Manipolazione spazio-temporale di attività GTPasi Piccolo a livello subcellulare e su scala temporale di secondi nelle cellule viventi

In questo video viene illustrato un metodo in cui la luce UV viene utilizzata per manipolare l'attività di una proteina presso la membrana plasmatica. A tale scopo, le cellule vengono cotrasfettate con la proteina FRB ancorata alla membrana e la proteina di interesse fusa a FK BP. Viene aggiunto al mezzo un derivato della rapamicina fotoincapsulato.

Successivamente, durante l'acquisizione di immagini di cellule vive, una luce UV viene applicata a una regione specifica della cellula. Il linker tra la rapamicina e la biotina viene scisso, rilasciando il dimerizzatore chimico e il suo sottoprodotto; il dimerizzatore rilasciato diffonde all'interno delle cellule e induce il dimerismo tra la proteina di interesse marcata con FKBP e la FRB ancorata alla membrana plasmatica nella regione irradiata. In assenza di radiazione UV, FKBP e FRB non si associano, e pertanto non producono alcun effetto.

L'analisi dei dati rivela un reclutamento altamente localizzato della proteina di interesse fusa a FKBP in base al suo effetto fisiologico. Il vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come quelli farmacologici e genetici, è la combinazione di rapidità d'azione, specificità del bersaglio e risoluzione spaziale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle metastasi tumorali, che sono conseguenza della migrazione delle cellule tumorali.

Pertanto, la manipolazione dell'attività di fattori chiave della migrazione potrebbe rivelarne il meccanismo molecolare preciso, prerequisito per il trattamento e la cura. La procedura verrà dimostrata da Chris Paul Meyer, uno studente laureato, e da Bob de Rose, un tecnico del mio laboratorio. Iniziare questo protocollo unendo in una provetta sterile per microcentrifuga: plasmide, DNA, FRB ancorato alla membrana etichettato fluorescentemente, FKBP, TIA uno e acqua deionizzata; aggiungere un microlitro di HD gene al mix e vortexare.

Incubare il tubo a temperatura ambiente per 20 minuti. Durante l'incubazione, aggiungere 50 microlitri di poli-D-lisina in ciascun pozzetto di una camera in vetro a otto pozzetti e incubare per un minuto per rivestire la superficie, quindi aspirare la soluzione e lavare il centro di ogni pozzetto con 50 microlitri di acqua deionizzata. Successivamente, la tripsina viene applicata a cellule NIH 3T3 confluenti all'80-85%.

Dopo il distacco delle cellule, aggiungere 10 millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS, trasferire 375 microlitri della sospensione in un tubo sterile da 15 millilitri e centrifugare a 1.500 ×g per tre minuti. Al termine della centrifugazione, aspirare con attenzione il mezzo. Aggiungere 750 microlitri di DMEM con il 10% di FVS e Resus.

Sospendere il pellet aspirando e dispensando delicatamente più volte. Infine, aggiungere la sospensione cellulare alla soluzione di trasfezione e, mescolando delicatamente con la punta della pipetta, aggiungere 250 microlitri della sospensione cellulare di trasfezione in ogni pozzetto della camera. Far scivolare e incubare.

37 gradi Celsius per 15-18 ore. Per sintetizzare la rapamicina incapsulata, addotto biotinico. Preparare innanzitutto una soluzione madre di CRB di un millimolare in DMSO in un tubo sterile per centrifuga; in un altro tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri, sciogliere un milligrammo di avadon in 250 microlitri di PBS.

Successivamente, coniugare il gruppo fotoprotegente alla rapamicina. Aggiungere 0,5 microlitri della soluzione stock di CRB all'AVID disciolta, mescolando mediante inversione ripetuta e quindi incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Per ottenere la soluzione coniugata di CRB-AVID e rimuovere le piccole molecole non legate, purificare il CRBA equilibrando una colonna di esclusione dimensionale G-25 con 300 microlitri di PBS.

Ripetere cinque volte dopo che la colonna si è equilibrata. Caricare 125 microlitri di soluzione CRBA al centro della colonna. Quindi centrifugare la soluzione per due minuti a 800 G a temperatura ambiente, raccogliendo il flusso in uscita in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri dopo la trasfezione delle cellule.

Sostituire il mezzo con DMEM senza FBS per sottoporre le cellule a sierostarvazione e incubare per 12 ore. Al termine dell'incubazione, aspirare delicatamente il mezzo e aggiungere 250 microlitri della soluzione di CRBA preparata da un micromolare. Successivamente, per visualizzare la dinamica delle proteine in cellule vive, utilizzare un microscopio confocale a disco rotante con illuminazione UV per accoppiare l'ottica alla luce LED UV a 365 nanometri.

Con luce di fluorescenza epi. Definire le coordinate e le dimensioni di un punto di illuminazione utilizzando una piastra di vetro rivestita con coloranti fluorescenti eccitati dalla luce UV. Questo consente un'accurata regolazione dell'area da irradiare.

Posizionare la camera per vetrino con le cellule sulla piastra utilizzando un obiettivo da 100x e fluorescenza in epifluorescenza. Mettere a fuoco le cellule e individuarne una. Per l'acquisizione delle immagini, iniziare a riprendere le cellule dopo aver determinato i livelli di fondo dell'effetto fisiologico.

Qui, l'ondulazione della membrana viene misurata irradiando luce UV in un quadrante scelto della cellula, sciogliendo il composto fotoliberato e quindi aggiungendo rapamicina originale in DMSO e successivamente in PBS fino a una concentrazione finale di 400 nanomolari. Aggiungere 100 microlitri della soluzione alla camera di imaging per indurre effetti globali. Acquisire immagini di fluorescenza ogni 15 secondi per 20 minuti per determinare se l'attivazione localizzata di RAC possa indurre la formazione di arricciamenti locali.

Le cellule NIH 3T3 sono state trasfettate con l'attivatore di RAC marcato con YFP, FK bp, TIA uno e LDR, che è ancorato alla membrana. L'irradiazione localizzata FRB al bordo della cellula, indicata dal cerchio giallo, è stata seguita da un'illuminazione globale con una lampada a mercurio per un secondo a partire da 1063 secondi. Come si può osservare qui, quasi nessun ripiegamento della membrana era presente all'inizio.

Tuttavia, dopo un'illuminazione localizzata, è stato osservato un ripiegamento spazialmente confinato a seguito di illuminazione globale e aggiunta di rapamicina, che induce il traslocazione di FK bp TIA uno alla membrana plasmatica. La cellula ha mostrato la formazione di ripiegamenti diffusi, indicando che la formazione locale di ripiegamenti precedentemente osservata era causata dall'attivazione spazialmente confinata di rack. Per un'analisi quantitativa, le cellule bersaglio sono state suddivise in quattro quadranti e la frequenza di formazione dei ripiegamenti in ciascun quadrante, sia dopo stimolazione locale che globale, è stata determinata come mostrato in questo grafico.

Nessuna delle cellule osservate ha mostrato formazione di ruffle con CRBA senza irradiazione UV o UV locale, né con irradiazione UV con o senza Aden nel mezzo in massa. Tuttavia, quando è stato aggiunto CRBA ed è stata effettuata l'irradiazione UV, la formazione di ruffle è stata osservata in misura pressoché uguale, circa il 90%, in tutti i quadranti con irradiazione globale; quando invece solo il primo quadrante è stato irradiato, la frequenza di formazione di ruffle è risultata del 100% rispetto al 30%, 25% e 30% nei quadranti due, tre e quattro. Questi risultati indicano che l'uncaging localizzato della rapamicina può essere utilizzato per indurre effetti fisiologici altamente localizzati in una singola cellula.

In questo caso, il ripiegamento della membrana è causato dall'attivazione di rack. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere un controllo spaziotemporale dell'attività delle piccole GTPasi mediante la luce. Questo metodo potrebbe essere applicato a qualsiasi processo fisiologico che dipenda dal transito di proteine specifiche verso la membrana plasmatica.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di preparare sempre fresche soluzioni, reagenti e cellule per ogni procedimento. Non dimenticare che lavorare con la luce UV può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di occhiali protettivi anti-UV devono essere sempre adottate.