Name: Ingegneria ed evoluzione del sintetico virus adeno-associato (AAV) Vettori Terapia genica attraverso la famiglia Shuffling DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Scopri come generare librerie di capsidi AAV sintetici mediante DNA family shuffling per la terapia genica. Questo metodo consente di selezionare vettori con proprietà migliorate per applicazioni terapeutiche specifiche.

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Gli autori ringraziano il supporto eccezionale di loro laboratorio, i membri del team e il lavoro del cluster di eccellenza CellNetworks all&#39;Università di Heidelberg così come dalla Chica e Heinz Schaller (CHS) fondazione. Apprezziamo che l&#39;evoluzione molecolare AAV via DNA shuffling famiglia è diventata un campo molto attivo dato che la nostra prima pubblicazione, tre anni fa e quindi chiedere scusa a tutti gli autori di pubblicazioni rilevanti il ​​cui lavoro non potevano essere citati qui a causa di vincoli di spazio.

<ol><li>Grimm, D., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+virus+evolution+to+vector+revolution%3A+use+of+naturally+occurring+serotypes+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+as+novel+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy.</a> Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+methods+for+gene+transfer+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes.</a> Methods. 28, 146-157 (2002).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li>
<li>Muller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).</li>
<li>Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22humanized%22+green+fluorescent+protein+cDNA+adapted+for+high-level+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells.</a> J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).</li>
<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatality+in+mice+due+to+oversaturation+of+cellular+microRNA%2Fshort+hairpin+RNA+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways.</a> Nature. 441, 537-541 (2006).</li>
<li>Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestricted+hepatocyte+transduction+with+adeno-associated+virus+serotype+8+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice.</a> J. Virol. 79, 214-224 (2005).</li>
<li>Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shuffling+of+adeno-associated+virus+yields+functionally+diverse+viral+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny.</a> Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+selection+of+shuffled+AAV+genomes%3A+a+new+strategy+for+producing+targeted+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles.</a> Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).</li>
<li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+AAV+Cap+sequences+alter+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction.</a> Virology. 386, 237-248 (2009).</li>
<li>Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myocardium+tropic+adeno-associated+virus+%28AAV%29+evolved+by+DNA+shuffling+and+in+vivo+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+engineering+of+a+gene+therapy+vector%3A+directed+evolution+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).</li>
<li>Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adeno-associated+virus+yields+enhanced+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors.</a> Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotypes%3A+vector+toolkit+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).</li>
<li>Kwon, I., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+gene+delivery+vectors%3A+molecular+engineering+and+evolution+of+adeno-associated+viral+vectors+for+enhanced+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer.</a> Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).</li>
<li>Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+evolution+with+adeno-associated+viral+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High.+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Artificial evolution with adeno-associated viral libraries.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).</li>
<li>McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+recombinant+adeno-associated+virus+%28scAAV%29+vectors+promote+efficient+transduction+independently+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis.</a> Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).</li>
</ol>

Tutti gli autori dichiarano di non avere nulla da rivelare.

Qui, abbiamo delineato i passaggi essenziali e le linee guida sperimentali per la AAV capside engineering attraverso la famiglia rimescolamento del DNA e per l&#39;evoluzione in cellule o negli animali. In sostanza, questi protocolli sono versioni standard delle procedure che per primi hanno riportato all&#39;interno del campo AAV nel 2008 3. Mentre una raffica di follow-up da altri studi hanno riportato numerose modifiche ad esempio, 10-13, i siti attuali rappresentano strategie fondament...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 </td></tr><tr><td> Polietilenimmina (PEI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td></tr><tr><td> Gli enzimi di restrizione </td><td> NEB </td><td> Vario </td></tr><tr><td> DNA ligasi T4 </td><td> NEB </td><td> M0202T </td></tr><tr><td> Gel kit di estrazione </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Phusion polimerasi II Kit </td><td> Finnzymes (NEB) </td><td> F-540S </td></tr><tr><td> HotStar Hifi polimerasi Kit </td><td> Qiagen </td><td> 202602 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Finnzymes (NEB) </td><td> F-540S (parte del kit) </td></tr><tr><td> EDTA (25 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 (parte del kit) </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Roth </td><td> 4.855,2 </td></tr><tr><td> Ampicilin sale di sodio </td><td> Roth </td><td> K029.2 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM, 100 pl) </td><td> Invitrogen </td><td> 18427013 </td></tr><tr><td> Iodixanolo (OptiPrep) </td><td> Axis-Shield </td><td> 1114739 </td></tr><tr><td> Phenolred </td><td> Merck </td><td> 107241 </td></tr><tr><td> Plasmide kit di preparazione mega </td><td> Qiagen </td><td> 12181 </td></tr><tr><td> Ultracentrifuga </td><td> Beckman-Coulter </td><td> Optima L90K </td></tr><tr><td> Quick-Seal provette da centrifuga; </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 342414 </td></tr><tr><td> Elettroporazione unità </td><td> Bio-Rad </td><td> GenePulserXcell </td></tr><tr><td> Termociclatore </td><td> Eppendorf </td><td> Vapo Protect </td></tr><tr><td> Riscaldamento blocco </td><td> BIOER </td><td> MB-102 </td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Olimpo </td><td> IX81 </td></tr><tr><td> FACS analizzatore </td><td> Beckman-Coulter </td><td> Cytomics FC500 MLP </td></tr><tr><td> MegaX DH10B T1R cellule </td><td> Invitrogen </td><td> C640003 </td></tr><tr><td> Benzonase </td><td> Merck </td><td> 101695 </td></tr><tr><td> Adenovirus-5 </td><td> ATCC </td><td> VR-5 </td></tr><tr><td> pBlueScript II KS (+) plasmide </td><td> Stratagene </td><td> 212207 </td></tr><tr><td> cap5F (Pac sito che ho in giallo, CAP5 specifiche sequenze in grassetto): GACTCTTAATTAACAGGT ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC </td><td> IDTDNA </td><td> Primer personalizzato </td></tr><tr><td> cap5R (Asc sito che ho in verde, CAP5 specifiche sequenze in grassetto): GTGAGGGCGCGCC TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC </td><td> IDTDNA </td><td> Primer personalizzato </td></tr></tbody></table>

ingegneria ed evoluzione del sintetico virus adeno-associato (aav) vettori terapia genica attraverso la famiglia shuffling dna

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Virali adeno-associati (AAV) vettori rappresentano alcuni dei veicoli più potenti e promettenti per il trasferimento del gene terapeutico umano a causa di una combinazione unica di proprietà benefiche 1. Questi includono la apathogenicity dei virus di tipo selvatico sottostanti e le metodologie più avanzate per la produzione di alta titolo di elevata purezza e vettori ricombinanti clinico-grado 2. Un ulteriore vantaggio particolare del sistema di AAV su altri virus è la disponibilità di una ricchezza di natura sierotipi che differiscono nelle proprietà essenziali ancora possono essere facilmente costruiti come vettori usando un protocollo comune 1,2. Inoltre, una serie di gruppi tra cui il nostro ha recentemente messo a punto le strategie per utilizzare questi virus naturali come modelli per la creazione di vettori sintetici, che combinano sia i beni di sierotipi di input, o che esaltano le proprietà di un singolo isolato. Le rispettive tecnologie per raggiungere questi obiettivi are sia DNA shuffling famiglia 3, ossia la frammentazione di vari geni del capside di AAV seguita dalla loro rimontaggio basato su omologie parziali (tipicamente&gt; 80% per la maggior parte sierotipi di AAV), o visualizzare peptide 4,5, inserimento cioè di solito in sette aminoacidi un ciclo esposta del capside virale in cui il peptide idealmente media ri-targeting per un tipo cellulare desiderato. Per il massimo successo, entrambi i metodi sono applicati in un high-throughput di moda in cui i protocolli sono up-scalati per produrre librerie di circa un milione di varianti distinte del capside. Ciascun clone è quindi composto da una combinazione unica di numerosi virus parentale (DNA shuffling approccio) o contiene un peptide distintivo all&#39;interno della stessa dorsale virale (approccio visualizzazione peptide). Il successivo passo finale è iterativa selezione di tale libreria sulle cellule bersaglio, al fine di arricchire per capsidi individuali che soddisfano la maggior parte o idealmente tutti i requisiti del processo di selezione. Quest&#39;ultimo preferibilmente pettineines pressione positiva, come la crescita su un tipo di cellula certo interesse, con la selezione negativa, per esempio, l&#39;eliminazione di tutti i capsidi che reagiscono con gli anticorpi anti-AAV. Questa combinazione aumenta la probabilità che capsidi sintetici sopravvissuti alla selezione corrispondono alle esigenze del data applicazione in un modo che probabilmente non sono stati trovati in ogni naturale AAV isolare. Qui, ci concentriamo sul metodo famiglia DNA shuffling come teoricamente e sperimentalmente più impegnativo delle due tecnologie. Descriviamo e dimostrare tutti i passi essenziali per la generazione e la selezione di librerie mischiate AAV (Fig. 1), e poi discutere le insidie ​​e gli aspetti critici dei protocolli che bisogna essere a conoscenza al fine di avere successo con l&#39;evoluzione molecolare AAV.

Dimostriamo la tecnica di base per progettare molecolare ed evolvere sintetici virale adeno-associati (AAV) vettori di terapia genica attraverso la famiglia shuffling DNA. Inoltre, fornire linee guida generali ed esempi rappresentativi per la selezione e l&#39;analisi delle singole capsidi chimerici con proprietà migliorate sulle cellule bersaglio in coltura o nei topi.

Ingegneria ed evoluzione del sintetico virus adeno-associato (AAV) Vettori Terapia genica attraverso la famiglia Shuffling DNA

I vettori virali adeno-associati (AAV) rappresentano alcuni dei veicoli più potenti e promettenti per il trasferimento genico terapeutico nell'uomo, grazie a un unico ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è creare una libreria altamente diversificata di capside virali adeno-associati sintetici, dalla quale si possano selezionare particelle dotate di una proprietà desiderata. Questo risultato si ottiene innanzitutto frammentando, clonando e selezionando geni del capside di un virus adeno-associato (aav) mediante digestione controllata del DNA con un'endonucleasi per permetterne successivamente il ripristino in sequenze chimere attraverso due reazioni di PCR. Come secondo passaggio, il prodotto di PCR risultante viene clonato nuovamente in un costrutto di aav dotato di capacità replicativa, generando così una libreria di plasmidi contenente almeno 1 milione di geni diversi del capside di aav.Successivamente, questa libreria di plasmidi viene trasfettata in cellule 293T, insieme a un plasmide helper adenovirale, al fine di produrre una libreria di virus chimerici che può quindi essere selezionata su cellule bersaglio o in animali. I risultati mostrano l'ingegnerizzazione molecolare e l'evoluzione con successo di nuovi vettori AAV sintetici, basate sull'espressione potenziata o più specifica di geni reporter in cellule in coltura o in topi a

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Qui, descriviamo una strategia efficiente e riproducibile per produrre, titolo e batch di controllo di qualità di vettori di virus adeno-associato. Permette all'utente di ottenere una preparazione di vettore con alto-titolo (≥ 1 x 1013 vettoriale genomi/mL) e un'elevata purezza, pronta per l'uso in vitro o in vivo .

Produzione, purificazione e controllo di qualità per i vettori basati su Virus Adeno-associato

Qui forniamo una procedura dettagliata per la produzione su larga scala di vettori AAV di grado di ricerca utilizzando cellule HEK 293 aderenti coltivate in pile cellulari e purificazione cromatografica di affinità. Questo protocollo produce costantemente &gt;1 x 1013 genomi vettoriali / mL, fornendo quantità vettoriali appropriate per studi su animali di grandi dimensioni.

Produzione di vettori virali adeno-associati in pile cellulari per studi preclinici in modelli animali di grandi dimensioni

Generazione della libreria di visualizzazione dei peptidi AAV e successiva validazione attraverso il codice a barre di candidati con nuove proprietà per la creazione di AAV di nuova generazione.

Isolamento dei vettori di terapia genica di prossima generazione attraverso l'ingegneria, il codice a barre e lo screening delle varianti del capside del virus adeno-associato (AAV)

Qui, presentiamo un protocollo per lo sviluppo e la convalida di buone pratiche di laboratorio nella rilevazione conforme di vettori virali adeno-associati in lacrime umane mediante reazione a catena della polimerasi digitale a supporto dello sviluppo clinico di vettori di terapia genica.

Un saggio di reazione a catena della polimerasi digitale a goccia validabile per la rilevazione di vettori virali adeno-associati negli studi di bioshedding delle lacrime

Il virus adeno-associato ricombinante (rAAV) è ampiamente utilizzato per la somministrazione genica clinica e preclinica. Un uso sottovalutato per i rAAV è la robusta trasduzione delle cellule in coltura senza la necessità di purificazione. Per i ricercatori che non conoscono l'rAAV, forniamo un protocollo per il clonaggio di cassette transgeniche, la produzione di vettori grezzi e la trasduzione di colture cellulari.

Espressione di transgeni in cellule in coltura utilizzando vettori virali adeno-associati ricombinanti non purificati

Il virus adeno-associato viene prodotto in coltura cellulare in sospensione e purificato mediante centrifugazione a gradiente di densità a doppio iodixanolo. Sono incluse misure per aumentare la resa totale del virus, diminuire il rischio di precipitazione del virus e concentrare ulteriormente il prodotto finale del virus. I titoli finali attesi raggiungono10-12 particelle virali/mL e sono adatti per l'uso preclinico in vivo .

Produzione e purificazione in coltura in sospensione di virus adeno-associati mediante centrifugazione a gradiente di densità di iodixanolo per applicazioni in vivo

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la generazione e la purificazione di vettori virali adeno-associati utilizzando un metodo cromatografico di affinità ottimizzato a base di eparina. Presenta un approccio semplice, scalabile ed economico, eliminando la necessità di ultracentrifugazione. I vettori risultanti mostrano un'elevata purezza e attività biologica, dimostrando il loro valore negli studi preclinici.

Isolamento di vettori virali adeno-associati attraverso un protocollo cromatografico di affinità con eparina a passaggio singolo e semiautomatico

La quantificazione precisa delle copie del genoma del vettore del virus adeno-associato (AAV) è fondamentale, ma un protocollo standardizzato deve ancora essere stabilito. Questo protocollo descrive un metodo convalidato per la preparazione di campioni di AAV purificati e per l'esecuzione di una reazione a catena della polimerasi (dd_PCR) digitale per quantificare in modo affidabile il titolo del genoma virale.

Quantificazione dei genomi virali adeno-associati in campioni di vettori purificati mediante reazione a catena della polimerasi a goccioline digitali

Questo protocollo mira a introdurre un metodo per produrre e purificare biomimetici extracellulari derivati dalle vescicole staminali mesenchimali (MSC) per la terapia genica. La nanovescicola è confinata da bilayer lipidici derivati dalla MSC e racchiude gli AAV ricombinanti che portano il gene di interesse nel lume. Questa nanovescicola offre un vettore potenziato per la trasmissione in vivo dei geni.

Sviluppo di nanovescicole mesenchimali avvolte nella membrana delle cellule staminali per un migliorato apporto genico

Salvataggio di virus dell'influenza A dal DNA plasmide è una tecnica di base ed essenziale sperimentale che consente ai ricercatori di generare virus influenzali ricombinanti per studiare i molteplici aspetti della biologia del virus dell'influenza, e da utilizzare come potenziali vettori o vaccini.

Generazione di influenza da virus ricombinante del DNA plasmidi

Scopri come generare librerie di capsidi AAV sintetici mediante DNA family shuffling per la terapia genica. Questo metodo consente di selezionare vettori con proprietà migliorate per applicazioni terapeutiche specifiche.

Ingegneria ed evoluzione del sintetico virus adeno-associato (AAV) Vettori Terapia genica attraverso la famiglia Shuffling DNA

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