Radioattivo In situ Ibridazione per il rilevamento Diversi schemi di espressione genica nei tessuti

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare le regioni con espressione genica particolare e caratterizzare i tempi e i livelli di espressione genica al fine di contribuire alla comprensione della funzione genica. Questo risultato si ottiene raccogliendo e preparando rapidamente il tessuto da utilizzare nella procedura, preservandone l'integrità. Come secondo passaggio, il tessuto viene trattato per ridurre il legame di fondo delle sonde ribonucleotidiche.

Successivamente, le sonde ribo vengono ibridate con il tessuto e il legame della sonda RIBA viene visualizzato. L'utilizzo di pellicole a raggi X o di emulsioni sensibili alla luce consente di ottenere risultati che mostrano la localizzazione e il livello di espressione genica in base a immagini a raggi X o all'analisi mediante microscopia in campo chiaro e in campo scuro. Utilizzando il software Image J, ci sono diversi passaggi critici che devono essere eseguiti correttamente e che spesso vengono sbagliati; uno di questi è la prevenzione del fondo.

Quindi esistono diversi passaggi che possono generare rumore di fondo, come una fissazione inadeguata o un'ibridazione a temperatura non ottimale. Un altro fattore è la contaminazione da RNA, che degrada la sonda di RNA. Pertanto, è necessario prestare attenzione a mantenere tutto privo di RNAsi.

E il terzo punto è che, quando le vetture vengono immerse nell'emulsione, è necessario assicurarsi che non vi siano fughe di luce nella stanza buia o esposizione all'emulsione durante tutte le fasi del processo, che può durare fino a tre settimane. A dimostrare questa tecnica sarà Hun Chen, un ricercatore postdottorato nel mio laboratorio. Dopo aver prelevato un cervello fresco e averlo risciacquato una volta in PBS, incorporare il cervello in un mezzo OCT tissue tech immergendo il cervello in uno stampo contenente il mezzo a temperatura ambiente.

Assicurarsi che il cervello sia orientato correttamente per il sezionamento. Successivamente, dopo aver spruzzato l'anidride carbonica solida con etanolo, congelare il tessuto ponendo il blocco nella miscela di etanolo e anidride carbonica solida. Con attenzione a non far entrare l'etanolo all'interno del blocco, sezionare il tessuto congelato in sezioni spesse da 10 a 12 micron utilizzando un criostato e montarle su vetrini super plus per tessuto cerebrale e tessuto embrionale.

La temperatura ottimale di taglio è compresa tra -18 °C e -20 °C. Conservare i campioni in una scatola per vetrini a -80 °C. Trasferire i vetrini dallo stoccaggio a -80 °C su una griglia metallica posta sul ghiaccio secco.

Quindi, lavorando in una cappa certificata, posizionare il rack in una soluzione di paraformaldeide al 4% preriscaldata di tre-cinque gradi Celsius rispetto alla temperatura ambiente. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente; al termine dell'incubazione, rimuovere il rack dalla paraformaldeide e lavare i vetrini immergendo il rack nel PBS per 15 volte. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte, utilizzando ogni volta una soluzione fresca di PBS.

Successivamente, immergere i vetrini in un bagno di acetilazione appena preparato per 10 minuti al fine di ridurre il legame non specifico della sonda RIBA. Quindi lavare i vetrini come in precedenza, ma questa volta utilizzando SSPE due volte come soluzione di lavaggio. Disidratare il tessuto mediante una serie di etanolo al 70, 95 e 100% per due minuti in ciascuna soluzione.

Quindi asciugare i vetrini nella cappa per almeno da 10 a 15 minuti. Dopo aver sintetizzato la sonda RIBA, in base alle istruzioni riportate nel protocollo scritto, calcolare il volume richiesto di sonda RIBA e di soluzione di ibridazione necessario per tutti i vetrini. Predisporre il mix di ibridazione della sonda Ribo riscaldandolo a 65 gradi Celsius per cinque minuti.

Per denaturare la sonda Ribo, pipettare 100 microlitri della soluzione di ibridazione della sonda Ribo e allinearla sul vetrino coprioggetto. Successivamente, utilizzare un secondo vetrino coprioggetto per distribuire uniformemente la soluzione sul tessuto e sul vetrino. Posizionare il vetrino in posizione orizzontale e rivolto verso l'alto in una griglia metallica e, una volta pronti tutti i vetrini, immergere lentamente la griglia in un bagno d'olio a 65 gradi Celsius per un minimo di quattro ore e un massimo di 16 ore.

L'olio crea una sigillatura stagna intorno alle lamelle dopo l'incubazione, rimuovendo l'eccesso di olio dalla griglia metallica contenente i vetrini. Quindi posizionare la griglia in un contenitore di vetro o metallo contenente cloroformio all'interno di una cappa chimica. Ripetere il lavaggio utilizzando un secondo contenitore con cloroformio fresco.

Successivamente, immergere il supporto in una soluzione di 0,1% betta me cap in etanolo più SSPE 2x per allentare le lamelle e sciogliere l'eccesso di soluzione di ibridazione. Trasferire quindi i vetrini in una seconda soluzione fresca di 0,1% betta me cap in etanolo più SSPE 2x. Posizionare i vetrini senza coprioggetto in un supporto nuovo all'interno di un vassoio contenente 0,1% beta macca TER etanolo in SSPE 2x, incubando questa soluzione per un'ora a temperatura ambiente per rimuovere l'eccesso di sonda a RNA non legato.

Quindi trasferire il supporto dei vetrini nella soluzione pre-riscaldata di SSPE 2x più soluzione principale al 50% a 65 gradi Celsius contenente beta ME captoetanolo a una concentrazione finale dello 0,1% e incubare a 65 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione, scartare questa e tutte le precedenti soluzioni di lavaggio acquose, nonché i coverslip, come rifiuti radioattivi. Successivamente, lavare i vetrini due volte in SSPE 0,1x pre-riscaldata a 65 gradi Celsius, per 30 minuti ciascuna.

Quindi disidratare il tessuto mediante una serie di etanolo al 70%, 95% e 100%, lasciando due minuti in ciascuna soluzione. Infine, asciugare le vetture in una cappa per almeno 30 minuti. Prima, determinare se nel tessuto è presente un segnale radioattivo.

Posizionare i vetrini essiccati in una cassetta per pellicola, operando in una stanza oscura utilizzando una luce sicura, e coprire i vetrini con una pellicola radiografica. Assicurarsi che i vetrini siano a contatto con il lato emulsione della pellicola, quindi chiudere la cassetta. Esporre i vetrini alla pellicola per uno a sette giorni, a seconda dell'abbondanza prevista dei trascritti.

Al termine dell'esposizione, sviluppare la pellicola a raggi X in un rivelatore standard e fissarla. Il segnale di ibridazione apparirà come aree nere sulla pellicola, risultanti dai granuli d'argento esposti nell'emulsione, vicino a determinare la risoluzione cellulare e per osservare il segnale stesso sul tessuto. I vetrini vengono immersi in un'emulsione fotografica e quindi colorati con una colorazione di contrasto.

Se i vetrini devono essere controcolorati con violetto di cresile, allora le sezioni devono essere deliquenate seguendo le istruzioni riportate nel protocollo scritto. A questo punto, lavorando in stanza buia, versare acqua distillata in un tubo. Prelevare l'emulsione uc NTB ed diluire l'emulsione con acqua distillata in rapporto uno a uno.

Dopo aver sciolto l'emulsione in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per 20-30 minuti, trasferirla in un contenitore di vetro per immersione posto in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per 20-30 minuti. Il livello dell'emulsione diluita dovrebbe ora ricoprire tutte le sezioni su un vetrino quando quest'ultimo viene immerso. Se si dispone di un numero elevato di vetrini, potrebbe essere necessaria dell'emulsione aggiuntiva.

Ora immergere i vetrini nell'emulsione diluita in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius, quindi asciugare i vetrini in un contenitore chiuso, impermeabile alla luce, durante la notte nella stanza buia oppure in un forno a 37 gradi Celsius per due o tre ore con le luci spente. Dopo l'essiccazione, trasferire i vetrini in una scatola per vetrini. Sigillare i bordi con nastro isolante nero e quindi ricoprirli con carta d'alluminio.

Conservare le lastre a quattro gradi Celsius per alcuni giorni fino a diverse settimane prima di svilupparle; scaldare quindi le lastre a temperatura ambiente. Successivamente, lavorando al buio, rimuovere dalla scatola il portavetrini contenente le lastre e svilupparle nel rivelatore codec D 19 a 16 gradi Celsius per tre-cinque minuti. In seguito, lavare le lastre sviluppate in acqua corrente a temperatura ambiente per un minuto.

Quindi incubare i vetrini due volte nella soluzione fissativa a 19 gradi Celsius per sei minuti ciascuna; le luci della stanza possono essere accese durante la seconda incubazione con il fissatore. A questo punto, lavare i vetrini in acqua corrente a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Successivamente, utilizzando una lametta, raschiare l'emulsione dalla parte posteriore del vetrino mentre è ancora bagnato.

Infine, eseguire la controstaining con violetto di cristallo 0,3%, quindi disidratare e montare i vetrini seguendo le istruzioni riportate nel protocollo scritto, se necessario. Rimuovere ulteriormente qualsiasi eccesso di emulsione sul retro dei vetrini bagnandoli con acqua e raschiando con una lametta. Risciacquare i vetrini in soluzione di etanolo all'80% e asciugare delicatamente una o due volte per eliminare detriti e polvere.

Scattare immagini in illuminazione in campo scuro o in campo chiaro. I passaggi di raschiatura e pulizia potrebbero dover essere ripetuti due o tre volte per ottenere immagini di buona qualità senza particelle di polvere, che sono facilmente visibili in campo scuro al microscopio stereoscopico. Le seguenti immagini sono esempi di autoradiografia di ibridazione in situ ottenute da pellicole a raggi X.

Questa immagine su pellicola a raggi X mostra una sezione sagittale dell'intera testa del fringuello zebra, un uccello canoro, al giorno embrionale 10, ibridata con una sonda riboprobe antisenso per Fox P1. I granuli neri esposti sulla pellicola indicano l'espressione dell'RNA messaggero, visibile nelle quattro aree cerebrali. L'RNA messaggero di Fox P1 è arricchito nel mesoallio striato e nel talamo dorsale qui mostrato. L'immagine su pellicola a raggi X mostra una sezione dello stesso fringuello zebra ibridata con la sonda RIBA da 90 centesimi per Cuper.

TF due Co.TF due è arricchito nella regione del palam alium e nella parte più ventrale del talamo. Le seguenti immagini sono esempi di autoradiografia di ibridazione in situ ottenuta mediante immersione in emulsione. Questa immagine in campo scuro, acquisita al microscopio stereoscopico, mostra una sezione sagittale dell'intera testa del fringuello zebra a sei giorni dopo la schiusa, ibridata con una sonda RIBA antisenso per Fox P uno.

I granuli d'argento bianchi esposti nell'emulsione sopra il tessuto mostrano l'espressione dell'RNA messaggero. Il colore rosso rappresenta la colorazione con violetto di kressel. La barra della scala rappresenta un millimetro.

Qui l'immagine mostra una sezione dello stesso uccello canoro, il fringuello zebra, ibridata con una sonda riboprova antisenso per Coop TF2. Le immagini seguenti confrontano l'etichettatura antisenso e senso, che mostra diversi schemi nell'autoradiografia su pellicole a raggi X di sezioni del cervello di fringuello zebra prelevate al giorno embrionale 12. La linea tratteggiata indica il contorno dell'intero cervello e la C indica il cervelletto.

Si può osservare che il filamento antisenso di PAC sei è espresso nel cervello, in particolare nella zona ventricolare. La sezione adiacente ibridata con il filamento senso di PAC sei non mostra espressione di fondo in tutta la testa dell'embrione, ma una chiara espressione nello strato pigmentato della retina, a differenza del filamento antisenso. Le immagini seguenti mostrano in C due segnali di espressione genica e vetrini ricoperti di emulsione provenienti dal cervello del fringuello zebra durante le fasi embriologiche avanzate, osservati in campo chiaro e in campo scuro.

Questa immagine in campo chiaro mostra l'espressione di D one B al giorno embrionale 10. Da un'esposizione normale all'emulsione, l'etichetta che appare nera è a malapena visibile a questo ingrandimento. Questa immagine mostra una sezione e un ingrandimento identici a quelli della precedente immagine, ma in vista in campo scuro, in cui l'etichettatura appare bianca nello striato e nel talamo.

Questa immagine in campo chiaro mostra l'espressione di slit tre al giorno embrionale 12. Dopo un'eccessiva esposizione all'emulsione, l'etichetta nera è facilmente visibile. SC indica la posizione del midollo spinale e CB indica la posizione del cervelletto.

La parte rostrale è orientata a sinistra. L'immagine mostrata qui corrisponde alla stessa sezione e alla stessa ingrandimento vista in precedenza, ma passata alla visione in campo scuro, che mostra l'etichettatura in bianco nel midollo spinale, corrispondente all'immagine in campo chiaro. Le immagini seguenti mostrano la risoluzione dei granuli argentici a livello cellulare.

Qui è mostrato l'etichettamento del messenger RNA di Fox P1: i granuli d'argento appaiono come punti neri sopra le cellule colorate con violetto di cresile. Questa immagine mostra un'espressione ad alta abbondanza su singole cellule nel mesoalio dell'uccello zebra adulto. Questa immagine mostra un'espressione a bassa abbondanza su singole cellule nell'alio adiacente della stessa sezione qui.

Ciao Fox. L'espressione del messaggero P uno dell'RNA è osservata nell'endoderma mesenchimale al giorno embrionale 12.

Le cellule embrionali visibili in questa immagine sono più piccole e più strettamente impacchettate rispetto alle cellule adulte mostrate nelle due immagini precedenti. Infine, questa immagine mostra un'espressione a bassa abbondanza sulle cellule nell'alium adiacente della stessa sezione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'immunochimica, al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio su quale tipo cellulare viene espressa la sequenza genica bersaglio.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'ibridazione in situ. Non dimenticare che lavorare con reagenti radioattivi può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale devono essere sempre adottate durante questa procedura.