Name: Profiling tiolo Proteome Redox Utilizzando tag spettrometria di massa isotopica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Scopri il profilo del proteoma redox in piante di pomodoro infettate con Pseudomonas syringae utilizzando la marcatura cysTMT e la spettrometria di massa. Questo metodo permette di analizzare le proteine regolate dal redox su larga scala.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Greg Martin (Cornell University) e il suo gruppo per aver fornito il ceppo DC3000, semi di pomodoro, e consiglio. Si desidera inoltre ringraziare il Dr. Zhonglin Mou per un aiuto con il protocollo DAB e la Divisione Proteomics UF presso il Centro Interdisciplinare per la Ricerca in Biotecnologie per l&#39;assistenza allo sviluppo del metodo. Il protocollo per l&#39;estrazione delle proteine ​​è stato modificato dal Hurkman e Tanaka 16. Il protocollo sulla cysTMT etichettatura, a pochi passi da 4 a 6 è stato adattato in base al prodotto originale Thermo Fisher Scientific manuale Pierce 17. Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation (MCB 0.818.051 a S Chen).

1. Piantine in crescita e batteri Preparazione <ol><li> Piantine sono germinati in metromix 500 miscela di sporco (Aziende BWI) in una camera di crescita (160 fotoni micromoli m -2 s -1 con un fotoperiodo di 8 ore di luce solare a 22 ° C e 16 ore di buio a 20 ° C per 1 settimana. Relativa umidità è stato impostato al 70%. piantine sono state annaffiate con acqua di rubinetto come necessario per mantenere il terreno diventi secca. </li><li> Due pianticelle di dimensioni simili vengono trapiantate a 4 &quot;vasi contenenti il ​​diametro metromix 500 terreno e coltivate per ulteriori 3 settimane nelle stesse condizioni 1,1. </li><li> Pseudomonas syringae (Pst) è inizialmente T-striato sul Kings B Medio (KBM) piastre per litro: 20 g PROTEOSE Peptone, 0,1975 g MgSO 4, 1% glicerolo, 1,5 g di K 2 HPO 4, Agar 18 g) e coltivate per due giorni a 28 ° C. Una singola colonia viene raccolto, mescolato in 300μl Kings liquido B Medium (20 g PROTEOSE peptone, 0,1975 g MgSO 4 </sub&gt;, glicerolo 10 mL, 10 mL di 100x K 2 HPO 4 archivio (1,5 g di K 2 HPO 4 in 10 mL di H 2 O), e diffuso su una piastra Kings B medio. Questo viene coltivato durante la notte a 28 ° C. </li><li> L&#39;inoculo viene preparato batteri raschiando i batteri coltivati ​​dalla piastra KBM in 20 mL H 2 O. Un OD 600 di 0,03 (~ 10 6 cfu / ml) viene preparato in 1 L di tampone di inoculazione (10 mM MgCl 2 + 400 microlitri Silwett-70). L&#39;inoculazione del buffer meno batteri è stata preparata per la soluzione di controllo. </li></ol> 2. Inoculazione di pomodoro con Pst e H 2 O 2 istochimica Stain <ol><li> Quattro settimane di età piante sono state inoculate mediante immersione nella soluzione inoculazione sopra per 30 secondi. Sacchetti di plastica sono state messe sopra le piante immediatamente dopo l&#39;inoculazione. </li><li> 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidina (DAB) macchia 11 è stato preparato (1 mg / ml DAB in H 2 O, pH 3,8 (HCl)) tre days prima dell&#39;uso per avere solubilità completa. La soluzione è stata scossa per miscelare a temperatura ambiente. </li><li> Ventiquattro ore dopo il trattamento, la foglia completamente espansa è stato rimosso, posto in DAB lato macchiato epidermica, e infiltrato vuoto per 15 min. Le foglie sono poi stati messi al buio a temperatura ambiente per tutta la notte per la colorazione. </li><li> Le foglie sono stati bolliti in 95% etanolo per 10 minuti, e quindi tenuti in etanolo al 75%. </li></ol> 3. Estrazione delle proteine <ol><li> Dopo la raccolta, foglia di pomodoro sono state polverizzato con azoto liquido usando mortaio e pestello. </li><li> Per 0,5 g di tessuto, aggiungere 1,25 ml di Tris pH 8,8 tamponata fenolo e 1,25 mL / 0,5 g di tampone di estrazione (0,1 M Tris-HCl pH 8,8, 10 mM EDTA, 0,9 M saccarosio), poi proseguire macinazione per qualche minuto in un più cappa. </li><li> Trasferire l&#39;estratto di centrifuga tubo Oakridge (Thermo Fisher Scientific Company Nalgene) ed agitare per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare a 5000 xge 15 ° C per 10 min. Trasferire la fase superiore fenolo in una nuova provetta pulita. </li><li> Back-estrae la fase acquosa estratta con un volume uguale tampone fenolo; agitate su un agitatore per 30 min. Centrifugare e trasferire l&#39;estratto in una nuova provetta Falcon. </li><li> Ripetere il passaggio precedente ancora una volta e trasferire l&#39;estratto di nuovo tubo Oakridge. </li><li> Fenolo precipitare le proteine ​​estratte con l&#39;aggiunta di 5 volumi di acetato di ammonio 0,1 M in metanolo 100% (conservato a -20 ° C). Vortex e incubare a -20 ° C per il pernottamento. </li><li> Raccogliere la proteina pellet mediante centrifugazione a 20.000 xg, a 4 ° C per 20 min. </li><li> Lavare i pellet 2 volte con il freddo acetato di ammonio 0,1 M in metanolo e 2 volte con l&#39;80% acetone freddo. Aggiungere 1,5 ml di etanolo freddo al 70% di pellet e sospendere. Trasferire in una provetta da microcentrifuga da 2 mL (USA Scientific) e centrifugare a 14.000 rpm, 4 ° C per 20 min. Eliminare l&#39;etanolo. </li><li> Asciugare brevemente il pellet in un concentratore SpeedVac e si dissolvono in un extr proteineun&#39;azione tampone, ad esempio ReadyPrep Protein Reagent Kit di estrazione 3 (8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris-base, tiourea 2 M) (Bio-Rad). Centrifugare a 14.000 rpm e 20 ° C per 30 minuti per formare un pellet. Raccogliere il surnatante. </li><li> Misurare la concentrazione di proteine ​​con un CB-X dosaggio di proteine ​​in base al manuale del costruttore (Geno Technology). </li></ol> 4. Preparazione del campione e Labeling Peptide con cysTMTs <ol><li> Preparare il campione di proteine ​​ad una concentrazione di 2-5 mg / pl. Qui usiamo 100 microgrammi di proteine ​​per ogni tag di massa, 20 campioni ul ul-50. Per questo esperimento, tutti i tag 6 sono stati utilizzati. </li><li> Aggiungere volume uguale di tampone alchilazione (100 mM Tris-HCl pH7.5, 200 mM di iodoacetammide) per il campione di proteina per bloccare il gruppo tiolo libero. Buffer deve essere preparato fresco. Alchilazione viene effettuata a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Precipitare la proteina aggiungendo 1 ml di acetone freddo 80% a -20 ° C per una notte. La proteina pellet mediante centrifugazione a 14.000rpm, 4 ° C per 20 min. Lavare 3 volte a pellet con l&#39;80% Acetone vortex ogni volta. Rimuovere il surnatante e permettere all&#39;aria quando asciutto su ghiaccio. </li><li> Risospendere il precipitato in 50 microlitri di tampone di lisi (6 M urea, 50 mM Tris base, 1 mM EDTA). 0,5 pl di 100 mM Tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP) viene poi aggiunto per ridurre i legami disolfuro mediante incubazione per un&#39;ora a temperatura ambiente. </li><li> Preparare i tag con l&#39;aggiunta di 20 microlitri di acetonitrile ai tubi di reagenti per solubilizzare i tag. Vortex e centrifugare fino in fondo. </li><li> Lavare TCEP usando un dispositivo Microcon centrifuga 3KD filtro (Millipore). Aggiungere 50 microlitri di campione colonna Microcon 3KD, e 50 pl di tampone di lisi alla colonna. Centrifugare per 15 min a 10.000 xg e 4 ° C. Ripetere questo passaggio per un totale di tre volte. Rimuovere colonna e invertire in una provetta pulita. Centrifugare per 5 min a 1000 xga 4 ° C. </li><li> Controllare il pH. Se necessario, regolare il pH a 7,0-8,0 con 1 M HCl. </li><li> Aggiungere 5 pl della cysTMReagente T per ogni campione (Il kit reagenti cysTMT dispone di 20 microlitri per i tag fino a 500 mg di proteine. Questo metodo utilizza il 100 pg di proteina, quindi usiamo un quinto del tag.). Lasciare la reazione per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> I campioni sono stati combinati con tampone per campioni di Laemmli (Bio-Rad) in un rapporto 1:1. </li></ol> 5. Eliminazione delle materie non ha reagito Frazionamento Tag Campione <ol><li> I campioni sono stati bolliti per 5 minuti e separato su un pre-cast gel di poliacrilammide 12% (Bio-Rad). Il gel è stato lavato tre volte in intervalli di 5 minuti con filtrato H 2 O e colorato con Coomassie Blue (Bio-Rad) per 1 ora. Il gel è stato de-macchiato durante la notte con H 2 O. </li><li> Dodici frazioni sono state raccolte da ogni corsia di gel. Le frazioni sono state determinate le concentrazioni di banda di proteina. Le frazioni sono state tagliate in pezzi 1mm e raccolto in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Pezzi di gel sono state de-tinto con 50% acetonitrile e di bicarbonato di ammonio 0,1 M in H 2 </sub&gt; O. Questa operazione deve essere ripetuta fino colore blu viene rimosso da pezzi gel (circa 3-4 volte, 15 minuti ogni volta). </li><li> De-gel macchiati pezzi sono stati essiccati utilizzando il 100% acetonitrile (coprire parti gel) per 15 min, surnatante eliminato, e le parti secche con una SpeedVac. </li><li> Sciogliere tripsina (Promega) a 1:10 (tripsina: proteina) il rapporto del volume stesso (come pool campione marcato) di 25 mM di bicarbonato di ammonio. Ad esempio, 600 pg di proteina campione con un volume di 500 pl bisogno di 60 ug tripsina sciolti in 500 pl di 25 mM di bicarbonato di ammonio. </li><li> Aggiungere la soluzione di tripsina ai pezzi gel e impostare sul ghiaccio per reidratare. Se i pezzi non sono coperti aggiungere 50 mM di tampone di bicarbonato di ammonio. Dopo la reidratazione, incubare a 37 ° C per 12-16 ore. </li><li> Rimuovere il liquido estratto dai campioni di proteine ​​incubate. </li><li> Bloccare la reazione e rimuovere qualsiasi residuo digest proteina coprendo pezzi gel con 5% acido formico, 50% acetonitrile .. Agitare pezzi gel per 20 min a temperatura TEmperature. Trasferire il surnatante ai tubi di proteine ​​estratte dal campione 5.7. Ripetere la procedura di estrazione due volte. Asciugare i peptidi estratti utilizzando il SpeedVac. </li></ol> 6. Arricchimento del campione di cysTMT etichetta-peptidi <ol><li> Aggiungere un gradiente di anti-TMT resina per provette da 0,5 ml per un impasto al 50%. (Gradiente è stata determinata dalla concentrazione di banda in gel frazionamento. Se una raccolta frazione costituita da una fascia scura, più resina è necessaria. Frazioni con deboli bande richiedono meno resina come c&#39;è meno proteina.) </li><li> La resina viene poi lavata tre volte con un volume di colonna 1x soluzione salina tamponata Tris (TBS) (25 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,2) (Pierce Thermo Scientific Research Products Protein). </li><li> Aggiungere 200 ul 1xTBS a ciascun campione. I campioni vengono quindi aggiunti anti-TMT resina (Thermo Scientific Products Pierce ricerca sulle proteine) e agitato a temperatura ambiente per 2 ore seguita da oscillare notte a 4 ° C. </li><li> Aggiungere il campione alla colonna (TheRMO scientifici Pierce prodotti proteici di ricerca). </li><li> Lavare ogni colonna tre volte con TBS 1x 200 pl. Segue poi con lavaggio tre volte con 0,05% CHAPS (disciolto in 1x TBS). </li><li> La colonna viene poi lavata tre volte con 4 M urea in 1x TBS. Duecento microlitri di H 2 O viene poi utilizzato per lavare la colonna tre volte. </li><li> Ogni campione viene eluito tre volte con 200 microlitri tampone di eluizione 50% (50% acetonitrile, 0,4% TFA). </li><li> I campioni vengono poi essiccati in un concentratore a vuoto. </li></ol> 7. Analisi di Spettrometria di Massa <ol><li> Risospendere i campioni in 12 pl del 3% acetonitrile con 0,1% di acido formico e iniettare 5 microlitri direttamente su un Eksigent nanoLC-1D colonna cromatografia liquida ad alta pressione (AB SCIEX, USA). </li><li> Peptidi sarà separata su una colonna C18 II Proteopep ID 75 um x 20 cm (Nuovo obiettivo, USA) utilizzando un gradiente 4-60% (A: acetonitrile 3%, 0,1% di acido formico; B: 97% acetonitrile, 0,1% formico acido)a 3 pl / min per 60 minuti. </li><li> A Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL spettrometro di massa è stata utilizzata per rilevare peptidi utilizzando un top 2 x 3 esperimento costituito da stage MS singolo seguito da acquisizione di 3 MS / MS con una maggiore energia C-trap dissociazione (HCD) la frammentazione seguita da 3 MS / MS con la dissociazione indotta da collisione (CID) per l&#39;identificazione delle proteine. I parametri in questa modalità sono: larghezza Isolamento: 3,0 m / z; energia di collisione: 50% (10% con due passaggi). Peptidi Solo doppiamente e triplamente-caricate sono stati selezionati per la frammentazione. Parametri dinamici di esclusione sono stati fissati per: Ripetere count = 1; durata della ripetizione = 60; list size esclusione = 500; Esclusione durata = 28. Valori target sono i seguenti: MS = 5 e 5; MS / MS (HCD) = 1 e 5. Tempi di trasferimento di ioni sono stati fissati a 500 e 300 per FTMS per MS / MS (HCD). Due microscans sono stati richiesti per spettri HCD. </li></ol> 8. Ricerca nel database e quantificazione <ol><li> I dati acquisiti CID e HCD eranonalyzed con Thermo Scientific software Discoverer Proteome 1.2 (Thermo Scientific Pierce Prodotti ricerca sulle proteine) attraverso un flusso di lavoro ramificata che ha attuato uno Reporter Ion quantizer (20 ppm tolleranza di massa di ioni frammento) per quantificare il rapporto. Un segmento separato elaborato il MS 2 spettri attraverso la Spectrum Selector, Normalizer Spectrum, ei nodi Grouper Spectrum. </li><li> I dati sono stati poi confrontati con il motore di ricerca SEQUEST. Una tolleranza 20 ppm di massa è stato utilizzato. Modifiche statici sono stati fissati per il reagente cysTMT (304,18 Da) e modifiche dinamiche inclusi fosforilazione e l&#39;ossidazione della metionina (Da 15,99). Un database personalizzato per Solanum lycopersicum è stata composta utilizzando RNA dati (con circa 350.000 voci dalla Harvard University) 13 è stato utilizzato in entrambi i casi. </li></ol> 9. Risultati rappresentativi Una immagine rappresentativa di una foglia di impianto di controllo di pomodoro e una foglia di Pseudomonas è inoculatomostrato nella Figura 1. Una differenza tra controllo trattati e le foglie di Pseudomonas trattati si osserva. Dopo che le foglie vengono rimossi e colorati con DAB, la de-colorazione processo permette la colorazione istochimica a mostrare segni di ROS nel tessuto fogliare (Figura 2). Figura 2A è rappresentativo di una foglia di controllo senza colorazione. Figura 2B è rappresentativo di una foglia trattata con colorazione positiva per Pseudomonas e H 2 O 2 produzione. Un esempio di uscita Proteome Discover dati di una proteina differenzialmente regolati redox viene mostrato nella Figura 3. Questa proteina è un noto ferredossina-1 redox regolata proteina 14 e ha dimostrato di giocare un ruolo nella difesa contro pomodoro Pseudomonas syringae pv 15. Intensità di picco tra il controllo e campioni inoculati viene utilizzato per ottenere la quantificazione relativa, che mostrava cambiamenti significativi nella ferredoxin-1 regolazione redox (p &lt;0,05). Picchi ad alta intensità suggeriscono che questa proteina è ossidato in risposta al trattamento patogeno. Figura 4 è un esempio di uscita Proteome Discover dati di una proteina che ha simile regolazione redox di una proteina tra un campione e controllo inoculato. Picchi di intensità simile suggeriscono la presenza di legami disolfuro non regolata da un cambiamento di trattamento. Il metodo rivoluzionerà il modo di rilevare gli scienziati redox cisteine ​​reattivi e disolfuri 10. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig1.jpg" /> Figura 1. Un&#39;immagine rappresentativa di pomodoro lascia inoculato con soluzione di controllo (A) e Pseudomonas (B). &lt;class span = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig2.jpg" /> Figura 2. Un&#39;immagine rappresentativa di colorazione DAB di pomodoro lascia inoculato con soluzione di controllo (A) e Pseudomonas (B). Le foglie sono state colorate con 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidina. Clorofilla è stato rimosso dalle foglie mediante bollitura in etanolo al 95%. Colorazione scura indica la presenza di H 2 O 2. Lascia solo inoculato con coltura batterica ha mostrato una colorazione scura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig3.jpg" /> Figura 3. Un esempio di output Proteome Discover dati di ferredossina-1, differenzialmente regolati redox proteina 14. Intensità del picco di sopra di ogni picco viene utilizzato per la quantificazione assoluta. Picco di intensità tra controllo e campioni inoculati viene utilizzatoper eseguire la quantificazione relativa. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig4.jpg" /> Figura 4. Un esempio di uscita Proteome Discover dati di una proteina che ha intensità simile picco tra un campione e controllo inoculato. Picchi di intensità simile suggeriscono la presenza di legami disolfuro non regolata da un cambiamento di trattamento.

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</ol>

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Questo protocollo fornisce informazioni su come eseguire la colorazione DAB così come cysTMT quantificazione etichettato cisteina redox. Queste procedure sono utili in esame produzione di ROS nonché l&#39;effetto sulla regolazione proteina quando Solanum lycopersicum viene inoculato con Pseudomonas syringae. I metodi presentati in questo protocollo forniscono un modo per esaminare ROS in campioni di foglie intere in un modo che fa sì che la minor quantità di danno al tessuto fogliare. La procedura di etichettatura fornisce un metodo per esaminare le proteine ​​regolate potenzialmente redox utilizzando un metodo di etichettatura cisteina. Questo è utile quando l&#39;esame di una fase precoce della risposta allo stress. Metodi quali isotopo codificato marcatore per affinità (ICAT) e cysTMT può essere utilizzato in esame potenziali redox proteine ​​regolamentati in campioni biologici. ICAT permette l&#39;etichettatura e il confronto di due campioni 12. Entrambi i metodi etichettare cisteine ​​libere e possono essere utilizzati per la proteina quantificzione 10,12. Tuttavia, il metodo cysTMT consente una riduzione nella variazione sperimentale e multiplazione 10. Il numero di tag a disposizione permette ai ricercatori di comprendere repliche o più campioni nel loro design sperimentale. Avendo più campioni fornisce il potenziale per un numero superiore di proteine ​​identificate. Uno dei principali svantaggi della tecnica cysTMT è che compromette la qualità complessiva di identificazione di proteine ​​a causa delle fasi di arricchimento selettivo per cysTMT etichettati-peptidi (6,5-6,6). Il numero di peptidi per l&#39;identificazione di proteine ​​dipende in larga misura il numero di residui di cisteina nella sequenza della proteina. Questo problema può essere superato presentando una parte del campione triptico prima di arricchimento per l&#39;identificazione spettrometria di massa proteica. A causa della natura del disegno sperimentale così come il meccanismo di etichettatura che utilizza il metodo cysTMT, certi passi sono critici. Durante l&#39;esecuzione di proteine ​​Precipitation e pellet lavaggi (3,9) è importante mantenere i campioni raffreddata su ghiaccio per ridurre la degradazione delle proteine. Durante etichettatura cysTMT, rimozione del reagente riduzione (4,6) è importante perché i campioni possono subire etichettatura inversa. Etichettatura inversa è possibile ridurre se reagente rimane nel campione. Se i campioni vengono ridotte dopo l&#39;etichettatura, il tag cysTMT può essere rimosso. Quando le etichette vengono aggiunti ai campioni, il pH deve essere controllata (4,7) in modo da avere un&#39;efficienza ottimale etichettatura. Inoltre, l&#39;analisi dei dati dipende da ciò che è richiesto del ricercatore e l&#39;obiettivo finale in utilizzando il protocollo. È anche dipendente dal software utilizzato come ogni software deve algoritmi differenti. Questo esperimento utilizza patogeno come stimolatore per la maggiore produzione di specie reattive ossidativi nel pomodoro, ma altre reazioni redox regolamentati può essere misurato di conseguenza. Questo progetto sperimentale è adattabile ad altri impianti e sistemi animali. </p&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Metromix 500 </td><td> BWI Aziende </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-diaminobenzidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep sequenziale kit del reagente di estrazione 3 </td><td> Bio-Rad </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-X proteina saggio </td><td> Geno Tecnologia </td><td> 786-12x </td></tr><tr><td> cysTMT reagenti </td><td> Thermo Scientific Protein Pierce Prodotti di ricerca </td><td> 90071 </td></tr><tr><td> Laemmli Sample Buffer </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Bio-Safe Comassie (G-250 macchia) </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Microcon 3KD colonna </td><td> Millipore </td><td> 42403 </td></tr><tr><td> Immobilizzato anti-TMT resina </td><td> Thermo Scientific Protein Pierce Prodotti di ricerca </td><td> 90076 </td></tr><tr><td> Centrifuga colonna </td><td> Thermo Scientific Protein Pierce Prodotti di ricerca </td><td> 89896 </td></tr><tr><td> Proteopep II colonna C18 </td><td> Nuovo obiettivo </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D HPLC </td><td> AB Sciex </td><td> 90389 </td></tr><tr><td> LTQ Orbitrap XL </td><td> Thermo Scientific </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Labconco </td><td> 7812013 </td></tr><tr><td> Proteome Discoverer 1,2 software </td><td> Thermo Scientific Protein Pierce Prodotti di ricerca </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Oakridge provetta da centrifuga </td><td> Thermo Scientific Nalgene Società </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> Microcentrifuga tubo (2 ml) </td><td> USA Scientific </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> Top of Form &gt; Bio-Safe Coomassie StainBottom della Forma </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT arricchimento kit </td><td> Thermo Scientific Protein Pierce Prodotti di ricerca </td><td> 90077 </td></tr></tbody></table>

profiling tiolo proteome redox utilizzando tag spettrometria di massa isotopica

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. Pomodoro DC3000 ceppo non solo provoca la malattia batterica speck in Solanum lycopersicum, ma anche su specie di Brassica, nonché su Arabidopsis thaliana, un organismo geneticamente trattabili 1,2 pianta ospite. L&#39;accumulo di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) in cotiledoni inoculati con DC3000 indica un ruolo dei ROS nella modulazione morte delle cellule necrotiche durante la malattia batterica granello di pomodoro 3. Il perossido di idrogeno, un componente di ROS, viene prodotto dopo l&#39;inoculazione di piante di pomodoro con Pseudomonas 3. Il perossido di idrogeno può essere rilevato utilizzando un istochimica macchia 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidina (DAB) 4. Colorazione DAB reagisce con perossido di idrogeno per produrre una macchia scura il 4 tessuto fogliare. ROS ha un ruolo normativo l&#39;ambiente cellulare redox, che può modificare lo stato redox di alcune proteine ​​5. La cisteina è un importante aminoacido sensibilemodifiche redox. Sotto blanda ossidazione, ossidazione reversibile di cisteina gruppi solfidrilici funge redox sensori e trasduttori di segnale che regolano una varietà di processi fisiologici 6,7. Di massa tandem tag (TMT) reagenti consentire l&#39;identificazione simultanea e multiplex quantificazione delle proteine ​​in diversi campioni con spettrometria di massa tandem 8,9. Le cisteina-reattivi TMT (cysTMT) reagenti consentono etichettatura selettiva e quantificazione relativa di cisteina contenenti peptidi da un massimo di sei campioni biologici. Ogni tag cysTMT isobarica ha la stessa massa madre nominale ed è composto da un sulfidrile reattivo, un gruppo MS-neutro braccio spaziatore e un MS / MS giornalista 10. Dopo etichettatura, i campioni sono stati sottoposti a digestione proteasica. I peptidi cisteina-marcati sono stati arricchiti con una resina contenente anticorpi anti-TMT. Durante MS / MS, una serie di ioni del reporter (cioè, 126-131 Da) emergono nella regione di bassa massa, fornisce informazioni sulla quantificazione relativa.Il flusso di lavoro è efficace per ridurre la complessità dei campioni, migliorando gamma dinamica e studiare modifiche cisteina. Qui vi presentiamo redox analisi proteomica del pomodoro Pst DC3000 trattati (Rio Grande) lascia utilizzando la tecnologia cysTMT. Questo elevato throughput metodo ha il potenziale per essere applicata a studiare altri processi fisiologici redox-regolati.

Livello di specie reattive di ossigeno è elevata quando le cellule incontrano condizioni di stress. Qui si mostra l&#39;esempio di 3&#39;-3 &#39;colorazione diaminobenzidina così come l&#39;etichettatura cysTMT e spettrometria di massa per analizzare il proteoma redox in<em&gt; Pseudomonas syringae</em&gt; Trattati foglie di pomodoro.

Profiling tiolo Proteome Redox Utilizzando tag spettrometria di massa isotopica

Pseudomonas syringae pv. tomato ceppo DC3000 causa la malattia della macchia batterica non solo in Solanum lycopersicum ma anche in specie di Brassica, oltre che in...

L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare gli effetti di Pseudomonas syringae pv. tomato sulle proteine regolate dal redox nelle piante di pomodoro. Innanzitutto, inoculare le piante di pomodoro con Pseudomonas syringae pv. tomato per indurre l'infezione da patogeno e la risposta proteica. Procedere quindi alla colorazione con diamminobenzidina per osservare i cambiamenti nelle specie reattive dell'ossigeno.Quindi eseguire la marcatura dei cisteini con TMT allo scopo di esaminare i cisteini regolati dalla redox nelle proteine. I risultati ottenuti possono misurare le variazioni tra campioni trattati e controlli. Ciao, sono Chen del dipartimento di biologia e della struttura di proteomica qui all'Università della Florida.Il vantaggio del nostro metodo di marcatura CTMT rispetto ai metodi esistenti, come il marcatore a pinne rivestito con isotopi, noto anche come ASCA, è la possibilità di effettuare analisi multiplex di proteine sensibili al redox su larga scala. Mentre questa dimostrazione fornirà informazioni sulle proteine regolate dal redox nel pomodoro in risposta all'infezione da patogeni, l'esperimento può essere applicato ad altri sistemi, come joof, topi cu e altre piante, nonché al controllo di condizioni di stress. L'idea per questo metodo è nata dopo aver osservato notevoli variazioni tra esperimenti ICAD, poiché sono disponibili soltanto due marcatori.La dimostrazione VIR di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di marcatura e arricchimento sono difficili da apprendere. È necessario minimizzare le variazioni sperimentali tra i campioni marcati e rimuovere le regioni riducenti per garantire una marcatura efficiente. Cominciamo. Coltivare due piantine di pomodoro trapiantate di dimensioni simili in vasi di quattro pollici di diametro per la coltura dell'inoculo.Un tappeto batterico di pseudomona singe su una piastra KBM. Raschiare i batteri in 20 millilitri di acqua e preparare un inocolo batterico di circa 10 alla sesta unità formanti colonie per millilitro. In un litro di tampone di inoculazione, immergere le piante di quattro settimane nella soluzione di inoculazione batterica per 30 secondi.Quindi coprire immediatamente con sacchetti di plastica trasparente. Dopo il tempo di inoculazione desiderato, raccogliere la foglia completamente espansa posizionando l'epidermide superiore rivolta verso l'alto in una soluzione di colorante DAB da un milligrammo per millilitro ed eseguire un'infiltrazione a vuoto per 15 minuti. Successivamente, incubare le foglie al buio a temperatura ambiente per tutta la notte.Ora far bollire le foglie colorate in etanolo al 95% per 10 minuti e conservarle in etanolo al 75% utilizzando un mortaio per macinare. Raccogliere le foglie e ridurle in polvere finissima in azoto liquido. Quindi eseguire le estrazioni con fenolo come descritto nel testo allegato.Successivamente, precipitare le proteine estratte con fenolo aggiungendo cinque volumi di acetato di ammonio 0,1 molare freddo in metanolo al 100%. Raccogliere le proteine mediante centrifugazione ed eseguire lavaggi del pellet. Quindi risospendere i campioni in 1,5 millilitri di etanolo freddo al 70% e trasferirli in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante di etanolo e asciugare brevemente il pellet in un evaporatore sotto vuoto. Dissolvere i campioni in un buffer di estrazione proteica denaturante dopo averli centrifugati per formare un pellet, raccogliere il surnatante, misurare il volume del supernatante e determinare la concentrazione proteica seguendo le istruzioni del produttore. Per ciascuno dei sei marcatori isotopici, partire da 100 microgrammi di campione proteico e aggiungere un volume uguale di buffer di alchilazione contenente acetamide 200 millimolare appena preparato, per bloccare i gruppi tiolici liberi; incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, per precipitare le proteine, aggiungere un millilitro di acetone freddo al 80% e lasciare a meno 20 gradi Celsius durante la notte.Centrifugare la proteina per formare il pellet ed eseguire tre lavaggi con acetone all'80%. Dopo aver lasciato asciugare all'aria i campioni sul ghiaccio, risospendere il pellet in 50 microlitri di buffer di lisi. Successivamente, per ridurre i legami disolfuro, aggiungere 0,5 microlitri di TCEP 100 millimolare ed incubare per un'ora a temperatura ambiente.Solubilizzare i tag aggiungendo 20 microlitri di acetonitrile ai tubi del reagente. Vortexare e centrifugare brevemente per rimuovere l'eccesso di TCEP. Caricare 50 microlitri di campione su una colonna MicroCon da 3 kD. Aggiungere 50 microlitri di buffer di lisi e centrifugare per 15 minuti a 10.000 ×g e a 4 gradi Celsius.Per raccogliere il campione, rimuovere la colonna, capovolgerla in una provetta pulita e centrifugare. Se necessario, verificare il pH del campione. Regolare il pH tra sette e otto con acido cloridrico uno molare.Aggiungere cinque microlitri del reagente TMT per la cisti e incubare la reazione per due ore a temperatura ambiente, unire i campioni e aggiungere un volume uguale di tampone di lisi; far bollire per cinque minuti e separare su un gel preformato di poliacrilamide al 12%. Dopo aver sciacquato il gel tre volte con acqua filtrata, colorare con blu di Coomassie per un'ora e decolorare durante la notte in acqua in base alla concentrazione delle bande proteiche. Dividere 12 frazioni per ogni corsia del gel. Tagliare ogni frazione in pezzi di un millimetro e collocarli in un tubo da 1,5 millilitri.Trattenere completamente i pezzi di gel con bicarbonato di ammonio 0,1 M in acetonitrile al 50%. Coprire ora i pezzi con acetonitrile al 100% per 15 minuti. Rimuovere il liquido ed essiccare i pezzi utilizzando un evaporatore sotto vuoto.Successivamente, aggiungere un volume uguale di soluzione di tripsina e porre sul ghiaccio per riidratare. Quindi, incubare a 37 gradi Celsius per 12-16 ore per la digestione triptica. Successivamente, rimuovere l'estratto proteico liquido dai campioni incubati.Fermare la reazione ed eliminare qualsiasi residuo di proteina digerita coprendo i pezzi di gel con acido formico al 5%, acetonitrile al 50%. Quindi agitare i pezzi di gel per 20 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il sopernatante nei tubi del campione proteico estratto dopo altre due estrazioni.Asciugare i campioni sotto vuoto in provette da 0,5 millilitri. Preparare una sospensione al 50% della resina anti-TMT in TBS a una concentrazione proporzionale all'intensità della banda proteica corrispondente. Lavare la resina tre volte con un volume di colonna di TBS 1X, quindi procedere aggiungendo 200 microlitri di TBS a ciascun campione.Quindi trasferire sulla resina anti-TMT e agitare a temperatura ambiente per due ore, seguito da un'agitazione lenta tutta la notte a quattro gradi Celsius. Caricare ogni campione su una colonna. Eseguire i lavaggi della colonna con 200 microlitri ciascuno.Quindi eluire ogni campione tre volte con 200 microlitri di buffer di eluizione al 50% e asciugare sotto vuoto. Reese, sospendere i campioni in 12 microlitri di acetonitrile al 3% con acido formico allo 0,1% e iniettare direttamente 5 microlitri su una colonna HPLC. Eluire i peptidi utilizzando un gradiente di acetonitrile crescente come specificato nel testo allegato.Utilizzare la spettrometria di massa per rilevare peptidi in un flusso di lavoro top due per tre. Iniziare con una singola fase ms. Quindi acquisire tre spettri Ms.Ms con frammentazione mediante dissociazione intrappolata ad alta energia C seguita da tre.Spettrometria di massa con dissociazione indotta da collisione per l'identificazione delle proteine. Analizzare i dati della spettrometria di massa utilizzando un flusso di lavoro ramificato. Implementare un quantizzatore di ioni marcatore per quantificare il rapporto.Elaborare anche lo spettro MSM MS attraverso i nodi selettore dello spettro, normalizzatore dello spettro e raggruppatore dello spettro, interrogando i dati contro il motore di ricerca Seaquest. Questa immagine mostra esempi di una foglia di pianta di pomodoro controllata a sinistra e di una foglia inoculata con Pseudomonas a destra, dopo la colorazione delle foglie con DAB. Il processo di colorazione con DES permette alla colorazione istochimica di evidenziare la presenza di specie reattive dell'ossigeno nel tessuto fogliare.Come previsto, il controllo non mostra una colorazione significativa, mentre le foglie trattate con pseudomonas risultano positive per la produzione di perossido di idrogeno. Questo esempio mostra l'output dei dati di proteoma discover: l'area del picco di una proteina regolata in modo differenziale dal redox per ogni campione consente una quantificazione assoluta. L'area del picco tra i campioni di controllo e quelli inoculati indica le quantità relative.Qui, la regolazione redox di una proteina tra un campione di controllo e uno inoculato è simile. Picchi di intensità simile indicano la presenza di legami disolfuro non regolati da un cambiamento del trattamento. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita correttamente in una settimana.Ricordarsi di mantenere i campioni freddi e di organizzare accuratamente le etichette. Inoltre, adottare precauzioni durante l'uso del fenolo, come indossare guanti monouso e lavorare sotto cappa seguendo questa procedura. Altre analisi, come la spettrometria di massa specifica delle modifiche post-traduzionali, possono essere eseguite per determinare ulteriori modifiche del sistema, come l'acido onico e la simulazione del glutine.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la CTMD in posizione eretta DIB abilitando e la qualifica redox 16.

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Composti cattura sono trifunzionale piccole molecole per ridurre la complessità del proteoma funzionale reversibile da piccola molecola-proteina seguiti da foto-reticolazione e purificazione. Qui si usa un composto di cattura...

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Etichettatura isotopi stabili di peptidi da dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un rapido strategia economica per proteomica accurate di massa a base di spettrometria-quantitativi. Qui mostriamo un metodo efficace per la preparazione e l'analisi di miscele proteiche che utilizzano l'approccio Redi che può essere applicato a quasi qualsiasi tipo di campione.

La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling

Combinato precursore etichettatura isotopica e tagging isobarica (CPilot) è una strategia proteomica quantitativa che migliora le capacità di multiplazione campione di tag isobariche. Questo protocollo descrive l'applicazione di CPilot ai tessuti dal modello murino della malattia e wild-type controlli di Alzheimer.

Maggiore Campione Multiplexing dei tessuti utilizzando combinata Precursore isotopica etichettatura e isobarica Tagging (CPilot)

Vi presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le proteine con etichettatura isobarico, vasto frazionamento, strumenti di bioinformatica e procedura di controllo di qualità in combinazione con cromatografia liquida interfacciato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.

Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

Presentiamo un protocollo di etichettatura ottimizzato per tag di massa tandem (TMT) che include informazioni dettagliate per ciascuno dei seguenti passaggi: estrazione delle proteine, quantificazione, precipitazioni, digestione, etichettatura, presentazione a un impianto proteomico e analisi dei dati.

Preparazione del campione TMT per l'invio di strutture proteomiche e la successiva analisi dei dati

Il protocollo descritto fornisce un'analisi proteomica quantitativa ottimizzata di campioni di tessuto utilizzando due approcci: la quantificazione basata su etichette e la quantificazione senza etichette. Gli approcci basati su etichette hanno il vantaggio di una quantificazione più accurata delle proteine, mentre un approccio senza etichette è più economico e utilizzato per analizzare centinaia di campioni di una coorte.

Flusso di lavoro completo di proteomica shotgun basata su spettrometria di massa di campioni di tessuto

La proteina arginina (R)-metilazione è una diffusa modificazione post-traduzionale che regola molteplici percorsi biologici. La spettrometria di massa è la migliore tecnologia per profilare globalmente il R-metil-proteoma, quando accoppiata ad approcci biochimici per l'arricchimento peptidico modificato. Il flusso di lavoro progettato per l'identificazione ad alta confidenza della R-metilazione globale nelle cellule umane è descritto qui.

Un approccio proteomico basato sulla spettrometria di massa per l'analisi globale e ad alta confidenza della R-metilazione delle proteine

L'ossidazione del tiolo proteico ha implicazioni significative in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche normali. Descriviamo i dettagli di un metodo di proteomica redox quantitativa, che utilizza la cattura assistita da resina, la marcatura isobarica e la spettrometria di massa, consentendo l'identificazione sito-specifica e la quantificazione dei residui di cisteina ossidati in modo reversibile delle proteine.

Cattura assistita da resina accoppiata con etichettatura isobarica Tandem Mass Tag per la quantificazione multiplexata dell'ossidazione del tiolo proteico

Questo articolo descrive un metodo di preparazione del campione basato sull'inattivazione termica per preservare i peptidi endogeni evitando la degradazione post-mortem, seguito dalla quantificazione relativa utilizzando l'etichettatura isotopica più LC-MS.

Preparazione del campione e quantificazione relativa mediante metilazione riduttiva delle ammine per studi peptidomici

Questo video dimostra la preparazione di un ultra-sottile matrice / analita strato per l'analisi dei peptidi e proteine ​​da Matrix-Assisted Laser ionizzazione di desorbimento spettrometria di massa (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

Scopri il profilo del proteoma redox in piante di pomodoro infettate con Pseudomonas syringae utilizzando la marcatura cysTMT e la spettrometria di massa. Questo metodo permette di analizzare le proteine regolate dal redox su larga scala.

Profiling tiolo Proteome Redox Utilizzando tag spettrometria di massa isotopica

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