Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con Drosophila Tessuto

Questa procedura genera dati di immunoprecipitazione della cromatina ottenuti da tessuti di Drosophila isolati manualmente, riflettendo con precisione lo stato della cromatina in vivo. In questo caso, centinaia di testicoli vengono raccolti mediante dissezione manuale. Vengono quindi eseguiti saggi di immunoprecipitazione della cromatina utilizzando un anticorpo diretto contro la proteina di interesse.

Eseguire un saggio di analisi quantitativa con R-T-P-C-R per l'arricchimento della regione genomica specifica nel DNA chippato purificato. In alternativa, il sequenziamento ad alto rendimento del campione chippato genera un profilo a livello genomica. Infine, l'analisi ChIP di tessuti dissecati fornisce una rappresentazione dello stato della cromatina nelle cellule in condizioni fisiologiche.

Questo protocollo è ottimizzato per l'analisi di tessuti isolati direttamente dall'organismo. Per ottenere stati della cromatina e informazioni epigenetiche in condizioni fisiologiche reali, illustreremo l'uso della tecnica chip in Drosophila al fine di analizzare lo stato della cromatina. Tuttavia, questo protocollo può essere applicato anche ad altri organismi, come il topo o il pesce zebra.

La dimostrazione visiva di questo protocollo è fondamentale per ottenere DNA di qualità e quantità insufficienti da utilizzare per chip o per la generazione di librerie di sequenziamento ad alto rendimento. Per prima cosa, dissezionare il tessuto di interesse, in questo caso circa 200 coppie di testicoli di drosophila, in PBS freddo contenente inibitore delle proteasi e 100 microgrammi per millilitro di PMSF. Dopo aver risciacquato il tessuto due volte, risospendere in 200 microlitri della stessa soluzione PBS con inibitori.

Quindi fissare il campione con 5,5 microlitri di formaldeide al 37% riscaldata. Incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti, agitando ogni cinque minuti mediante vortex, quindi lasciare sedimentare il tessuto sul ghiaccio.

Sciacquare due volte con 450 microlitri di PBS contenente inibitori. Conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius. Combinare i campioni di testicolo di 200 oph in un tubo einor da 1,75 millilitri.

Aspirare il buffer e risospendere i campioni in 200 microlitri di buffer di lisi. Dissociare completamente il tessuto con un omogeneizzatore blu, assicurandosi che non rimangano aggregati, e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.

Quindi frammentare il campione con un microchip soat, lasciandolo a riposo sul ghiaccio per 50 secondi. Ripetere l'operazione da quattro a cinque volte per ottenere la dimensione ottimale dei frammenti per la destinazione del chip. Successivamente, diluire con 1,8 millilitri di buffer ripper per ottenere una soluzione stock di estratto di cromatina. Per un saggio chip di successo, è fondamentale determinare empiricamente la dimensione dei frammenti di DNA.

Quindi dobbiamo eseguire l'elettroforesi su gel per procedere con l'esperimento sul chip. Per il campione di controllo in ingresso, prelevare 50 microlitri. Aggiungere due microlitri di cloruro di sodio 5 M e incubare a 65 gradi Celsius durante la notte.

Per invertire il cross-linking, procedere coniugando l'anticorpo alla proteina. Aggiungere delle perle in un tubo Fendor da 1,5 millilitri. Aggiungere 40 microlitri di perle di proteina A e 600 microlitri di PBS, quindi agitare a quattro gradi Celsius per due minuti.

Quindi applicare le perle al magnete e scartare il soprannatante. Aggiungere ora 100 microlitri di PBS e anche l'anticorpo di interesse. Incubare a temperatura ambiente per un'ora.

Dopo aver raccolto le perle mediante il magnete, aggiungere un millilitro di estratto di cromatina tissutale. Incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Successivamente, applicare il campione chip al magnete ed eliminare il soprannatante.

Eseguire lavaggi di un millilitro delle perle raccolte a quattro gradi SIU per 10 minuti per ogni lavaggio, risospendere le perle in 100 microlitri di buffer TEA. Per invertire i legami incrociati tra complessi proteina-DNA, aggiungere tre microlitri di SDS al 10% e cinque microlitri di Proteinasi K a 20 milligrammi per millilitro e incubare a 65 gradi Celsius per tutta la notte.

Centrifugare le perle su un magnete. Trasferire il soprannatante contenente il DNA in un nuovo tubo. Lavare le perle una volta e combinare i soprannatanti contenenti il DNA 2D.

Successivamente, purificare il DNA mediante estrazione con fenolo-cloroformio e trasferire il livello acquoso superiore in un nuovo tubo. Precipitare il DNA con 20 microgrammi per millilitro di acrilamide lineare o glicogeno, aggiungendo 20 microlitri di acetato di sodio tre molare e 500 microlitri di etanolo al 100%.

Mescolare bene e incubare a meno 80 gradi Celsius per 10 minuti. Recuperare il DNA mediante centrifugazione. Eliminare il soprannatante e lavare il pellet una volta con 300 microlitri di etanolo al 70% dopo averlo essiccato all'aria.

Risospendere i pellet di DNA in 50 microlitri di tampone TE. Conservare i campioni di DNA frammentato a meno 20 gradi Celsius. Preparare una diluizione seriale del DNA genomico per la curva standard.

In una piastra a 96 pozzetti, utilizzando come template DNA genomico diluito di controllo in ingresso o DNA frammentato, impostare una reazione di QPCR da 20 microlitri in duplicato; centrifugare la piastra a 96 pozzetti nel mini centrifugatore per piastre. Eseguire la piastra campione su un sistema di PCR in tempo reale per convalidare i dati. Verificare innanzitutto la presenza di un singolo picco nel grafico di dissociazione termica, indicativo di un unico amplicone derivato dalla PCR.

Successivamente, tracciare la curva standard. Utilizzando i dati della serie di DNA genomico diluito, calcolare la formula per determinare la quantità di DNA in base al valore di soglia del ciclo (Ct). Determinare inoltre la fase lineare dell'amplificazione esponenziale della PCR per ogni coppia di primer.

Se il valore CT dei campioni di DNA chip e dei controlli di input rientra nel range lineare del valore CT, calcolare l'arricchimento del DNA chip rispetto all'input preso in considerazione. Il fattore di diluizione delle riparazioni finali prevede da 0,1 a cinque microgrammi di DNA chip in reazioni da 50 microlitri contenenti DNA polimerasi T4 e polinucleotide chinasi T4. Incubare per 45 minuti a temperatura ambiente seguendo le istruzioni del produttore.

Quindi purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione per reazione MinLu. Proseguire aggiungendo dei prolungamenti all'estremità tre prime mediante DNA polimerasi, un grande frammento CLA NOW e DATP, e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Nuovamente, far passare la reazione su una colonna spin per purificare e concentrare il DNA.

Procedere alla ligazione con l'oligo adattatore. Mescolare con il kit di Illumina utilizzando la DNA ligasi T4 e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, purificare il campione utilizzando il kit di ripulitura della reazione MinElute.

Eluire il DNA in 20 microlitri. Successivamente, separare il campione di DNA mediante elettroforesi utilizzando l'apparecchio egel. Isolare la banda di 200-400 paia di basi nel gel e purificarla utilizzando il kit di estrazione da gel KYOGEN.

Ora amplificate una libreria utilizzando primer a estremità accoppiate, enzimi fusion HF e pH dal programma Illumina per 20 cicli PCR. Successivamente, su un comune gel di elettroforesi in agarosio allo 2% isolare frammenti di DNA di 200-400 paia di basi per il sequenziamento ad alto rendimento nel software di Ellen. Allineate tutte le letture al genoma di drosophila, consentendo fino a due discrepanze rispetto alla sequenza di riferimento.

Conservare le letture univocamente mappate per l'analisi successiva nel caso di letture identiche multiple. Conservare fino a tre copie per ridurre la possibilità di bias derivanti dall'amplificazione PCR. Successivamente, utilizzare uno script Python per convertire l'output della pipeline GA in file di dati estensibili per il browser.

Impostare una dimensione della finestra di quattro paia di basi e una dimensione del frammento di DNA di 160 paia di basi. Classificare i geni di drosophila in geni silenziati ed espressi in base al valore RPKM. Numero digitale, designare i geni con RPKM pari a zero.

Come gruppo silente, classificare i geni con RPKM maggiore di uno in un gruppo espresso con tre sottogruppi di livelli di espressione bassa, moderata e alta. Infine, confrontare i livelli di modificazione istonica e di espressione genica utilizzando uno script Python precedentemente descritto in basal 2007, il bag of marbles. I testicoli mutanti mostrano un difetto nella transizione da spermatogoni proliferativi a spermatociti differenziati.

Questo esperimento di qPCR utilizza testicoli BAM come fonte di cellule germinali indifferenziate per analizzare lo stato della cromatina di geni chiave necessari per la differenziazione degli spermatozoi, in particolare l'arricchimento delle modifiche istoniche, come l'istone H3 trimetilato in lisina 27 o l'istone H3 trimetilato in lisina 4. L'espressione dei geni di differenziazione viene determinata normalizzando rispetto a un gene di controllo costitutivamente espresso. I geni di differenziazione, come il fattore di trascrizione maschile specifico 87 Don Juan e fuzzy onion, che non sono espressi nei testicoli BAM, risultano fortemente arricchiti della modificazione istonica repressiva H3 trimetilata in lisina 27.

Inoltre, sono privi dell'istone attivo. Tre, la modificazione istonica lisina quattro metil tre. Una firma della cromatina che definiamo monovalente, in contrasto con la valenza che presenta sia l'istone tre lisina quattro metil tre sia l'istone tre.

Lisina 27 metil tre arricchita nei geni della differenziazione nelle cellule staminali embrionali. Dati di sequenziamento ChIP ottenuti utilizzando lo stesso set di anticorpi. Confermano il risultato di ChIP-qPCR mostrato nella figura 1A: le regioni genomiche di tutti e tre i geni della differenziazione terminale testati sono fortemente arricchite di lisina tre, 27 metil tre, ma non di istone tre, lisina quattro metil tre.

Al contrario, il ciclo dell'invecchiamento costitutivamente espresso presenta un'elevata metilazione della lisina 3 dell'istone H3 a livello del residuo 4, ma una bassa metilazione della lisina 27 dell'istone H3 vicino al suo sito di inizio della trascrizione. Questa figura mostra i dati di ChIP-seq relativi a due modifiche istoniche nelle vicinanze dei siti di inizio della trascrizione di quattro classi di geni espressi in modo differenziale. La metilazione della lisina 27 dell'istone H3 è arricchita a valle dei siti di inizio della trascrizione, fenomeno che risulta inversamente correlato al livello di espressione genica.

I geni silenziati mostrano il livello più alto di metilazione tre dell'istone tre lisina 27; i geni altamente espressi non mostrano alcun legame con la metilazione tre dell'istone tre lisina 27, coerentemente con il ruolo repressivo della metilazione tre dell'istone tre lisina 27 sull'espressione genica. Al contrario, l'arricchimento della modificazione metilazione tre dell'istone tre lisina quattro nelle regioni circostanti i siti d'inizio della trascrizione mostra una correlazione opposta con il livello di espressione genica, coerentemente con il ruolo attivatore dell'istone tre lisina quattro metilazione tre sull'espressione genica.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita correttamente in due o tre giorni. Non dimenticare di adottare le precauzioni di sicurezza quando si utilizzano fenolo, cloroformio e formaldeide. Speriamo che questo protocollo ti abbia fornito una comprensione sufficiente dell'uso dell'immunoprecipitazione della cromatina per analizzare il paesaggio della cromatina in tessuti in vivo.