Profiling tiolo Proteome Redox Utilizzando tag spettrometria di massa isotopica

L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare gli effetti di Pseudomonas syringae pv. tomato su proteine regolate dallo stato redox nelle piante di pomodoro. Innanzitutto, inoculare le piante di pomodoro con Pseudomonas syringae pv. tomato per indurre l'infezione da patogeno e la risposta proteica. Procedere quindi alla colorazione con diamminobenzidina per osservare i cambiamenti nelle specie reattive dell'ossigeno.

Quindi eseguire l'etichettatura dei cisteini con TMT al fine di esaminare i cisteini regolati dalla redox nelle proteine. I risultati ottenuti possono misurare le variazioni tra campioni trattati e controlli. Ciao, sono Chen del dipartimento di biologia e della struttura di proteomica qui all'Università della Florida.

Il vantaggio del nostro metodo di marcatura CTMT rispetto ai metodi esistenti, come il marcatore a pinne rivestito con isotopi, noto anche come ASCA, è la capacità di effettuare multiplexing durante l'analisi di proteine sensibili al redox su larga scala. Mentre questa dimostrazione fornirà informazioni sulle proteine regolate dal redox nel pomodoro in risposta all'infezione da patogeni, l'esperimento può essere applicato ad altri sistemi come joof, topi cu e altre piante, nonché al controllo di condizioni di stress. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo dopo aver osservato una notevole variabilità tra esperimenti ICAD, poiché sono disponibili soltanto due marcatori.

La dimostrazione VIR di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di marcatura e arricchimento sono difficili da apprendere. È necessario minimizzare le variazioni sperimentali tra i campioni marcati ed eliminare le regioni riducenti per garantire una marcatura efficiente. Cominciamo. Coltivare due piantine di pomodoro trapiantate di dimensioni simili in vasi di quattro pollici di diametro per la coltura dell'inoculo.

Un tappeto batterico di pseudomona singe su una piastra KBM. Raschiare i batteri in 20 millilitri di acqua e preparare un inocolo batterico di circa 10 alla sesta unità formanti colonie per millilitro. In un litro di tampone di inoculazione, immergere le piante di quattro settimane nella soluzione di inoculazione batterica per 30 secondi.

Quindi coprire immediatamente con sacchetti di plastica trasparente. Dopo il tempo di inoculazione desiderato, raccogliere la foglia completamente espansa posizionando l'epidermide superiore rivolta verso l'alto in una soluzione di colorante DAB da un milligrammo per millilitro ed eseguire un'infiltrazione a vuoto per 15 minuti. Successivamente, incubare le foglie al buio a temperatura ambiente per tutta la notte.

Ora far bollire le foglie colorate in etanolo al 95% per 10 minuti e conservarle in etanolo al 75% utilizzando un mortaio per macinare. Raccogliere le foglie e ridurle in polvere finissima in azoto liquido. Quindi eseguire le estrazioni con fenolo come descritto nel testo allegato.

Successivamente, precipitare le proteine estratte con fenolo aggiungendo cinque volumi di acetato di ammonio 0,1 molare freddo in metanolo al 100%. Raccogliere le proteine mediante centrifugazione ed eseguire lavaggi del pellet. Quindi risospendere i campioni in 1,5 millilitri di etanolo freddo al 70% e trasferirli in una provetta microcentrifuga da due millilitri.

Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante di etanolo e asciugare brevemente il pellet in un evaporatore sotto vuoto. Dissolvere i campioni in un buffer di estrazione proteica denaturante dopo averli centrifugati per formare un pellet, raccogliere il surnatante e misurare la concentrazione proteica secondo le istruzioni del produttore. Per ciascuno dei sei marcatori isotopici, partire da 100 microgrammi di campione proteico e aggiungere un volume uguale di buffer di alchilazione contenente acetamide 200 millimolare appena preparato, per bloccare i gruppi tiolici liberi; incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, per precipitare le proteine, aggiungere un millilitro di acetone freddo al 80% e lasciare a meno 20 gradi Celsius durante la notte.

Centrifugare la proteina per formare il pellet ed eseguire tre lavaggi con acetone all'80%. Dopo aver lasciato asciugare i campioni all'aria su ghiaccio, risospendere il pellet in 50 microlitri di buffer di lisi. Successivamente, per ridurre i legami disolfuro, aggiungere 0,5 microlitri di TCEP 100 millimolare ed incubare per un'ora a temperatura ambiente.

Solubilizzare i marcatori aggiungendo 20 microlitri di acetonitrile ai tubi del reagente. Vortexare e centrifugare brevemente per rimuovere l'eccesso di TCEP. Caricare 50 microlitri di campione su una colonna MicroCon da tre kD. Aggiungere 50 microlitri di buffer di lisi e centrifugare per 15 minuti a 10.000 ×g e a quattro gradi Celsius.

Per raccogliere il campione, rimuovere la colonna, capovolgerla in una provetta pulita e centrifugare. Se necessario, verificare il pH del campione. Regolare il pH tra sette e otto con acido cloridrico uno molare.

Aggiungere cinque microlitri del reagente TMT per la rottura delle cisti e incubare la reazione per due ore a temperatura ambiente, unire i campioni e aggiungere un volume uguale di tampone di lisi; portare a ebollizione per cinque minuti e separare su un gel preformato di poliacrilammide al 12%. Dopo aver sciacquato il gel tre volte con acqua filtrata, colorare con blu di Coomassie per un'ora e decolorare in acqua per tutta la notte in base alla concentrazione delle bande proteiche. Dividere in 12 frazioni per ogni corsia del gel. Tagliare ogni frazione in pezzi di un millimetro e collocarli in un tubo da 1,5 millilitri.

Trattenere completamente i pezzi di gel con bicarbonato di ammonio 0,1 M in acetonitrile al 50%. Coprire ora i pezzi con acetonitrile al 100% per 15 minuti. Rimuovere il liquido ed essiccare i pezzi utilizzando un evaporatore sotto vuoto.

Successivamente, aggiungere un volume uguale di soluzione di tripsina e porre sul ghiaccio per riidratare. Quindi, incubare a 37 gradi Celsius per 12-16 ore per la digestione triptica. Successivamente, rimuovere l'estratto proteico liquido dai campioni incubati.

Fermare la reazione ed eliminare qualsiasi residuo di proteina digerita coprendo i pezzi di gel con acido formico al 5%, acetonitrile al 50%. Quindi agitare i pezzi di gel per 20 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il soprannatante nei tubi del campione proteico estratto dopo altre due estrazioni.

Asciugare i campioni sotto vuoto in provette da 0,5 millilitri. Preparare una sospensione al 50% della resina anti-TMT in TBS a una concentrazione proporzionale all'intensità della banda proteica corrispondente. Lavare la resina tre volte con un volume di colonna di TBS 1X, quindi procedere aggiungendo 200 microlitri di TBS a ciascun campione.

Quindi trasferire sulla resina anti-TMT e agitare a temperatura ambiente per due ore, seguite da un'agitazione lenta tutta la notte a quattro gradi Celsius. Caricare ogni campione su una colonna. Eseguire i lavaggi della colonna con 200 microlitri ciascuno.

Quindi eluire ogni campione tre volte con 200 microlitri di buffer di eluizione al 50% e asciugare sotto vuoto. Reese, sospendere i campioni in 12 microlitri di acetonitrile al 3% con acido formico allo 0,1% e iniettare direttamente 5 microlitri su una colonna HPLC. Eluire i peptidi utilizzando un gradiente di acetonitrile crescente come specificato nel testo allegato.

Utilizzare la spettrometria di massa per rilevare peptidi in un flusso di lavoro top due per tre. Iniziare con una singola fase ms. Quindi acquisire tre spettri Ms.Ms con frammentazione mediante dissociazione intrappolata ad alta energia C seguita da tre.

Ms.MS con dissociazione indotta da collisione per l'identificazione delle proteine. Analizzare i dati di spettrometria di massa utilizzando un flusso di lavoro ramificato. Implementare un quantizzatore di ioni marcatore per quantificare il rapporto.

Elaborare anche lo spettro MSM MS attraverso i nodi selettore dello spettro, normalizzatore dello spettro e raggruppatore dello spettro, interrogando i dati tramite il motore di ricerca Seaquest. Questa immagine mostra esempi di una foglia di pianta di pomodoro controllata a sinistra e di una foglia inoculata con Pseudomonas a destra, dopo la colorazione delle foglie con DAB. Il processo di colorazione con DES permette alla colorazione istochimica di evidenziare la presenza di specie reattive dell'ossigeno nei tessuti fogliari.

Come previsto, il controllo non mostra una colorazione significativa, mentre le foglie trattate con pseudomonas risultano positive per la produzione di perossido di idrogeno. Questo esempio mostra l'output dei dati di proteomica relativo all'area del picco di una proteina regolata in modo differenziale dalla redox; l'area del picco per ogni campione consente una quantificazione assoluta. L'area del picco tra i campioni di controllo e quelli inoculati indica le quantità relative.

Qui, la regolazione redox di una proteina tra un campione di controllo e uno inoculato è simile. Picchi di intensità simile indicano la presenza di legami disolfuro non regolati da un cambiamento del trattamento. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita correttamente in una settimana.

Ricordarsi di mantenere i campioni freddi e di organizzare accuratamente le etichette. Inoltre, adottare precauzioni durante l'uso del fenolo, come indossare guanti monouso e lavorare sotto cappa seguendo questa procedura. Altre analisi, come la spettrometria di massa specifica delle modifiche post-traduzionali, possono essere eseguite per determinare ulteriori modifiche del sistema, come l'acido onico e la simulazione del glutine.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la CTMD in posizione eretta DIB abilitando e la qualifica redox 16.