Manipolazione spazio-temporale di attività GTPasi Piccolo a livello subcellulare e su scala temporale di secondi nelle cellule viventi

Questo video mostra un metodo in cui la luce UV viene utilizzata per manipolare l'attività di una proteina sulla membrana plasmatica. Per fare ciò, le cellule vengono trasfettate in cot con la proteina FRB ancorata alla membrana e la proteina fusa FK BP di interesse. Al mezzo viene aggiunto un derivato della rapamicina in gabbia fotografica.

Quindi, durante l'imaging di cellule vive, la luce UV viene applicata a una regione specifica della cellula. Il linker tra rapamicina e biotina viene scisso rilasciando un dimerizzatore chimico e il suo sottoprodotto, il dimerizzante rilasciato, si diffonde nelle cellule e induce la dimerizzazione tra la proteina di interesse marcata con FKBP e l'FRB ancorato alla membrana plasmatica nella regione irradiata. Senza la radiazione UV, FKBP e FRB non si associano, quindi non producono alcun effetto.

L'analisi dei dati rivela un reclutamento altamente localizzato della proteina fusa FKBP di interesse in base al suo effetto fisiologico. Il vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la farmacologia e la genetica, è la combinazione di velocità d'azione, specificità del bersaglio e risoluzione spaziale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia del cancro metastatico è una conseguenza della migrazione da parte delle cellule tumorali.

Pertanto, la manipolazione dell'attività dei principali fattori di migrazione può rivelare il suo preciso meccanismo molecolare, che è un prerequisito per il suo trattamento e la sua cura. A dimostrare la procedura saranno Chris Paul Meyer, uno studente laureato e Bob de Rose, un tecnico del mio laboratorio. Inizia questo protocollo combinando quanto segue in una provetta sterile per microcentrifuga, plasmide, DNA, FRB legato alla membrana, FKBP marcato in modo FLUORESCENTE, TIA uno e acqua deionizzata, aggiungi un microlitro di qualche gene HD alla miscela e vortice.

Incubare la provetta a temperatura ambiente per 20 minuti. Durante l'incubazione, aggiungere 50 microlitri di poli de luccina a ciascun pozzetto di un lato della camera di vetro a otto pozzetti e incubare per un minuto per rivestire la superficie, quindi aspirare la soluzione e lavare il centro di ciascun pozzetto con 50 di acqua deionizzata. La tripsina successiva è dall'80 all'85% NIH confluente a tre cellule T.

Dopo che le cellule si sono staccate, aggiungere 10 millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS, trasferire 375 microlitri di sospensione in una provetta sterile da 15 millilitri e centrifugare a 1.500 G per tre minuti. Dopo la centrifuga, aspirare con cura il substrato. Aggiungere 750 microlitri di DMEM con il 10% di FVS e Resus.

Sospendere il pellet pipettandolo delicatamente su e giù più volte. Infine, aggiungere la sospensione cellulare alla soluzione di trasfezione e, utilizzando la punta della pipetta, mescolare delicatamente, aggiungere 250 microlitri della sospensione di trasfezione cellulare a ciascun pozzetto della camera. Far scorrere e incubare.

37 gradi Celsius per 15-18 ore. Per sintetizzare la rapamicina in gabbia, addotto della biotina. Iniziare preparando una soluzione madre da un millimolare di CRB in DMSO in una provetta sterile per fuge in una provetta separata da microcentrifuga da 1,5 millilitri, sciogliere un milligrammo di avadon in 250 microlitri di PBS.

Accanto a coniugare la porzione di gabbia alla rapamicina. Aggiungere 0,5 microlitri della soluzione madre di CRB all'AVID disciolto miscelato capovolgendolo più volte e quindi incubato a temperatura ambiente per 15 minuti. Per produrre CRB AVID in soluzione coniugata per escludere piccole molecole non legate e purificare CRBA, equilibrare una colonna di esclusione di dimensioni G 25 con 300 microlitri di PBS.

Ripetere cinque volte dopo che la colonna si è equilibrata. Caricare 125 microlitri di soluzione di CRBA sul letto centrale della colonna. Quindi centrifugare la soluzione per due minuti a 800 G A temperatura ambiente, raccogliere il flusso in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri dopo la trasfezione delle cellule.

Scambia il terreno con DMEM senza FBS per affamare le cellule del siero e incubare per 12 ore. Dopo l'incubazione, aspirare delicatamente il terreno e aggiungere 250 microlitri della soluzione di CRBA micromolare preparata. Per visualizzare la dinamica delle proteine nelle cellule viventi, è possibile utilizzare un microscopio confocale a disco rotante con illuminazione UV per accoppiare l'ottica per la luce UV LED a 365 nanometri.

Con luce a epifluorescenza. Definisci le coordinate e le dimensioni di un punto di illuminazione utilizzando una lastra di vetro rivestita con coloranti fluorescenti eccitati dalla luce UV. Ciò consente la regolazione fine dell'area da irradiare.

Posizionare il vetrino da camera con le cellule sul tavolino utilizzando un obiettivo 100 x e l'epifluorescenza. Metti a fuoco le cellule e trova una cellula. Per l'imaging, iniziare l'imaging delle cellule dopo aver determinato i livelli di fondo dell'effetto fisiologico.

Qui, l'arruffamento della membrana viene misurato irradiando la luce UV in un quadrante scelto della cellula, dissolvendosi senza gabbia, quindi rapamicina originale in DMSO e quindi in PBS fino a una concentrazione finale di 400 nanomolari. Aggiungere 100 microlitri di soluzione alla camera di imaging per indurre effetti globali. Acquisisci immagini a fluorescenza ogni 15 secondi per 20 minuti per determinare se l'attivazione localizzata del RAC può indurre la formazione di increspature locali.

Le tre cellule T NIH sono state trasfettate con l'attivatore RAC marcato YFP FK bp, TIA one e LDR, che è ancorato alla membrana. L'irradiazione localizzata FRB sul bordo della cella, indicata dal cerchio giallo, è stata seguita da un'illuminazione globale con una lampada al mercurio per un secondo a partire da 1063 secondi. Come si può vedere qui, all'inizio non era presente quasi nessuna increspatura della membrana.

Tuttavia, dopo l'illuminazione localizzata, è stata osservata un'increspatura spazialmente confinata dopo l'illuminazione globale e l'aggiunta di rapamicina, che causa la traslocazione di FK bp TIA one alla membrana plasmatica. La cellula ha mostrato la formazione di increspature globali, indicando che la formazione di increspature locale precedentemente osservata era causata dall'attivazione spazialmente confinata del rack. Per un'analisi quantitativa, le cellule bersaglio sono state divise in quattro quadranti ed è stata determinata la frequenza di formazione di increspature in ciascun quadrante dopo stimolazione locale e globale successiva, come si vede in questo grafico.

Nessuna delle cellule osservate ha mostrato la formazione di increspature con CRBA senza radiazioni uve o uve locali, una radiazione con o senza Aden in mezzo massivo. Tuttavia, quando è stato aggiunto il CRBA ed è stata eseguita l'irradiazione UV, la formazione di increspature è stata osservata all'incirca allo stesso modo, circa il 90% in tutti i quadranti con radiazione globale quando è stato irradiato solo il quadrante uno, la frequenza di formazione di increspature è stata del 100% rispetto al 30% del 25% e del 30% nei quadranti dal due al quarto. Questi risultati indicano che l'uncaging localizzato della rapamicina può essere utilizzato per indurre effetti fisiologici altamente localizzati in una singola cellula.

In questo caso, increspatura della membrana causata dall'attivazione del rack. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere il controllo temporale spaziale dell'attività dei TPA di piccolo g da parte della luce. Questo metodo potrebbe essere applicato a qualsiasi processo fisiologico che dipende dalla traslocazione di proteine specifiche sulla membrana plasmatica.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare nuovamente soluzioni, reagenti e cellule per ogni procedura. Non dimenticare che lavorare con la luce UV può essere estremamente pericoloso e che è necessario indossare sempre precauzioni come gli occhiali UV.