושבת ראש שתאפשר החזקה יציבה של הראש תחת מכשיר הדימות. לאחר מכן, יש לדקק בזהירות את הגולגולת באזור מעל פני השטח הדורסליים של המוח ולהסיק את פני השטח באמצעות נייר לטש בעל גרעין עדין.לאחר מכן, כסו את החלון בנקודה קטנה של דבק ציאנואקרילט ובתכסית זכוכית כדי לחזק את החלון. השלב האחרון הוא הכנת החיה להדמיה תחת מיקרוסקופ פוטונים כפולים. בסופו של דבר, מיקרוסקופיית פוטונים כפולים in vivo משמשת להצגת מבנים עדינים כגון עורקים, ורידים, נימים ודנדריטים עצביים, שניתן להדמיים בעומק של עד 250 micrometers בתוך הקורטקס לאורך שבועות.היתרון המרכזי של טכניקת חלון הגולגולת זו הוא שהגולגולת המכסה את הקורטקס נותרת ללא פגיעה. ראשית, אנו מדקיקים את הגולגולת כדי להשיג בהירות אופטית, ולאחר מכן מחזקים את הגולגולת באמצעות דבק ציאנואקרילט וזכוכית כיסוי. שיטה זו אמורה להיות שימושית לחקר מגוון של עכברים טרנסגניים פלואורסצנטיים במצבי הרדמה או במצב OIC.כדי להתחיל בהליך זה, עקרו באוטוקלאב את כלי הניתוח הנדרשים והרדימו עכבר בן כשלושה עד שישה שבועות בהתאם לשיטות המפורטות בכתב היד המצורף. בדקו את הרפלקס על ידי צביטה בבוהן כדי לוודא שהעכבר נמצא במישור הרדמה ניתוחי. לאחר מכן, קבעו את העכבר במסגרת סטריאוטקסיס.שמר על טמפרטורת גוף של העכבר ב-37 °C. השתמש בגוף חימום ובגשש רקטלי עם בקרה במעגל משוב. מרח משחה עינית על עיניו כדי לשמור על הלחות.לאחר מכן, גלחו את הקרקפת באמצעות מכונת גילוח חשמלית קטנה. לאחר מכן, נקו את הקרקפת עם Betadine, ולאחר מכן נגבו אותה עם 70% isopropyl alcohol. לאחר מכן, חממו מנה של נוזל חוט שדרה מלאכותי סטרילי ל-37 degrees Celsius תחת מיקרוסקופ.הסר את הקרקפת מכל שטח הגולגולת הגבית באמצעות מספריים כירורגיים. גזום את העור לצדדים עד לקצוות השרירים הרקיים בשני צדי הגולגולת, ואחורית לשרירי הצוואר. לאחר מכן, השתמש בלהב סקלפל כדי להסיר את הפריוסטאום (קרום העצם) הדק מפני השטח של הגולגולת.לאחר מכן, ייבשו ונקו את הגולגולת. לאחר מכן, מרחו שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט על פני השטח של הגולגולת. המתינו עד שהדבק יתייבש לחלוטין.שכבת דבק זו נדרשת להצמדה נאותה של המלט הדנטלי. בשלבים הבאים, עבור הכנה של דימוי במצב ערות, קידחו חורים והחדירו שני ברגים בעלי הברגה עצמית (self-tapping) מסוג 0 0 0 למשטח הגולגולת בצד הנגדי.לאחר מכן, הצמידו לגולגולת מחבר קשיח בהתאמה אישית בעל שתי נקודות עיגון. פעולה זו מפחיתה משמעותית את דרגות החופש ומפשטת את המיקום מחדש של אותו שדה דימות במחקרים אורך. מוט רוחב רחב מספק גם מקום מספיק להצבת אלקטרודות ולגירוי רעידות.בשלב הבא, כסו את כל שטח הגולגולת, למעט מיקום החלון, בשכבה של צמנט דנטלי, והבטיחו שכל קצוות העור החשופים מכוסים בצמנט. לפני דילול הגולגולת, ודאו שהמקדחים חדים והימנעו משימוש חוזר בהם. השתמשו במקדח דנטלי במהירות נמוכה כדי לדלל אזור של 2 mm על 2 mm מעל הקורטקס הסומטוסנסורי באמצעות מקדח בקוטר 0.5 mm.לאחר מכן, דללו את פני השטח של הגולגולת היבשה למשך מספר שניות בלבד בכל פעם, תוך שטיפה תקופתית של הגולגולת ב-CSF כדי למנוע חימום. לאחר מכן, דללו את העצם. בהמשך, העבירו את המקדח למהירות נמוכה יותר וגססו את פני השטח של הגולגולת במגעים קלים בלבד.יש להביא את המקדח אל פני השטח בזווית של כ-30 מעלות ביחס לאנך. המשך בדילול העצם מעבר לשכבה הווסקולרית אל תוך שכבת העצם השנייה, מעל פני השטח של המוח.החזיקו את המקדח בתנועות קטנות ומבוקרות והפעילו כוח רק בכיוון הלטרלי. כאשר עובי העצם יהיה כ-50 microns, כלי הדם של הקילוף (peel vessels) אמורים להיות גלויים בבירור דרך העצם הרטובה. בעומק זה, נקודות לבנות קטנות בתוך העצם יהיו גלויות למשך מספר שניות.מיד לאחר הרטבת פני השטח היבשים של הגולגולת, עובי העצם הסופי צריך להיות כ-10 עד 15 מיקרונים. כאשר העצם דקה מספיק, הנקודות הלבנות הקטנות בעצם לא יהיו גלויות עוד בעת הרטבת פני השטח היבשים של הגולגולת. כעת יש ללטש את החלון באמצעות אבקת תחמוצת בדיל.השתמשו בקורט קטן של אבקה, בגודל של כרבע מגודל החלון; ערבבו תרחיף של אבקה עם CSF באמצעות מקדח מוכן מראש עם שוט סיליקון. פולש את הפני השטח במשך 10 דקות, שטפו היטב את אבקת תחמוצת הבדיל מהחלון ויבשו את העצם. תהליך זה אמור לסייע בהפחתת קצוות מחוספסים שנותרו מהמקדח במהלך הליך הדילול.בשלב הבא, חתוך מספר חתיכות ריבועיות של זכוכית כיסוי מספר 0 בגודל הקטן מעט מגודל החלון. השתמש במגרדת כדי לסמן בעדינות את הקווים האופקיים והאנכיים המופרדים בכיסוי. החלק עם סרגל ללא שבירת הזכוכית.לאחר מכן, הניחו את לוכסנית הכיסוי בתוך צלחת פטרי. הפרידו בין חלקי הזכוכית על ידי הקשה של הצלחת נגד קצה השולחן. לאחר מכן, מרחו כמות קטנה של דבק Sano ACRL מעל החלון באמצעות הקצה העץ של מקלון צמר שבור.הניחו במהירות חתיכת זכוכית כיסוי חתומה מראש מעל הדבק. הימנעו מיצירת בועות מתחת לזכוכית הכיסוי לאחר שהדבק התייבש לחלוטין במשך 15 דקות. הסירו שאריות של דבק cyanoacrylate מהמשטח העליון של זכוכית הכיסוי באמצעות להב סקלפל.אטמו את קצוות החלון באמצעות צמנט דנטלי. לאחר מכן, צרו שוליים מוגבהים מעט כדי להחזיק מים עבור עדשת הטבילה (dipping lens) בסיום התהליך. הניחו את החיה בכלוב חם עד להתאוששות מלאה מההרדמה.בשלב זה, ייצב את בעל החיים על לוח בסיס אופטי (optical breadboard) לצורך דימות והשתמש במסגרת כתמיכה לראש. הפלטה הנפרדת שלנו מאפשרת להעביר את בעל החיים ואת כל מכשירי הניטור הפיזיולוגיים כיחידה אחת בין אתר הניתוח לאתרי הדימות בדו-פוטון. אם נדרש דימות של זרימת דם, הזרק 0.05 milliliters של צבע fluorescent dextran בריכוז 5% דרך הווריד התת-מסלולי (infraorbital vein) כדי לסמן את סרום הדם.יש לבצע זאת תחת הרדמה כללית, והצבע נשאר בדרך כלל במחזור הדם למשך מספר שעות. הזרק תמיסת lactated ringer באופן אינטריפרואיטוני בנפח של 3 µL לגרם כל שעתיים כדי לשמור על נוזלי הגוף ועל דרישות האנרגיה. התר את העכבר על ידי הפסקת מתן ה-isoflurane.שעה לאחר היקיצה, העכבר מוכן לדימוי. סגרו את הכלוב מעל המיקרוסקופ כדי למנוע זיהום מאור. מוצג. להלן דוגמה של כלי הדם הקורטיקליים בירך של עכבר YFP אחד שסומן על ידי הזרקה תוך-ורידית של dextran מצומד ל-Texas red; כלי הדם הדורליים נראים לעיתים קרובות מעט מעל פני הקורטקס בתוך ה-dura mater.עורקי קליפה (peel arteries) גדולים וורידים שוכנים על פני השטח הקורטיקליים. כלי דם חודרים מסתעפים מרשת פני השטח זו וצוללים אל תוך הקורטקס, שם הם מתפצלים למצע נימיים צפוף המזין את הרקמה הקורטיקלית. סרטון זה מציג את כלי הדם על פני השטח של הקליפה בעכבר ער.ניתן להבחין בתנודות ספונטניות בקוטר העורק כאשר בעל החיים נמצא במצב מנוחה רגוע. שיטה זו צפויה להועיל במחקר של מגוון רחב של בעלי חיים טרנסוניים פלואורסצנטיים, הן במצב הרדמה והן במצב ערות.

a-polished-reinforced-thinned-skull-window-for-long-term-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים שיטה שוב ושוב לדמיין microglia Murine והפצת...

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

בחומר וידאו משלים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור...

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

על ידי שילוב של-גולגולת דקה מלוטשת ומחוזקת (יציאות) גולגולתי חלון והזרקת גליובלסטומה (GBM) תא, אנו יכולים לצפות בייזום וצמיחה מתאים מוזרקים GBM במוח של עכבר חי longitudinally גליומה.

הדמית Glioma ייזום<em&gt; In Vivo</em&gt; דרך חלון גולגולתי מלוטש ומחוזק-גולגולת דקה

סרטון זה מציג הליך כירורגי להשתלת חלון גולגולתי במודל עכבר לגישה אופטית יציבה לאזורים שונים במוח.

השתלת חלון הדמיה גולגולתי במודל עכבר: הליך כירורגי להשתלת כיסויים מבוססי זכוכית לגישה אופטית יציבה לאזורים במוח מורין

טראומה מוחית חריפה היא פגיעה חמורה שאין לה טיפול הולם עד כה. מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת לימוד אורכי התהליך של התפתחות טראומה המוחית חריפה וחיטוט אסטרטגיות טיפוליות במכרסמים. שני דגמים של טראומה מוחית חריפה למדה אצל בשני פוטונים הדמיה vivo של המוח הם הפגינו בפרוטוקול זה.

טראומה מוחית חריפה בעכברים אחריו שני פוטונים הדמיה אורכית

כתב יד זה מתאר הליך לעקוב אחר השיפוץ של cerebrovasculature במהלך הצטברות פלאק עמילואיד in vivo באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ אורך. הכנה הגולגולת דליל מאפשר הדמיה של צבעי ניאון כדי להעריך את התקדמות הנזק כלי דם במוח במודל של עכברים של מחלת אלצהיימר.

אֹרכִּי<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של Cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית

פרוטוקול זה מתאר טכניקת השרשה כרונית חלון הגולגולת שניתן להשתמש בהם עבור הדמיה האורך של מבנים נוירווליו-כלי דם, אינטראקציות, ותפקוד בתנאים בריאים ונגועים. היא משמשת כחלופה משלימה לגישת הדימות הtranscranial, שבזמן הרצוי לעתים קרובות, יש כמה מגבלות קריטיות.

מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים

מוצג כאן פרוטוקול להשתלת חלון גולגולתי כרוני להדמיה אורכית של תאי מוח בעכברים ערים ומרוסנים ראש.

השתלת חלון גולגולת להדמיה חוזרת ונשנית In Vivo בעכברים ערים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת חלון גולגולתי גדול (6 x 3 מ"מ2) באמצעות עטיפת מזון, סיליקון שקוף וזכוכית כיסוי. חלון גולגולתי זה מאפשר ניסויים בהדמיית סידן בשדה רחב ובשני פוטונים באותו עכבר.

אין ויוו הדמיית סידן בשדה רחב ושני פוטונים מעכבר באמצעות חלון גולגולתי גדול

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

למד ליצור חלון דליל ויציב בגולגולת עכבר לדימוי לטווח ארוך של קליפת המוח. שיטה זו מאפשרת דימוי חוזר של מבנים עד עומק 250 מיקרומטר ללא דלקת מוחית.

מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר

גלה סרטונים נוספים