Ingegneria ed evoluzione del sintetico virus adeno-associato (AAV) Vettori Terapia genica attraverso la famiglia Shuffling DNA

L'obiettivo generale del seguente esperimento è creare una libreria altamente diversificata di capside virali adeno-associati sintetici, dalla quale si possano selezionare particelle dotate di una proprietà desiderata. Questo risultato si ottiene innanzitutto frammentando, clonando e selezionando geni del capside di un virus adeno-associato (AAV) mediante digestione controllata del DNA con un enzima di restrizione, al fine di consentire la loro successiva riassemblaggio in sequenze chimere attraverso due reazioni di PCR. Come secondo passaggio, il prodotto di PCR risultante viene clonato nuovamente in un costrutto di AAV dotato di capacità replicativa, generando così una libreria di plasmidi contenente almeno 1 milione di geni diversi del capside AAV.

Successivamente, questa libreria di plasmidi viene trasfettata in cellule 293T, insieme a un plasmide helper adenovirale, al fine di produrre una libreria di virus chimerici che può quindi essere selezionata su cellule bersaglio o in animali. I risultati mostrano l'ingegnerizzazione molecolare e l'evoluzione con successo di nuovi vettori AAV sintetici, basati sull'espressione potenziata o più specifica di geni reporter in cellule in coltura o in topi adulti. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la visualizzazione di peptidi, è che il DNA family shuffling ha la potenzialità di modificare e migliorare simultaneamente molteplici caratteristiche del capside AAV, dal legame cellulare e il traffico intracellulare fino allo smantellamento e all'espressione genica nel nucleo.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei settori della terapia genica e della virologia, ad esempio come ottenere un vettore ideale per una specifica applicazione terapeutica o come identificare i domini di un capside virale responsabili di una determinata proprietà. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento di numerose malattie umane, inclusa l'infezione da agenti patogeni virali, poiché il nostro metodo consente l'evoluzione molecolare di vettori A V in grado di infettare in modo specifico e potente cellule bersaglio virali, come le cellule T per l'HIV o gli epatociti per i virus dell'epatite. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia di A V e possa essere utilizzato per migliorare i vettori AV per la terapia genica.

Questo metodo può essere facilmente applicato anche ad altre famiglie geniche di rilevanza fondamentale o applicata, come la fluorescenza codificante la dose, tre reporter, enzimi cellulari o proteine coinvolte nell'interferenza dell'RNA. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavamo cercando un vettore adatto per trasfondere frammenti di topi adulti con geni terapeutici, rendendoci conto che tutti i sierotipi naturali di AV presentavano svantaggi, come un'elevata prevalenza nella popolazione umana e, di conseguenza, una diffusa immunità preesistente, oppure una scarsa efficacia in vivo nonostante un'efficiente trasduzione in coltura. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la frammentazione del gene capsidico AV basata sul DNA e alcuni passaggi della produzione della libreria virale sono difficili da apprendere, in quanto richiedono esperienza e consapevolezza delle fasi critiche, al fine di facilitare la preparazione routinaria di quantità sufficienti dei diversi geni del capside virale adeno-associato.

Per la ricombinazione del DNA, questi geni vengono inizialmente sottoclonti in un vettore plasmidico comune. A tal fine, i geni cap desiderati vengono innanzitutto amplificati mediante PCR da plasmidi AAV comunemente disponibili, utilizzando i primer cap F e cap R. I geni cap vengono quindi clonati in un plasmide progettato per contenere specifici siti di legame per primer nonché siti di restrizione. In questo esempio, il gene cap viene clonato nei siti PAC uno e SC uno, presenti nei primer utilizzati per l'amplificazione del cap e nel plasmide ricevente, ma assenti nella maggior parte degli AAV. Dopo aver generato i set di plasmidi che codificano per i geni della capside AAV, si inizia la procedura di ricombinazione del cap mediante PCR, amplificando i geni cap di interesse utilizzando i primer T tre e T sette.

Impostare una reazione PCR da 50 microlitri contenente 200 nanogrammi di plasmide cap, ciascun primer a una concentrazione finale di due micromolari, 10 microlitri di buffer five x high five e un microlitro di polimerasi high five. Questa reazione produrrà circa tre microgrammi di prodotto PCR, quantità sufficiente per fino a sei reazioni di shuffling, a seconda del numero di geni cap da includere nella libreria. Iniziare con cinque minuti a 95 gradi Celsius, quindi eseguire 40 cicli di 15 secondi a 94 gradi Celsius, 30 secondi a 57 gradi Celsius e tre minuti a 68 gradi Celsius, seguiti da un passaggio finale di 10 minuti a 72 gradi Celsius.

Dopo aver purificato i prodotti della PCR, si utilizza una digestione controllata del DNA per creare frammenti del gene cap da riunire in Kyra. Uno degli aspetti più difficili di questa procedura è ottenere un intervallo utile di frammenti di DNA del gene cap digeriti, da riunire in kyras. A tal fine, si preparano quantità PLE di geni cap purificati e successivamente si impostano reazioni parallele multiple con condizioni variabili. Per impostare la digestione in modo uniforme, mescolare i diversi prodotti della PCR del gene cap fino a un quantitativo totale di quattro microgrammi in 54 microlitri di acqua, quindi aggiungere attentamente sei microlitri di tampone di reazione DS e 0,5 microlitri di DNA uno alla reazione, agitare delicatamente il tubo tre volte, centrifugare brevemente e porre immediatamente su un blocco riscaldante a 25 gradi Celsius.

Incubare questa prima reazione per un minuto. Successivamente, preparare una seconda reazione di digestione, ma incubare a 25 gradi Celsius per un minuto e 15 secondi. In questo modo, impostare più reazioni parallele con tempi di incubazione compresi tra uno e due minuti, variando il tempo di incubazione a incrementi di 15 secondi.

Fermare ogni reazione aggiungendo sei microlitri di EDTA 25 millimolare. Vortexare brevemente il tubo e incubare per 10 minuti a 75 gradi Celsius. Le reazioni parallele multiple produrranno cinque campioni di cap digeriti con DNA, uno per tempi di incubazione variabili; purificare i frammenti di cap su un gel standard di AROS all'1%.

In condizioni ideali, si dovrebbe osservare una striscia visibile compresa tra 100 e 500 paia di basi, come mostrato in questo esempio con tempi di incubazione iniziali di un minuto, 45 secondi o due minuti. I frammenti del cap vengono prima riassemblati in sequenze complete mediante una PCR di ricombinazione, nella quale si autoprimerizzano grazie a omologie parziali. Impostare una reazione da 50 microlitri con 500 nanogrammi di frammenti purificati, 10 microlitri di buffer fusion 10x, un microlitro di dNTP 10 millimolare, 1,5 microlitri di DMSO e 0,5 microlitri di fusion.

Due polimerasi incubano per 30 secondi a 98 gradi Celsius e quindi eseguono 40 cicli di 10 secondi a 98 gradi Celsius, 30 secondi a 42 gradi Celsius e 45 secondi a 72 gradi Celsius, seguiti da un passaggio finale di 10 minuti a 72 gradi Celsius. Successivamente, amplificare i geni del capside ricomposti per il clonaggio successivo mediante una seconda PCR utilizzando primer che si legano alle sequenze flanking conservate. Ad esempio, SAF e SAR o CUF e CUR preparano una reazione da 50 microlitri contenente due microlitri della prima PCR, ciascun primer a una concentrazione finale di due micromolare, 0,5 microlitri di cloruro di magnesio, 10 microlitri di buffer 5x high-FI e un microlitro di polimerasi high-FI.

Si raccomandano da 16 a 24 reazioni PCR per garantire rese sufficientemente elevate per il successivo clonaggio. Dopo aver raggruppato le PCR e purificato la banda completa del cap, il passaggio successivo consiste nel digerire il pool purificato del gene cap con PAC I e SC I per il clonaggio in un plasmide AAV competente per la replicazione. Il plasmide ricevente contiene le ripetizioni terminali invertite di AAV che delimitano il gene rep di AAV2 sotto il controllo del promotore P5 di AAV, nonché i siti PAC I e ASC I.

I siti di restrizione a valle di rep consentono il clonaggio in frame del pool di cap mescolati. I siti di legame per i primer LSE indicati dalle frecce sono utili per il sequenziamento del gene cap, frammentano i cap e il vettore ricettore tagliato in modo appropriato in un rapporto molare di tre a uno. Preparare una miscela madre con un volume totale di 40 microlitri, sufficiente per 20 trasformazioni, con una concentrazione finale di DNA di 15 nanogrammi per microlitro.

Incubare tutta la notte a 16 gradi Celsius; il giorno seguente, trasformare la reazione di ligazione in e coli. Mescolare due microlitri di reazione di ligazione con 30 microlitri di e coli elettrocompetente e trasferire in cuvette per elettroporazione precamerate sul ghiaccio; eseguire l'elettroporazione a 1,8 kilovolt, 200 ohm e 25 microfarad. La costante di tempo dovrebbe essere vicina a cinque millisecondi; aggiungere immediatamente un millilitro di mezzo SOC preriscaldato e trasferire in un matraccio da 250 millilitri.

20 di queste elettroporazioni produrranno una libreria con una diversità di circa un milione di cloni diversi. Aggiungere un volume di mezzo SOC preriscaldato alle trasformazioni raggruppate e agitare a 37 gradi Celsius e 180 giri al minuto per un'ora. Successivamente, aggiungere 40 millilitri delle trasformazioni raggruppate a 800 millilitri di mezzo LB contenente ampicillina e incubare per ulteriori 16 ore nelle stesse condizioni; quindi il DNA plasmidico della libreria viene purificato utilizzando un kit disponibile in commercio.

La produzione della libreria virale inizia con la trasfezione di cellule HEC 2 9 3 T con la libreria a a v. Per iniziare questa procedura, seminare cellule HEC 2 9 3 T in piastre quadrate da 10-15 centimetri e coltivarle per 48 ore a 37 gradi Celsius. Per ogni trasfezione, preparare le seguenti due miscele di reagenti in due provette separate. Le seguenti quantità sono indicate per 10 piastre nella prima provetta.

Mescolare 7,9 millilitri di cloruro di sodio e DNA e aggiungere acqua fino a un volume totale di 15,8 millilitri. Nel secondo tubo, aggiungere 3,52 millilitri di polietileneammina, 7,9 millilitri di cloruro di sodio e 4,38 millilitri di acqua. Combinare le miscele, vortexare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi distribuire la soluzione uniformemente in ogni piastra di cellule HEK 293T. Incubare a 37 gradi Celsius.

Dopo 48 ore, la libreria virale può essere raccolta. Raschiare le cellule nel mezzo, raccogliere le cellule da tutte le piastre in un unico tubo e centrifugare a 1200 giri/min per 15 minuti. Risospendere il pellet cellulare in sei millilitri di buffer di lisi, quindi sottoporre a cinque cicli di congelamento-scongelamento; al termine dei cinque cicli, incubare con Ben Nase per un'ora a 37 gradi Celsius.

Successivamente, centrifugare i detriti cellulari a 3.750 giri/min per 20 minuti. Preparare un gradiente per la purificazione del virus utilizzando una pipetta Pasteur per aggiungere cinque millilitri di sospensione virale in un tubo Beckman Quick-Seal per centrifuga, seguiti da 1,5 millilitri ciascuno di soluzione al 15%, 25% e 40% di iodixanolo. Completare il gradiente con tampone di lisi e ultracentrifugare a 50.000 × g per due ore a quattro gradi Celsius.

Al termine dell'ultracentrifugazione, rimuovere il tubo dal rotore e pulire l'esterno del tubo con etanolo al 70%. Inserire un ago nella parte superiore del tubo per la ventilazione e utilizzare un altro ago per prelevare 1,2 millilitri della frazione IOL al 40%. Prestare attenzione a non prelevare dalla frazione al 25%, poiché contiene particelle vuote.

Capsidi AAV. Singole copie della libreria originale di plasmidi vengono analizzate per valutarne la funzionalità e la diversità, utilizzandole per produrre vettori ricombinanti. Cellule in coltura o animali esprimenti un gene reporter vengono quindi infettati con diverse quantità del virus purificato e l'efficienza di trasduzione viene determinata.

Qui sono mostrati i risultati di microscopia a fluorescenza di tre linee cellulari umane infettate con cinque diversi vettori ricombinanti esprimenti YFP con geni cap riordinati. Un metodo alternativo per analizzare l'efficienza di trasduzione è la misurazione basata su fatti dell'espressione del gene reporter fluorescente. Questa figura mostra un risultato tipico di quattro tipi cellulari, umano, renale, cervice umana, fibroblasti murini e linfociti T umani, infettati con 18 diversi vettori ricombinanti esprimenti YFP con geni cap riordinati, selezionati casualmente da una libreria originale.

L'espressione di YFP è stata codificata con colori per una visualizzazione più semplice. Le percentuali rappresentate si riferiscono alle cellule transdotte, in cui il nero indica lo 0% e il bianco indica il valore più alto misurato in ciascun clone di tipo cellulare. Il clone B due rosso esemplifica un clone con scarsa efficacia complessiva, come ci si può aspettare da capside non selezionati. La libreria virale può quindi essere sottoposta a screening per identificare singole particelle che mostrano la maggior parte o tutte le proprietà desiderate in una determinata linea cellulare o negli animali, per la selezione.

In cellule coltivate, le cellule vengono innanzitutto co-infettate con diversi aliquote della libreria e del virus ENO cinque per favorire la crescita di a a v; successivamente, le cellule vengono raccolte ed il a a v amplificato viene estratto e utilizzato per reinfectare nuove cellule. La determinazione del rapporto ottimale tra a a v e adenovirus per la co-infezione delle cellule è fondamentale, e un buon indicatore di infezione virale efficace è la comparsa di effetti citopatici a tre giorni dall'inoculazione virale, evidenziati dall'arrotondamento e dal distacco cellulare. In questa figura, il pannello in alto a sinistra mostra cellule non infette, mentre gli altri pannelli mostrano cellule infette con le quantità indicate di adenovirus espresse in particelle per cellula. Un altro parametro utile per valutare l'infezione e l'amplificazione di a a v è il rilevamento delle proteine del capside mediante blotting western, utilizzando l'anticorpo B one che riconosce un epitopo altamente conservato del capside di a a v.

La membrana di sinistra mostra cellule co-infettate con diversi volumi in microlitri di una libreria a a V e del virus helper ENO. Le prime due corsie rappresentano ottimi esempi di condizioni che producono un'espressione della proteina a a v appena rilevabile, indicando un'infezione e amplificazione di a a v sufficiente ma non eccessiva, e quindi un desiderato accoppiamento stretto genotipo-fenotipo. Pertanto, 0,11 o 10 microlitri di questi supernatanti sono stati utilizzati per reinfectare cellule fresche.

I risultati del western blot sono mostrati nelle celle a destra. Nelle cellule LA sono state infettate con un vettore a solo, come controllo negativo. È inoltre fondamentale monitorare la diversità della libreria durante ripetuti cicli di infezione mediante sequenziamento del DNA.

Questo diagramma mostra il confronto tra le sequenze proteiche di cloni di AAV provenienti da una libreria basata sugli AAV 2, 8 e 9, prima e dopo la selezione. Le sequenze al di sopra della linea rossa rappresentano gli AAV parentali. Le frecce viola indicano eventi di ricombinazione omologa. La freccia rossa indica un ricongiungimento tra AAV 2 e AAV 9, osservato in tutti i cloni selezionati. Per la selezione negli animali, la libreria di AAV viene infusa negli animali, recuperata dalle cellule o tessuti bersaglio mediante PCR, quindi riclonata e ripacchettata per un nuovo ciclo di infezione.

Qui viene mostrato un esempio di recupero di cloni di virus a adeno-associato infettivi ottenuti da fegati di topo una settimana dopo l'infusione periferica della libreria. La corsia uno mostra la banda prevista di 2,2 chilobasi, mentre la corsia due è un controllo senza stampo; le dimensioni delle bande del marcatore di DNA nella corsia M sono indicate in chilobasi. Indipendentemente dalla procedura di selezione, le varianti di capside arricchite devono infine essere convalidate in sistemi appropriati.

Un esempio delle prestazioni superiori di una kymera a a V arricchita in cellule coltivate è mostrato qui. Colori più scuri indicano un'infettività maggiore per numero di particelle, e quindi per clone. A-A-V-D-J supera un insieme di otto tipi selvatici naturali a a v in un'ampia gamma di linee cellulari.

Infine, viene mostrata un'analisi di un clone di AAV KYMERA selezionato nel fegato di topo. Un AAV DN è stato selezionato per la sua capacità di trasdurre cellule di epatoma e successivamente utilizzato per produrre vettori ricombinanti esprimenti luciferasi. I topi rappresentativi, tre per gruppo, sono stati analizzati una settimana dopo l'infusione periferica di dosi equimolari di questo vettore o di un controllo basato sull'AAV di tipo selvatico otto, uno degli isolati naturali più potenti noti per il fegato di topo. Si noti che, sebbene il clone AAV DN produca un'espressione leggermente inferiore nel fegato, esso risulta più specifico per questo organo poiché mostra un notevole riduzione del targeting fuori bersaglio nei tessuti non epatici, una volta corretti i livelli di espressione epatica tramite il software di imaging.

Questa tecnica può essere eseguita in una settimana, iniziando con l'amplificazione dei geni del capside di a a V e terminando con la libreria virale, a condizione che venga eseguita correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che il protocollo fornito qui è stato ricavato dalla nostra esperienza nella selezione di sierotipi naturali di AV e che è molto probabile che alcune delle condizioni debbano essere adattate e ottimizzate quando altri utenti realizzeranno le proprie librerie personalizzate. Oltre a questa procedura, altri metodi come la visualizzazione di peptidi mediante mutagenesi sito-diretta con AGENESIS o la randomizzazione basata su PCR possono essere eseguiti per generare anche librerie altamente diverse o per tentare di migliorare ulteriormente le proprietà dei capside creati ed arricchiti mediante DNA family shuffling dopo il loro sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del trasferimento genico virale per esplorare strategie terapeutiche per malattie e cellule bersaglio correlate, per le quali i tipi convenzionali di A VC avevano fornito risultati insoddisfacenti, come nell'infezione da HIV e nelle cellule T, nonché per studiare il trasferimento genico mediato da vettori in cellule staminali umane e altre cellule cardiache al fine di infettare cellule in coltura. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ingegnerizzare ed evolvere librerie altamente diversificate di vettori virali adeno-associati sintetici utilizzando una combinazione di frammentazione genica e riassemblaggio, nonché di come selezionare in linea di principio queste librerie in cellule in coltura o in animali al fine di arricchire singoli capside con specifiche proprietà desiderate per l'uso come vettori di trasferimento genico. Non dimenticare che lavorare con adenovirus può essere pericoloso e che molte precauzioni devono essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.