Name: Radioattivo In situ Ibridazione per il rilevamento Diversi schemi di espressione genica nei tessuti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 38 s
Description: Scopri l'ibridazione in situ radioattiva per rilevare schemi di espressione genica nei tessuti vertebrati. Questo metodo quantitativo identifica trascritti a bassa abbondanza preservando l'integrità tissutale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri di laboratorio Jarvis che hanno migliorato il protocollo nel corso degli anni.

<ol><li>Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probes+for+rare+mRNAs+reveal+distributed+cell+subsets+in+canary+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain.</a> Neuron. 1, 249-261 (1988).</li>
<li>Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+glutamate+receptors+in+avian+neural+pathways+for+learned+vocalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization.</a> J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).</li>
<li>Haesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li>
<li>Jarvis, E. D., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Motor-driven gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).</li>
<li>Holzenberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+insulin-like+growth+factor+II+in+the+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain.</a> J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).</li>
<li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole-mount+and+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).</li>
<li>Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+nonradioactive+detection+of+mRNA+in+tissue+sections%3A+novel+application+of+the+whole-mount+in+situ+hybridization+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).</li>
<li>Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dusp1+immediate+early+gene+is+regulated+by+natural+stimuli+predominantly+in+sensory+input+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).</li>
<li>Braissant, O., Wahli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+in+situ+hybridization+protocol+using+non-radioactively+labelled+probes+to+detect+abundant+and+rare+mRNAs+on+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica%22%5BJournal%5D)">A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections.</a> Biochemica. 1, 10-16 (1998).</li>
<li>Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+receptors+in+a+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dopamine receptors in a songbird brain.</a> J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).</li>
<li>Wada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+neuroethological+approach+for+identifying+and+characterizing+a+cascade+of+behaviorally+regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).</li>
<li>Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li>
<li>Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+cues+shift+functional+connectivity+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).</li>
<li>Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+behavioral+and+genomic+responses+to+social+opportunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity.</a> PLoS. Biol. 3, e363(2005).</li>
<li>Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+gene+regulation+by+territorial+singing+behavior+in+freely+ranging+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds.</a> Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).</li>
<li>Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+whom+the+bird+sings%3A+context-dependent+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">For whom the bird sings: context-dependent gene expression.</a> Neuron. 21, 775-788 (1998).</li>
<li>Feenders, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mapping+of+movement-associated+areas+in+the+avian+brain%3A+a+motor+theory+for+vocal+learning+origin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin.</a> PLoS One. 3, e1768(2008).</li>
<li>Chen, C. C., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+two+gonadotropin-releasing+hormone+receptor+types+in+a+cichlid+fish+suggest+functional+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization.</a> J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Radioattivo ibridazione in situ di mRNA è ampiamente usato per molteplici scopi, compresi per lo studio dell&#39;organizzazione regionale tessuto, tipi di cellule, e l&#39;attività cerebrale funzionale 2-5,10,12-14. L&#39;uso successivo è sui geni la cui espressione mRNA nel cervello dipende da una maggiore attività neurale, spesso chiamati attività-dipendente geni o geni precoci immediati. Con questi usi, il nostro metodo è stato applicato tra le specie più, anche in uccelli, mammiferi (ad esempio umano), pesci e anfibi, in diversi tessuti, compreso il cervello, pelle e muscoli, ed età diversi, tra cui hatchlings / neonati, minori , gli adulti, e qui nelle sezioni embrioni interi 2,3,5,15-17. Le caratteristiche speciali del nostro protocollo sono: (1) produce un equilibrio tra specificità anatomica e specificità quantitativa. Per quantificare l&#39;espressione del gene sul x-ray film, scattare foto digitali delle immagini (es:. Fig. 1A e 1B), utilizzare il Photoshop (Adobe) funzione istogramma per misurare la densità di pixel nelle regioni di interesse e sottrarre i livelli di fondo del film al di fuori del tessuto, ma ancora sul vetrino 2,4. Per quantificare l&#39;espressione a livello cellulare, prendiamo immagini di granuli di argento su cellule in alto ingrandimento (40-100X; Fig. 4). Abbiamo quindi utilizzare la soglia e le funzioni di misura J Immagine Wayne Rasband a NIH per contare il numero di granuli di argento nell&#39;immagine, sottrarre il conteggio di fondo in una zona simile senza cellule sul vetrino, dividere per il numero di celle, per ottenere un valore di espressione per cella. 4,18 (2) può essere velocità relativamente elevata, permettendo l&#39;elaborazione di 100-200 diapositive simultaneamente, a causa della tenuta coverslip tenuta creata dal bagno d&#39;olio minerale. Standard in-situ di ibridazione metodi di richiedere più tempo per sigillare i vetrini con parafilm, smalto, ed altri mezzi, dove scorre prendono un sacco di spazio, (3) E &#39;moltosensibile per trascritti poco abbondanti a causa di destrano solfato e la soluzione di Denhardt nel tampone di ibridazione 2,13; (4) L&#39;approccio di imaging in campo scuro produce immagini ad alto contrasto a causa fotografare sotto illuminazione a campo scuro un microscopio da dissezione 4,5. Inoltre, permette di rivelazione sensibile piccoli cambiamenti nell&#39;espressione genica, come in attività dipendente espressione genica per identificare regioni specifiche del cervello attivate durante la percezione e la produzione di specifici comportamenti 19. Le limitazioni relative non radioattivi sono protocolli che questi ultimi sono più chiare nella risoluzione cellulare e la posizione del mRNA all&#39;interno della cellula, e lavorando con emulsione è molto sensibile alla manipolazione e alla luce. È possibile combinare il nostro metodo con altri metodi, come la non-radioattivo ibridazione in situ per etichettare l&#39;espressione mRNA di più di un gene nel tessuto stesso 10,17,20. Esso può essere combinato con l&#39;immunocitochimicaetichettare sia RNA e proteica sullo stesso campione al fine di localizzare la co-mRNA con certi tipi di cellule 10. Le modifiche necessarie per il protocollo tali esperimenti doppia marcatura sono descritti nei riferimenti citati. In sintesi, il nostro approccio facilita la comprensione dei tempi e localizzazione cellulare di espressione genica, al fine di comprendere l&#39;organizzazione regione, l&#39;attività funzionale dei tessuti, e la funzione del gene.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Anidride acetica </td><td> VWR </td><td> MK242002 </td><td></td></tr><tr><td> Cloroformio </td><td> VWR </td><td> BDH1109 </td><td></td></tr><tr><td> Viola acetato cresolo </td><td> Sigma </td><td> C5042 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Thermo Scientific </td><td> Microm HM550 </td><td></td></tr><tr><td> Formammide deionizzata </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> Promega </td><td> P1171 </td><td> 100mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> ED </td><td></td></tr><tr><td> Incorporare stampo </td><td> VWR </td><td> 15160-215 </td><td></td></tr><tr><td> Fisher marchio Superfrost più scorrevole </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-034-979 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Formaldeide </td><td> VWR </td><td> BDH0506-4LP </td><td></td></tr><tr><td> Formammide </td><td> Sigma </td><td> F7508 </td><td></td></tr><tr><td> GeneClean kit </td><td> Q-Bio gene </td><td> 1001-200 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak BioMax MR cinema </td><td> Sigma </td><td> Z350370 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak NTB Emulsione </td><td> Carestream Health </td><td> 8895666 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Professional developer D19 </td><td> Kodak </td><td> 1462593 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Professional Fixer </td><td> Kodak </td><td> 1971746 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Olio minerale </td><td> VWR </td><td> IC15169491 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> VWR </td><td> SX0600-1 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Sigma </td><td> 76240 </td><td></td></tr><tr><td> Poly A </td><td> Invitrogen </td><td> POLYA.GF </td><td></td></tr><tr><td> RATP </td><td> Promega </td><td> P1132 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> rCTP </td><td> Promega </td><td> P1142 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> rGTP </td><td> Promega </td><td> P1152 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td> 40Units/μl </td></tr><tr><td> S 35 UTP </td><td> PerkinElmer </td><td> NEG039C001MC </td><td></td></tr><tr><td> Safety-Solve soluzione </td><td> Sicurezza Risolvere Research Products International </td><td> 111177 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato di sodio </td><td> Sigma </td><td> S7899 </td><td> 3M </td></tr><tr><td> Fosfato di sodio bibasico </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio fosfato monobasico </td><td> Sigma </td><td> S3139 </td><td></td></tr><tr><td> SP6RNA polimerasi </td><td> Promega </td><td> P1085 </td><td></td></tr><tr><td> Colorazione telaio metallico </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 70312-54 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerasi </td><td> Promega </td><td> P2075 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek ottobre </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Trascrizione del buffer 5x </td><td> Promega </td><td> P1181 </td><td></td></tr><tr><td> Trietanolammina </td><td> VWR </td><td> IC15216391 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl (1 M, pH 8,0) </td><td> VWR </td><td> 101449-446 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Roche </td><td> 10109509001 </td><td></td></tr></tbody></table> Soluzioni: <ol><li> Reagenti per la produzione di ribosonde: 1,5 microlitri modello DNA (0.2-0.3 mg / pl), 2 microlitri di tampone 5x trascrizione ottimizzato, 1 ml di DTT 100mm (viene fornito con Polymerase da Promega, mixbene a temperatura ambiente), 0,3 pl di RNasin (40 unità / mL), 1,5 pl di soluzione di miscela AGC ribonucleotide, 3,5 pl di S 35 UTP, e 1 pl RNA polimerasi. Portare a 10 ml con acqua priva di nucleasi. </li><li> AGC mix soluzione ribonucleotide: miscelare la stessa quantità di 10mM ATP, GTP e CTP insieme. </li><li> Soluzione di sodio acetato per EtOH precipitazione per rimuovere libera S 35 UTP: 40 microlitri e acqua RNase DNase free, 5 pl di acetato di sodio 3M, e 125 microlitri di EtOH al 100%. </li><li> Ibridazione tampone (10 ml stock): 5 ml del 100% formammide deionizzata, 600 pl di 5M NaCl, 1M Tris-HCl (pH = 8,0), 240 pl di 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 100 pl di soluzione di Denhart 100x, 100 pl di 1M DTT, 250 pl di 20mg/ml tRNA, 125 pl di 20 mg / ml di poli A, e 1 g di solfato di sodio destrano. Aggiungere acqua trattata con DEPC per portare il volume totale di 10 ml. Agitare vigorosamente e incubare a 55 ° C fino a quando tutti destrano solfato di sodio viene sciolto. Conservare il tampone di ibridazione in-20 ° C, che è buono per ~ 6 mesi. </li><li> 4% soluzione di paraformaldeide tamponata: Aggiungere 40 g di paraformaldeide in 760 ml di acqua distillata in un pallone designato per paraformaldeide, il calore a 50 ° C su una piastra bollente sotto agitazione. Aggiungere 320 microlitri di NaOH 10N per sciogliere il paraformaldeide. Dopo aver dissolto (~ 10 min), aggiungere 100 ml di PBS 10x, e portare il volume al massimo con acqua distillata fino a 1 litro. Mescolare e riscaldare la soluzione fino a quando paraformaldeide si scioglie. Il pH dovrebbe essere 7.4. </li><li> L&#39;acetilazione tampone: 13,6 ml di trietanolammina più 2,52 ml di anidride acetica in 1 litro di acqua distillata. </li><li> 20x SSPE soluzione: 3M NaCl, 200 mM NaH 2 PO 4-H 2 O, e 200 mM EDTA in acqua distillata. Regolare la soluzione a pH 7,4 con NaOH 10N. </li><li> 10x tampone PBS: 80 g di NaCl, 2,0 g di KCl, 14.4g di Na 2 HPO 4, e 2,4 g di KH 2 PO 4 in acqua distillata. Regolare la soluzione a pH 7,0 e portare il volume totale a 1 liter. </li><li> Soluzione secondo lavaggio: 0,1% β-mercaptoetanolo e 50% formammide a 2x SSPE </li><li> Cresolo acetato soluzione viola: 3% acetato violetto cresolo in acqua di rubinetto (acqua distillata impedisce una buona colorazione), disciolto notte con agitazione in un pallone a temperatura ambiente. Filtrare con aspirazione a vuoto attraverso un filtro di carta Whatman 1 millimetro e imbuto Buchner. </li></ol>

radioattivo in situ ibridazione per il rilevamento diversi schemi di espressione genica nei tessuti

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Conoscendo il tempo, livello, localizzazione cellulare, e tipo di cellula che un gene viene espresso in contribuisce alla nostra comprensione della funzione del gene. Ciascuna di queste caratteristiche può essere realizzato con ibridazione in situ di mRNA all&#39;interno delle cellule. Qui vi presentiamo un metodo radioattivo in ibridazione in situ modificato da Clayton et al. (1988) 1, che opera con successo nel nostro laboratorio da molti anni, soprattutto per adulti cervelli vertebrati 2-5. Le lunghe RNA complementari (cRNA) sonde alla sequenza bersaglio permette di individuare trascritti poco abbondanti 6,7. L&#39;incorporazione di nucleotidi radioattivi nelle sonde cRNA consente di sensibilità di rivelazione ulteriore trascrizioni poco abbondanti e analisi quantitative, sia dalla luce sensibile alla pellicola a raggi X o emulsione rivestita sul tessuto. Questi metodi di rilevamento forniscono un lungo periodo di registrazione di espressione del gene bersaglio. Rispetto ai non-probe radioattivo methods, come DIG-etichettatura, il metodo di ibridazione della sonda radioattiva non richiede fasi di amplificazione multipli utilizzando HRP-anticorpi e / o TSA kit per rilevare trascritti poco abbondanti. Pertanto, questo metodo fornisce una relazione lineare fra l&#39;intensità del segnale e la quantità di mRNA bersaglio per l&#39;analisi quantitativa. Esso consente l&#39;elaborazione 100-200 vetrini simultaneamente. Funziona bene per varie fasi di sviluppo di embrioni. Maggior parte degli studi di sviluppo di espressione genica utilizzare gli embrioni interi e non-radioattivi approcci 8,9, in parte perché il tessuto embrionale è più fragile tessuto adulto, con meno della coesione tra le cellule, il che rende difficile vedere confini tra popolazioni di cellule con sezioni di tessuto. Al contrario, il nostro approccio radioattivo, a causa della più ampia gamma di sensibilità, è in grado di ottenere una maggiore risoluzione di contrasto in genica tra le regioni di tessuto, rendendo più facile vedere confini tra le popolazioni. Usando questo metodo, i ricercatori potrebbero rivelare lapossibile significato di un gene appena identificato, e ulteriormente prevedere la funzione del gene di interesse.

Questo protocollo è utilizzato con successo per rilevare quantitativamente i livelli e dei modelli spaziali di espressione di mRNA in diversi tipi di tessuto in tutta specie di vertebrati. Il metodo può rilevare trascrizioni poco abbondanti e permette l&#39;elaborazione di centinaia di diapositive simultaneamente. Vi presentiamo questo protocollo con profilo di espressione di aviaria formazione del cervello dell&#39;embrione come esempio.

Radioattivo In situ Ibridazione per il rilevamento Diversi schemi di espressione genica nei tessuti

Conoscere i tempi, i livelli, la localizzazione cellulare e il tipo di cellula in cui un gene è espresso contribuisce alla comprensione della funzione di tale gene. ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare le regioni di espressione genica specifica e caratterizzare i tempi e i livelli di espressione genica al fine di contribuire alla comprensione della funzione genica. Ciò si ottiene raccogliendo e preparando rapidamente il tessuto da utilizzare nella procedura, preservandone l'integrità. Come secondo passaggio, il tessuto viene trattato per ridurre il legame di fondo delle sonde ribonucleotidiche.Successivamente, le sonde ribo vengono ibridate con il tessuto e il legame della sonda RIBA viene visualizzato. L'utilizzo di pellicole a raggi X o di emulsioni sensibili alla luce consente di ottenere risultati che mostrano la localizzazione e il livello di espressione genica in base a immagini a raggi X o all'analisi mediante microscopia in campo chiaro e in campo scuro. Utilizzando il software Image J, ci sono diversi passaggi critici che devono essere eseguiti correttamente e che spesso vengono sbagliati; uno di questi è la prevenzione del fondo.Esistono diversi passaggi che possono generare rumore di fondo, come una fissazione inadeguata o un'ibridazione a temperatura non corretta. Un altro fattore è la contaminazione da RNA, che degrada la sonda di RNA. Pertanto, è necessario prestare attenzione a mantenere tutto privo di RNAsi.E il terzo punto è che, quando le vetture vengono immerse nell'emulsione, è necessario assicurarsi che non vi siano fughe di luce nella stanza buia o esposizione all'emulsione durante tutte le fasi del processo, che può durare fino a tre settimane. A dimostrare questa tecnica sarà Hun Chen, un ricercatore postdottorato nel mio laboratorio. Dopo aver prelevato un cervello fresco e averlo risciacquato una volta in PBS, incorporare il cervello in un mezzo OCT Tissue-Tek immergendo il cervello in uno stampo contenente il mezzo a temperatura ambiente.Assicurarsi che il cervello sia orientato correttamente per il sezionamento. Successivamente, dopo aver spruzzato l'anidride carbonica solida con etanolo, congelare il tessuto posizionando il blocco nella miscela di etanolo e anidride carbonica solida. Con attenzione a non far entrare l'etanolo all'interno del blocco, sezionare il tessuto congelato in sezioni spesse da 10 a 12 micron utilizzando un criostato e montarle su vetrini super plus per tessuto cerebrale e tessuto embrionale.La temperatura ottimale di taglio è compresa tra meno 18 gradi Celsius e meno 20 gradi Celsius. Conservare le sezioni in una scatola porta-oggetti a meno 80 gradi Celsius. Trasferire gli oggetti porta-oggetti dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius su un supporto metallico in ghiaccio secco.Quindi, lavorando in una cappa certificata, posizionare il supporto in una soluzione di paraformaldeide al 4% preriscaldata di tre-cinque gradi Celsius rispetto alla temperatura ambiente. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente; al termine dell'incubazione, rimuovere il supporto dalla paraformaldeide e lavare i vetrini immergendo il supporto in PBS per 15 volte. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte, utilizzando ogni volta una soluzione fresca di PBS.Successivamente, immergere i vetrini in un bagno di acetilazione appena preparato per 10 minuti per ridurre il legame non specifico della sonda RIBA. Quindi lavare i vetrini come in precedenza, ma questa volta utilizzando SSPE due volte come soluzione di lavaggio. Disidratare il tessuto mediante una serie di etanolo al 70, 95 e 100% per due minuti in ciascuna soluzione.Quindi asciugare le lamelle in cappa per almeno da 10 a 15 minuti. Dopo aver sintetizzato la sonda RIBA, in base alle istruzioni riportate nel protocollo scritto, calcolare il volume richiesto di sonda RIBA e di soluzione di ibridazione necessario per tutte le lamelle. Riscaldare preventivamente la miscela di ibridazione con la sonda Ribo a 65 gradi Celsius per cinque minuti.Per denaturare la sonda Ribo, pipettare 100 microlitri della soluzione di ibridazione della sonda Ribo e allinearla sul vetrino coprioggetto. Quindi utilizzare un secondo vetrino coprioggetto per distribuire uniformemente la soluzione sul tessuto e sul vetrino. Posizionare il vetrino in posizione orizzontale e rivolto verso l'alto in una griglia metallica e, una volta pronti tutti i vetrini, immergere lentamente la griglia in un bagno d'olio a 65 gradi Celsius per un minimo di quattro ore e un massimo di 16 ore.L'olio crea una sigillatura ermetica attorno alle lamelle dopo l'incubazione; rimuovere l'eccesso di olio dalla griglia metallica contenente i vetrini. Quindi posizionare la griglia in un contenitore di vetro o metallo contenente cloroformio sotto cappa chimica. Ripetere il lavaggio utilizzando un secondo contenitore con cloroformio fresco.Successivamente, immergere il supporto in una soluzione di 0,1% betta me cap in etanolo più SSPE 2x per allentare le lamelle e sciogliere la soluzione di ibridazione in eccesso. Trasferire quindi i vetrini in una seconda soluzione fresca di 0,1% betta me cap in etanolo più SSPE 2x. Posizionare i vetrini senza lamella in un supporto nuovo all'interno di una vaschetta contenente 0,1% beta macca TER etanolo in SSPE 2x, incubando questa soluzione per un'ora a temperatura ambiente per rimuovere la sonda a RNA marcata in eccesso non legata.Quindi trasferire il supporto dei vetrini nella soluzione pre-riscaldata di SSPE 2× contenente il 50% di soluzione principale per ampie superfici a 65 gradi Celsius, aggiungendo beta-ME (captoetanolo) a una concentrazione finale dello 0,1%, e incubare a 65 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione, scartare questa e tutte le precedenti soluzioni di lavaggio acquose, insieme ai coverslip, come rifiuto radioattivo. Successivamente, lavare i vetrini due volte in SSPE 0,1× pre-riscaldata a 65 gradi Celsius, per 30 minuti ciascuna. Quindi disidratare il tessuto mediante una serie di etanolo al 70%, 95% e 100%, lasciando due minuti in ciascuna soluzione. Infine, asciugare i vetrini in una cappa per almeno 30 minuti. Prima di tutto, determinare se nel tessuto è presente un segnale radioattivo.Posizionare i vetrini essiccati in una cassetta per pellicola, operando in una stanza oscura utilizzando una luce sicura; posizionare la pellicola radiografica sopra i vetrini. Assicurarsi che i vetrini siano rivolti verso il lato emulsione della pellicola, quindi chiudere la cassetta. Esporre i vetrini alla pellicola per uno a sette giorni, a seconda dell'abbondanza prevista dei trascritti.Al termine dell'esposizione, sviluppare la pellicola a raggi X in un rivelatore standard e fissarla. Il segnale di ibridazione apparirà come aree nere sulla pellicola, risultanti dai granuli d'argento esposti nell'emulsione, vicino a determinare la risoluzione cellulare e per osservare il segnale stesso sul tessuto. I vetrini vengono immersi in un'emulsione fotografica e quindi controcolorati.Se i vetrini devono essere controcolorati con violetto di cresile, allora le sezioni devono essere desincronizzate seguendo le istruzioni del protocollo scritto. A questo punto, lavorando in stanza buia, versare acqua distillata in un tubo. Prelevare l'emulsione uc NTB e diluire l'emulsione con acqua distillata in rapporto uno a uno.Dopo aver sciolto l'emulsione in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per 20-30 minuti, trasferirla in un contenitore di vetro per immersione posto in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per 20-30 minuti. Il livello dell'emulsione diluita dovrebbe ora ricoprire tutte le sezioni su un vetrino quando quest'ultimo viene immerso. Se sono presenti molti vetrini, potrebbe essere necessaria una quantità aggiuntiva di emulsione.Ora immergere i vetrini nell'emulsione diluita in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius, quindi asciugare i vetrini in un contenitore chiuso al riparo dalla luce, durante la notte in una stanza buia, oppure in un forno a 37 gradi Celsius per due o tre ore con le luci spente. Dopo l'essiccazione, trasferire i vetrini in una scatola per vetrini. Sigillare i bordi con nastro isolante nero e quindi ricoprirli con carta d'alluminio.Conservare le lastre a quattro gradi Celsius per diversi giorni o settimane prima dello sviluppo; scaldare quindi le lastre a temperatura ambiente. Successivamente, lavorando in stanza buia, rimuovere dalla scatola il portavetrini contenente le lastre e svilupparle nel rivelatore codec D 19 a 16 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Successivamente, lavare le lastre sviluppate in acqua corrente a temperatura ambiente per un minuto.Quindi incubare i vetrini due volte nella soluzione fissante a 19 gradi Celsius per sei minuti ciascuna; le luci della stanza possono essere accese durante la seconda incubazione con il fissatore. Ora lavare i vetrini in acqua corrente a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Poi, utilizzando una lametta, raschiare l'emulsione dalla parte posteriore del vetrino mentre è ancora bagnato.Infine, eseguire la colorazione di contrasto con violetto di cristallo allo 0,3%, quindi disidratare e montare i vetrini seguendo le istruzioni riportate nel protocollo scritto, se necessario. Rimuovere ulteriormente qualsiasi eccesso di emulsione sul retro dei vetrini bagnandoli con acqua e raschiando con una lametta. Risciacquare i vetrini in soluzione di etanolo all'80% e asciugarli delicatamente una o due volte per eliminare detriti e polvere.Scattare immagini in illuminazione in campo oscuro o in campo chiaro. I passaggi di raschiatura e pulizia potrebbero dover essere ripetuti due o tre volte per ottenere immagini di buona qualità prive di particelle di polvere, che sono facilmente visibili in campo oscuro al microscopio stereoscopico. Le seguenti immagini sono esempi di autoradiografie di ibridazione in situ ottenute da pellicole a raggi X.Questa immagine su pellicola a raggi X mostra una sezione sagittale dell'intera testa del passero zebra, un uccello canoro, al giorno embrionale 10, ibridata con una sonda riboprobe antisenso per Fox P1. I granuli neri visibili sulla pellicola indicano l'espressione dell'mRNA, che come si può osservare nei quattro principali compartimenti cerebrali, risulta arricchita nel mesoalio striato e nel talamo dorsale. L'immagine della pellicola a raggi X mostra una sezione dello stesso passero zebra ibridata con la sonda RIBA da 90 centesimi per Cuper.TF due Co.TF due è arricchito nella regione dell'alium palatum e nella parte più ventrale del talamo. Le seguenti immagini sono esempi di autoradiografia di ibridazione in situ ottenute da vetri coprioggetti trattati con emulsione. Questa immagine in campo scuro, acquisita al microscopio stereoscopico, mostra una sezione sagittale dell'intera testa di un fringuello zebra al sesto giorno dopo la schiusa, ibridata con una sonda RIBA senso inverso per Fox P uno.I granuli argentati bianchi esposti nell'emulsione sopra il tessuto mostrano l'espressione dell'RNA messaggero. Il colore rosso rappresenta la colorazione con violetto di kreosolo. La barra della scala rappresenta un millimetro.Qui l'immagine mostra una sezione dello stesso uccello canoro, il fringuello zebra, ibridata con una sonda riboprova antisenso per Coop TF due. Le immagini seguenti confrontano l'etichettatura antisenso e senso, che mostra diversi pattern nell'autoradiografia su pellicole a raggi X di sezioni del cervello di fringuello zebra prelevate al giorno embrionale 12. La linea tratteggiata indica il contorno dell'intero cervello e la C indica il cervelletto.Si può osservare che il filamento antisenso di PAC sei è espresso nel cervello, in particolare nella zona ventricolare. La sezione adiacente ibridizzata con il filamento senso di PAC sei non mostra espressione di fondo in tutta la testa dell'embrione, ma una chiara espressione nello strato pigmentato della retina, contrariamente al filamento antisenso. Le seguenti immagini mostrano in C due segnali di espressione genica e diapositive ricoperte di emulsione ottenute dal cervello del fringuello zebra durante le fasi embriologiche avanzate, osservate in campo chiaro e in campo scuro.Questa immagine in campo chiaro mostra l'espressione di D one B al giorno embrionale 10. Da un'esposizione normale all'emulsione, l'etichetta che appare nera è a malapena visibile a questo ingrandimento. Questa immagine mostra una sezione e un ingrandimento identici a quelli della precedente immagine, ma in vista in campo scuro, in cui l'etichettatura appare bianca nello striato e nel talamo.Questa immagine in campo chiaro mostra l'espressione di slit tre all'undicesimo giorno embrionale. Dopo un'eccessiva esposizione all'emulsione, l'etichetta nera è facilmente visibile. SC indica la posizione del midollo spinale e CB indica la posizione del cervelletto.La parte rostrale è orientata a sinistra. L'immagine mostrata qui corrisponde alla stessa sezione, con un'ingrandimento identico, ma visualizzata in campo scuro, in cui l'etichettatura appare in bianco nel midollo spinale, corrispondente all'immagine in campo chiaro. Le immagini seguenti mostrano la risoluzione dei granuli argentici a livello cellulare.Qui è mostrato l'etichettamento del messenger RNA di Fox P1 nei granuli d'argento nel proencefalo del fringuello zebra; i granuli d'argento appaiono come puntini neri sopra le cellule colorate con violetto di cresta. Questa immagine mostra un'espressione ad alta abbondanza su singole cellule nel mesoalio del fringuello zebra adulto. Questa immagine mostra un'espressione a bassa abbondanza su singole cellule nell'alio adiacente della stessa sezione qui.Ciao Fox. L'espressione dell'RNA messaggero P1 è visibile nelle cellule all'interno del mesenchima all'12° giorno embrionale.Le cellule embrionali visibili in questa immagine sono più piccole e più strettamente impacchettate rispetto alle cellule adulte mostrate nelle due immagini precedenti. Infine, questa immagine mostra un'espressione a bassa abbondanza sulle cellule nell'alium adiacente della stessa sezione. Dopo aver seguito questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'immunochimica, per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio in quale tipo cellulare viene espressa la sequenza genica bersaglio.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'ibridazione in situ. Non dimenticare che lavorare con reagenti radioattivi può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale devono essere sempre adottate durante questa procedura.

radioactive-situ-hybridization-for-detecting-diverse-gene-expression

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ibridazione in situ per la localizzazione precisa delle Trascrizioni nelle piante

Questo video descrive una strategia di ibridazione sequenziale che prevede l'ibridazione di sonde di mRNA su mRNA target specifici. Dopo l'ibridazione della sonda, viene eseguita l'amplificazione del segnale per migliorare la risoluzione attraverso la riduzione del rapporto segnale/rumore durante l'RNA-CISH dei campioni istologici.

Ibridazione con sonda e amplificazione del segnale nell'ibridazione in situ dell'RNA: una tecnica per rilevare specifiche sequenze di RNA in sezioni di tessuto

Questo video presenta il protocollo per la rilevazione del segnale durante l'ibridazione in situ cromogenica dell'RNA. Questa tecnica può essere utilizzata per diagnosticare visivamente un'infezione oncogena attiva in un campione di tessuto intatto.

Rilevamento del segnale RNA CISH: una tecnica per rilevare i segnali cromogenici durante l'ibridazione in situ dell'RNA in campioni di tessuto intatto

Qui si descrive un insieme di montaggio...

Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Localizzare l'espressione genica in specifici tipi di cellule può essere difficile a causa della mancanza di anticorpi specifici. Qui descriviamo un protocollo per la tripla rilevazione simultanea dell'espressione genica combinando l'ibridazione in situ a doppia fluorescenza con l'immunocolorazione.

La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

Il protocollo descritto di RNA in situ ibridazione del permette la rilevazione del RNA in embrioni della drosofila interi o tessuti dissecati. Utilizzando piastre microtiter a 96 pozzetti e amplificazione del segnale di microarray, trascrizioni possono essere rilevate alla velocità effettiva, sensibilità e alta risoluzione e ad un costo relativamente basso.

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

Qui, descriviamo un in situ di ibridazione test che consente la rivelazione sensibile e specifica delle sequenze più breve 50 nucleotidi con risoluzione del singolo-nucleotide a livello di singola cellula. L'analisi, che possono essere eseguita manualmente o automaticamente, può abilitare la visualizzazione delle varianti di splicing, brevi sequenze e mutazioni all'interno del contesto del tessuto.

Visualizzazione di varianti genetiche, gli obiettivi di brevi e mutazioni puntiformi nel contesto morfologico del tessuto con una determinazione del RNA In Situ di ibridazione

Il protocollo descrive un test di ibridazione in immunofluorescenza tandem con tessuto incluso in paraffina fissato in formalina per rilevare e quantificare contemporaneamente microRNA e proteine multiplexate.

Amplificazione e riconoscimento dei microRNA attraverso l'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato come nuovo metodo di rilevamento e quantificazione

Questa procedura descrive come stabilire colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino ed è seguita dalla trasfezione con il gene Pulser sistema di elettroporazione MXCell.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

Non radioattivo In situ Protocollo di ibridazione applicabile per la Norvegia Abete e una serie di specie di piante

Scopri l'ibridazione in situ radioattiva per rilevare schemi di espressione genica nei tessuti vertebrati. Questo metodo quantitativo identifica trascritti a bassa abbondanza preservando l'integrità tissutale.

Radioattivo In situ Ibridazione per il rilevamento Diversi schemi di espressione genica nei tessuti

Esplora altri video