Name: A primaria del sistema cultura Neuron per lo Studio della latenza del virus Herpes Simplex e la riattivazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Scopri come studiare la latenza e la riattivazione del virus herpes simplex tipo 1 utilizzando colture primarie di neuroni. Questo metodo permette di analizzare le interazioni virus-neurone a livello molecolare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ringraziamo i revisori per i loro suggerimenti premurosi che hanno contribuito a migliorare questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni a favore di MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) e IM (AI073898, GM056927) dal NIH. MK è stata sostenuta in parte da una formazione sovvenzione del NIH (5T32 AI007180).

<ol><li>Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+duration+of+growth+factor+signaling+through+receptor+tyrosine+kinases+regulates+HSV-1+latency+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons.</a> Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).</li>
<li>Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+MI+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22">Protocols for Neural Cell Culture</a>. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 71-94 (2001).</li>
<li>Letourneau, P. C. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLetourneau%2C+PC+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22">Protocols for Neural Cell Culture</a>. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 245-254 (2001).</li>
<li>Price, J. P., Brewer, G. J. Serum-free media for neural cell cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPrice%2C+JP+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22">Protocols for Neural Cell Culture</a>. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 255-264 (2001).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd Ed, ASM Press. (2008).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. The family Herpesviridae: A brief introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+infection+of+isolated+autonomic+neurons+in+culture%3A+viral+replication+and+spread+in+a+neuronal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network.</a> Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).</li>
<li>Tomishima, M. J., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+alpha-herpesvirus+protein+necessary+for+axonal+localization+of+viral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins.</a> J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+primary+and+transformed+neuronal+cells+for+studying+pseudorabies+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection.</a> Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).</li>
<li>Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+glycoprotein+E+is+required+for+axonal+localization+of+capsid%2C+tegument%2C+and+membrane+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins.</a> J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).</li>
<li>Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+us11+gene+product+with+the+cellular+kinesin+light-chain-related+protein+PAT1+results+in+the+redistribution+of+both+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides.</a> J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).</li>
<li>Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus%3A+propagation%2C+quantification+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1(2005).</li>
<li>Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O'Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+thiourea+compounds+that+inhibit+herpes+simplex+virus+type+1+DNA+cleavage+and+encapsidation%3A+resistance+maps+to+the+UL6+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene.</a> J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).</li>
<li>Newcomb, W. W., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+herpes+simplex+virus+replication+by+WAY-150138%3A+assembly+of+capsids+depleted+of+the+portal+and+terminase+proteins+involved+in+DNA+encapsidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation.</a> J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).</li>
<li>Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+1+immediate-early+and+early+gene+expression+during+reactivation+from+latency+under+conditions+that+prevent+infectious+virus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production.</a> J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).</li>
<li>Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+promoter+activity+during+latency+establishment%2C+maintenance+and+reactivation+in+primary+dorsal+root+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro.</a> J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).</li>
<li>Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+induce+reactivation+of+herpes+simplex+virus+type+1+in+a+latency-associated+transcript-+independent+manner+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells.</a> J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).</li>
<li>Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxed+repression+of+herpes+simplex+virus+type+1+genomes+in+murine+trigenminal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons.</a> J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).</li>
<li>Harris, R. A., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+latency+in+vitro+by+the+herpes+virus+type+1+mutant+in1918%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918.</a> J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).</li>
<li>Wagner, E. K., Bloom, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+investigation+of+herpes+simplex+virus+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Experimental investigation of herpes simplex virus latency.</a> Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).</li>
<li>Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+and+functional+comparison+of+the+latency-associated+transcript+promoters+of+herpes+simplex+virus+type+1+strains+KOS+and+McKrae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae.</a> J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).</li>
<li>Stroop, W. G., Banks, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+strain+KOS-63+does+not+cause+acute+or+recurrent+ocular+disease+and+does+not+reactivate+ganglionic+latency+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo.</a> Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).</li>
<li>Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+latent+herpes+simplex+virus+type+1+genome+copy+number+in+individual+neurons+is+virus+strain+specific+and+correlates+with+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation.</a> J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).</li>
<li>Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+molecular+analysis+of+the+avirulent+wild-type+herpes+simplex+virus+type+1+strain+KOS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS.</a> J. Virol. 58, 203-211 (1986).</li>
<li>Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor-dependence+of+herpes+simplex+virus+latency+in+peripheral+sympathetic+and+sensory+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro.</a> J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).</li>
<li>Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+vestibular+ganglion+neurons+demonstrate+latent+herpes+simplex+type+I+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation.</a> Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).</li>
<li>Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culture+model+of+facial+palsy+resulting+from+reactivation+of+latent+herpes+simplex+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1.</a> Otology & Neurotology. , Forthcoming (2012).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Questa cultura neurone primario e l&#39;infezione del sistema fornisce un metodo semplice ed efficace per esplorare i meccanismi molecolari alla base HSV-1 la latenza e la riattivazione. Il sistema riprende fedelmente le caratteristiche di latenza accettati definiti in entrambe le infezioni umane ed in live-modelli animali. Quando il virus è latente nelle culture SCG, particelle virali infettive e prodotti genici litici non può essere rilevato. L&#39;unico prodotto del gene virale rilevato in neuroni la...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Comments </td></tr><tr><td> 70μm nylon filtro (filtro cella) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Salt 1x Hank soluzione equilibrata (HBSS - / -) </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> w / o CaCl 2 e MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1x supporti minimi essenziali (MEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11095-080 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Fluoro-2&#39;-desossiuridina </td><td> Sigma </td><td> F0503 </td><td> preparare 20 mM in 1x MEM, da conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> 96 e piastre piane TC ben inferiori </td><td> Corning </td><td> 3599 </td><td></td></tr><tr><td> Acyclovir </td><td> &lt;em&gt; Calbiochem </td><td> 114798 </td><td> preparare 31 mM in DMSO; conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Afidicolina </td><td> Calbiochem </td><td> 178273 </td><td> preparare stock 10 mM in DMSO; conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> B-27 Supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-44 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi </td><td> Sigma </td><td> C2674 </td><td> preparare i 10 mg / ml in magazzino HBSS - / -; conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> D-(+)-Glucosio </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td> preparare 40% stock in H 2 O; filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Sigma </td><td> L2020 </td><td> preparare 1 mg / ml in magazzino H 2O; rapido congelamento 20 plaliquats e conservare a -80 ° C, diluita a 2 ug / ml di lavoro conc. sterile in H 2 O </td></tr><tr><td> Leibovit&#39;z L-15 supporti </td><td> Invitrogen </td><td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Nerve Growth Factor </td><td> Harlan Laboratories </td><td> BT.5017 </td><td> preparare i 50 mg / ml in magazzino HBSS - / -, da conservare a -80 ° C </td></tr><tr><td> Media Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 12348 </td><td></td></tr><tr><td> Acido fosfonoacetico (PAA) </td><td> Sigma </td><td> P6909 </td><td> preparare i 75 mg / ml in magazzino H 2 O; conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Poly-D-lisina bromidrato </td><td> Sigma </td><td> P0899 </td><td> preparare i 20 mg / ml in magazzino H 2 O; conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Rat-tail collagene </td><td> Millipore </td><td> 08-115 </td><td>Concentrazione varia con il lotto di fornitura; conservare a 4 ° C e diluire a 0,66 mg / ml conc di lavoro. sterile in H 2 O </td></tr><tr><td> A tricostatina </td><td> Sigma </td><td> T8552 </td><td> preparare 1 mM in DMSO; conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Tripsina 2,5% </td><td> Invitrogen </td><td> 15090-04 </td><td></td></tr></tbody></table>

a primaria del sistema cultura neuron per lo studio della latenza del virus herpes simplex e la riattivazione

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1) stabilisce una vita lunga infezione latente nei neuroni periferici. Questo serbatoio latente è la fonte di eventi riattivazione ricorrenti che garantiscono la trasmissione e contribuire alla malattia clinica. Antivirali attuali non influenzano il serbatoio latente e non ci sono vaccini. Mentre i dettagli molecolari di replicazione litico sono ben caratterizzati, meccanismi che controllano la latenza nei neuroni rimangono elusivi. La nostra attuale comprensione di latenza è derivato da studi in vivo su modelli animali di piccole dimensioni, che sono stati indispensabili per la definizione dei requisiti dei geni virali e il ruolo delle risposte immunitarie. Tuttavia, è impossibile distinguere effetti specifici sul virus-neurone rapporto da conseguenze più generali di infezione mediati da cellule immunitarie di sostegno o non neuronali in animali vivi. Inoltre, la sperimentazione animale è costosa, richiede tempo, e limitate in termini di opzioni disponibili per la manipolazione di accoglienzaprocessi. Per superare queste limitazioni, un neurone solo sistema è disperatamente necessario che riproduce la vivo nelle caratteristiche di latenza e la riattivazione, ma offre i vantaggi di coltura tissutale in termini di omogeneità e di accessibilità. Qui vi presentiamo un modello in vitro utilizzando colture di neuroni primari dai gangli simpatici rat cervicale superiore (SCG) (Figura 1) per studiare HSV-1 la latenza e la riattivazione che si adatta maggior parte se non tutti i criteri desiderati. Dopo aver eliminato cellule non neuronali, vicino omogenei TrkA + colture neuronali sono infettati con HSV-1 in presenza di acyclovir (ACV) per sopprimere la replicazione litico. Dopo la rimozione ACV, non produttivi infezioni da HSV-1 che presentano caratteristiche fedelmente accettato di latenza sono stabiliti in modo efficiente. In particolare, mRNA litici, proteine ​​e virus infettivo diventa non rilevabile, anche in assenza di selezione, ma latenza associata trascrizione (LAT) expression persiste in nuclei neuronale. Genomi virali sono mantenuti ad un numero medio di copie 25 per neurone e possono essere indotte a replicare produttivamente interferendo con PI3-chinasi / Akt segnalazione o il ritiro semplice del nerve growth factor 1. A ricombinante HSV-1 EGFP codifica fusa alla proteina virale US11 litico fornisce uno funzionale, in tempo reale marcatore per la replica risultante da riattivazione che è facilmente quantificato. In aggiunta ai trattamenti chimici, metodologie genetiche come la RNA-interferenza o il gene di consegna attraverso vettori lentivirali può essere applicato con successo al sistema di autorizzazione gli studi meccanicistici che sono molto difficili, se non impossibile, negli animali. In sintesi, il SCG-based HSV-1 la latenza / riattivazione sistema fornisce un potente strumento necessario per svelare i meccanismi molecolari che controllano HSV1 latenza e riattivazione nei neuroni, un puzzle di lunga data in virologia, la cui soluzione può offrire nuove intuizioni nello sviluppo di nuove terapie che obiettivo tsi riserva herpesvirus latente.

Il protocollo descrive un sistema modello efficiente e riproducibile per studiare herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1) latenza e riattivazione. Il dosaggio utilizza omogenei culture neurone simpatico e consente la dissezione molecolare del virus-neurone interazioni utilizzando una varietà di strumenti interferenza tra RNA e l&#39;espressione di proteine ​​ricombinanti.

A primaria del sistema cultura Neuron per lo Studio della latenza del virus Herpes Simplex e la riattivazione

Il virus dell'herpes simplex di tipo 1 (HSV-1) stabilisce un'infezione latente permanente nei neuroni periferici. Questo serbatoio latente è la fonte di ricorrenti...

Lo scopo di questo esperimento è dimostrare come un sistema di coltura cellulare primaria di neuroni possa essere utilizzato per studiare la latenza e la riattivazione del virus dell'herpes simplex. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto i neuroni dei gangli cervicali superiori da embrioni RA e coltivando i neuroni isolati da gangli dissociati dopo l'eliminazione delle cellule non neuronali. Viene stabilita un'infezione latente da HSV utilizzando un virus EGFP per infettare i neuroni in presenza di un inibitore della replicazione litica.Il passo successivo consiste nell'indurre la riattivazione delle colture infette latenti. Infine, l'efficienza della riattivazione viene valutata monitorando l'espressione di EGFP nel tempo. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano come diverse vie di segnalazione neuronale regolino la latenza e la riattivazione del virus dell'herpes simplex attraverso l'uso di inibitori chimici, interferenza dell'RNA e trasferimento genico.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente studi dettagliati delle interazioni che regolano la latenza del virus dell'herpes simplex nella neurone ospite a livello

a-primary-neuron-culture-system-for-study-herpes-simplex-virus

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un metodo di tracciare neuroni sinapticamente collegate è descritto. Usiamo specificità TVA di una cella a monte per sondare se una popolazione di cellule riceve input sinaptico da tipi di cellule geneticamente definiti.

Viral Tracciamento di geneticamente definito circuiti neurali

La maggior parte degli studi sulla malattia erpetica corneale utilizzare un modello di infezione primaria. Tuttavia, l'infezione primaria con HSV-1 non tipicamente portare a malattie umane. Qui si descrive un modello ricorrente della malattia erpetica corneale, che più da vicino imita malattia umana.

Ricorrente cheratite erpetica Stromal in Mouse, un modello per lo studio HSK umano

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Fonte: Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Purificazione del DNA virale per l'identificazione delle proteine virali e cellulari associate. J. Vis. Exp. (2017)Questo video dimostra l'infezione di cellule mammifere in fase stazionaria con HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1), seguita dalla replicazione del genoma virale mediante la macchinaria di replicazione virale e dell'ospite. Un analogo nucleosidico sintetico viene incorporato nel DNA virale appena sintetizzato per etichettare i genomi in...

Marcatura dei genomi di HSV-1 in replicazione con un analogo nucleosidico

L'imaging cellulare dal vivo di infezioni da virus alphaherpes consente l'analisi degli eventi dinamici di trasporto diretto e la diffusione intercellulare. Qui vi presentiamo le metodologie che utilizzano ceppi virali ricombinanti che esprimono proteine ​​di fusione fluorescenti per facilitare la visualizzazione delle assemblee virale durante l'infezione di neuroni primari.

Imaging cellulare dal vivo di Alphaherpes Virus Trasporti anterograda e Diffusione

Abbiamo stabilito un protocollo di ibridazione fluorescente in situ per la rilevazione di un genoma del virus DNA persistente all'interno di sezioni tissutali di modelli animali. Questo protocollo permette studiando processo di infezione da codetection del genoma virale, i suoi prodotti di RNA e proteine ​​virali o cellulari all'interno delle cellule singole.

La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining

La pelle è un tessuto bersaglio del virus dell'herpes simplex umano di tipo 1 (HSV-1). Per esplorare la via di invasione dell'HSV-1 nei tessuti, abbiamo stabilito un modello di infezione ex vivo di fogli epidermici murini che rappresentano lo strato più esterno della pelle.

Ex Vivo infezione di Murine epidermide con Herpes Simplex Virus di tipo 1

È fondamentale in neurobiologia e neurovirologia avere un sistema in vitro affidabile e replicabile che funga da modello traslazionale per ciò che avviene in vivo nei neuroni umani. Questo protocollo descrive come coltivare e differenziare le cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y in neuroni vitali per l'uso in applicazioni in vitro.

La differenziazione del SH-SY5Y neuroblastoma umano linea cellulare

In questo rapporto, vengono evidenziati i vantaggi delle colture organotipiche e colture primarie dissociate di gangli spinali del mouse-derivati per studiare una vasta gamma di meccanismi connessi con interazione neurone-glial, neuroplasticità, neuroinflammation e risposta all'infezione virale.

Topo adulto DRG Explant e dissociato modelli cellulari per studiare neuroplasticità e risposte agli insulti ambientali, compreso l'infezione virale

Un protocollo di throughput elevato per la valutazione funzionale di riattivazione efficiente HIV e clearance del provirus latenti è descritto e applicato dalla prova dell'impatto di interventi sulla trascrizione di HIV e di splicing. Risultati rappresentativi dell'effetto di latenza inversione agenti sulla trascrizione LTR-driven e splicing sono forniti.

Alta velocità effettiva In Vitro valutazione della latenza inversione agenti sulla trascrizione di HIV e Splicing

Questo protocollo descrive un sistema in vitro per modellare l'infezione de novo litica dell'herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi utilizzando virioni derivati da BAC16. Il metodo consente di studiare la replicazione e la diffusione virale precoce. La produzione di virus infettivi è quantificata mediante saggi di unità infettive basate su GFP e PCR in tempo reale di genomi virali incapsulati.

Determinazione e quantificazione dell'infezione litica de novo da herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi libero da cellule

Scopri come studiare la latenza e la riattivazione del virus herpes simplex tipo 1 utilizzando colture primarie di neuroni. Questo metodo permette di analizzare le interazioni virus-neurone a livello molecolare.

A primaria del sistema cultura Neuron per lo Studio della latenza del virus Herpes Simplex e la riattivazione

Esplora altri video