A primaria del sistema cultura Neuron per lo Studio della latenza del virus Herpes Simplex e la riattivazione

Lo scopo di questo esperimento è dimostrare come un sistema di coltura cellulare di neuroni primari possa essere utilizzato per studiare la latenza e la riattivazione del virus dell'herpes simplex. Ciò si ottiene isolando prima i neuroni dei gangli cervicali superiori dagli embrioni di AR e i neuroni di coltura isolati dai gangli dissociati dopo l'eliminazione delle cellule non neuronali. Un'infezione latente da HSV viene stabilita utilizzando un virus EGFP per infettare i neuroni in presenza di un inibitore della replicazione litica.

Il passo successivo consiste nell'indurre la riattivazione delle colture infette latenti. Infine, l'efficienza della riattivazione viene valutata monitorando l'espressione di EGFP nel tempo. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano come diverse vie di segnalazione neuronale regolano la latenza e la riattivazione del virus dell'herpes simplex attraverso l'uso di inibitori chimici, l'interferenza dell'RNA e la consegna genica.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente studi dettagliati delle interazioni che regolano la latenza forestale dell'herpes simplex nel neurone ospite a livello molecolare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della latenza forestale dell'herpes simplex, come ad esempio quali sono i segnali che agiscono per reprimere il genoma latente e come viene innescata la riattivazione a livello molecolare? Nei neuroni, tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulla latenza dell'HSV uno.

Può anche essere applicato ad altri virus neurotrofici dell'herpes alfa A dimostrare la procedura saranno Marigo, Kochi e Julian Kim, entrambi studenti laureati nei nostri laboratori I gangli cervicali superiori o i neuroni SCG per questo protocollo sono isolati da cuccioli di ratto E 21 che sono stati rimossi dall'utero di una femmina di ratto incinta. Lavorando in un cappuccio di dissezione, sacrifica ogni cucciolo puntando le forbici alla base del collo appena sopra le spalle e tagliando la testa dal busto. Per esporre i gangli, utilizzare aghi da 23 gauge per fissare la testa, con il collo rivolto verso l'alto in tre punti.

Per prima cosa appuntate il midollo spinale. In secondo luogo, tirare la pelle anteriore sopra il naso e fissare e il terzo bloccare la trachea dell'esofago lontano dalla parte posteriore del collo. Cerca l'SCG individuando la biforcazione dell'arteria carotide.

L'arteria carotide è una struttura accoppiata. Ci sono due biforcazioni su entrambi i lati del manico, quindi due CGS s per pop. L'SCG si trova appena sotto il ramo.

Separare l'SCG dalle arterie separando la biforcazione usando le due estremità. L'SCG è traslucido e incolore rispetto al tessuto adiposo giallastro opaco che circonda la biforcazione. Mettere i gangli in 12 millilitri di L 15.

Terreno integrato con glucosio in un tubo conico da 15 millilitri su ghiaccio. Dopo che tutti gli SCG vengono raccolti dagli embrioni e tirati delicatamente al centro dei gangli per un minuto. A 600 giri/min, rimuovere il supporto in eccesso Reese.

Sospendere i gangli in un millilitro di L 15. Terreni contenenti tripsina e collagenasi. Incubare i 24 minuti a 37 gradi Celsius.

Agitare ogni otto minuti. Quindi, aggiungere 10 millilitri di terreno marino per inattivare la centrifuga di tripsina per un minuto. A 600 giri/min, rimuovere il più possibile la quantità di terreno di prova collagenasi e lavare i gangli con 10 millilitri di centrifuga di terreno C per un minuto a 600 giri/min.

Ripetere questo lavaggio una volta. Rimuovere il mezzo di lavaggio e risospendere i gangli in un millilitro di terreno C per dissociare il tritrato t utilizzando un ago calibro 21 collegato a una siringa da cinque millilitri per un massimo di 15 cicli su e giù. Terminato il tri rating utilizzando un ago calibro 23 fino a quando la maggior parte dei grumi non si è dissociata.

Rimuovere eventuali grumi di cellule rimanenti filtrando i neuroni dissociati attraverso un filtro di nylon da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri. Prelevare un'aliquota di 10 microlitri della sospensione cellulare filtrata, una miscela di triam blue per determinare il numero di cellule vive. Contare il numero di cellule che escludono attivamente il colorante utilizzando un emocitometro.

Quindi, erogare da 5.000 a 6.000. Le cellule vive totali in 100 microlitri di terreno C in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale da 96 pozzetti pre-rivestita con collagene e laminina includono un fattore di crescita nervoso di 50 nanogrammi per millilitro nel terreno C. Incubare durante la notte, a 37 gradi Celsius il giorno successivo, il primo giorno in vitro o DIV, verificare il corretto attaccamento dei neuroni e la crescita di alcune proiezioni assonali.

Sostituire il terreno C nei pozzetti con 50 microlitri di terreno neuro basale o NBM contenente NGF Acho e cinque fluoro due doxiuridina. Sostituire il supporto una riga alla volta per assicurarsi che le celle non si secchino. Incubare le colture a 37 gradi Celsius per cinque giorni.

Monitorare quotidianamente la coltura per confermare la morte delle cellule non neuronali e la crescita dei neuroni. Per iniziare questa parte della procedura al sesto giorno in vitro, verificare che la maggior parte delle cellule di supporto non neuronali sia stata eliminata. È estremamente importante ridurre al minimo la manipolazione fisica non necessaria del neurone in ogni momento.

La rimozione e la sostituzione dei terreni devono essere eseguite molto delicatamente e lentamente, altrimenti lo stress meccanico risultante può influire sulla vitalità dei neuroni. Aggiungere aciclovir o un CV al terreno esistente in ciascun pozzetto fino a una concentrazione finale di 100 micromolari. Aggiungere un CV lentamente e delicatamente per garantire che la forza meccanica non influisca negativamente sulle cellule il giorno successivo.

Al DIV sette, infettare le colture SCG con un HSV ricombinante che esprime un reporter EGF fuso con la proteina litica virale US 11 con una molteplicità di infezioni compresa tra uno e due. Aggiungere il virus diluito direttamente al terreno esistente nel pozzetto. Includi un finto controllo infetto e un'infezione litica.

Controllo positivo in terreni privi di CV. Lasciare procedere l'infezione per due o tre ore a 37 gradi Celsius. Successivamente, sostituire il terreno di infezione con NBM fresco contenente NGF e un CV.It è fondamentale per essere estremamente delicati quando si cambia il mezzo di infezione. Inclinare la piastra verso di sé e rimuovere lentamente il supporto dal fondo del pozzetto.

Quindi puntare la punta della pipetta verso la parete del pozzetto anziché verso il fondo del pozzetto e lasciare che il terreno scivoli delicatamente verso il basso sulle cellule. Sostituire una fila di supporti alla volta per evitare che le celle si secchino. Riportare le colture nell'incubatore, maneggiandole il più delicatamente possibile per evitare di compromettere la loro capacità di supportare la latenza HSV one.

Mantieni le colture per sei giorni a 37 gradi Celsius, durante i quali il virus stabilirà una latenza. Durante questo periodo. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per monitorare l'espressione di EGFP 11 come indicatore della replicazione litica.

Come previsto, non dovrebbe esserci espressione di GFP nel controllo infetto simulato. S 11 L'EGFP deve essere rilevato solo nell'infezione. I pozzetti di controllo positivi mancano di un trattamento CV che indica il successo dell'infezione primaria e la replicazione litica produttiva.

Per valutare la riattivazione alla DIV 14, sostituire attentamente il supporto contenente un CV con un supporto nuovo privo di CV come prima. Puntare la punta della pipetta verso la parete del pozzetto piuttosto che verso il fondo del pozzetto e, se necessario, lasciare che il terreno scivoli delicatamente sulle cellule. Includere variabili farmacologiche o biologiche come LY 2 9 0 0 4 a 20 micromolari.

Non deve essere rilevata alcuna espressione di GFP nelle colture con infezione latente trattate con A CV. Riportare le celle a 37 gradi Celsius in un periodo di cinque o sei giorni. Monitora le colture vive utilizzando un microscopio a fluorescenza per rilevare i neuroni in fase di riattivazione.

La frequenza di riattivazione viene calcolata contando il numero di pozzetti contenenti neuroni positivi all'EGFP ed esprimendolo in proporzione al numero totale di pozzetti campione. Questa figura illustra un esempio in cui la statina trigger, un noto induttore di riattivazione, viene applicata alle colture SCG infette in ritardo. La riattivazione è stata monitorata e valutata utilizzando la microscopia a fluorescenza ogni giorno dopo il trattamento farmacologico per un periodo di cinque giorni.

Con la TSA la riattivazione raggiunge il 50% del massimo entro due giorni per cinque giorni, la riattivazione raggiunge il 60%riattivazione basale o spontanea rappresentata dal DMSO. Le colture di controllo trattate sono circa il 10% in questo esperimento e in genere variano dal 5 al 20% utilizzando questo sistema in vitro. Tardivamente, le colture di SCG sono state trattate anche con LY 2 9 0 0 4.

Un noto induttore di riattivazione le colture con riattivazione indotta da LY sono state confrontate con quelle trattate con l'inibitore della sintesi del DNA virale, fosfo, senza acido acetico, e i due composti insieme come illustrato qui, l'espressione di US 11 EGFP è compromessa da PAA in colture indotte a riattivarsi con LY 2 9 4 0 0 2 indicando che l'espressione di US 11 EGFP dipende dalla replicazione del DNA virale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante prestare molta attenzione alla tecnica sterile e maneggiare la coltura CG il più delicatamente possibile per evitare un aumento della riattivazione spontanea indotta da stress o movimenti meccanici. Seguendo questa procedura per stabilire le infezioni latenti dell'HSV uno e i neuroni in coltura, possono essere eseguiti altri metodi come S-H-R-N-A, knockdown ed espressione ectopica di wild type e perdita genica mutante al fine di caratterizzare le funzioni neuronali che regolano la latenza e la riattivazione dell'HSV uno.

Non dimenticare che l'HSV uno è un agente patogeno umano che richiede due precauzioni di sicurezza PSL. Dovresti avere familiarità con il lavoro sulle loro due condizioni PSL prima di eseguire questa procedura. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire colture SCG per impostare le infezioni latenti da HSV 1 e per indurre efficacemente la riattivazione nei neuroni.