Name: Coltura e Applicazioni di bioreattore rotante Vessel parete Derivato di modelli 3D di cellule epiteliali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Scopri come coltivare cellule epiteliali umane in bioreattore rotante per generare modelli 3D organotipici che replicano il tessuto in vivo. Questo metodo consente studi avanzati di biologia cellulare e interazioni patogeno-ospite.

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Gli autori desiderano ringraziare Brooke Hjelm per la sua competenza tecnica e Andrew Larsen per la sua analisi delle proteine. Questo lavoro è stato finanziato in parte dal Development Alternatives Research Foundation (MMHK) Grant e il NIH NIAID infezioni sessualmente trasmesse e microbicidi topici Cooperative Research Center IU19 AI062150-01 (MMHK). Riconosciamo con gratitudine Biology of Reproduction per il riutilizzo dei dati.

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<li>Carterson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates%3A+alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).</li>
<li>Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O'Brien, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+three-dimensional+organoid+model+for+evaluation+of+the+interaction+of+uropathogenic+Escherichia+coli+with+terminally+differentiated+human+urothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells.</a> Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).</li>
<li>Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Huh7+cell+culture+system+for+the+study+of+Hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection.</a> Virol J. 6, 103(2009).</li>
<li>Duray, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+tissue+ex+vivo+by+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi.</a> J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).</li>
<li>Margolis, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+trafficking+and+HIV+infection+of+human+lymphoid+tissue+in+a+rotating+wall+vessel+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).</li>
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<li>Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immunity+at+mucosal+surfaces+of+the+female+reproductive+tract%3A+stratification+and+integration+of+immune+protection+against+the+transmission+of+sexually+transmitted+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections.</a> J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).</li>
<li>Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+identification+of+proteins%2C+mucins%2C+and+their+O-glycosylation+in+the+endocervical+mucus+during+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle.</a> Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).</li>
<li>Barrila, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+models%3A+Innovative+platforms+for+studying+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).</li>
<li>Vamvakidou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+breast+tumoroids%3A+An+in+vitro+assay+for+investigating+cellular+heterogeneity+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery.</a> J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).</li>
<li>Jin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+three-dimensional+tissue-engineered+bone+constructs+under+microgravity-simulated+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions.</a> Artif Organs. 34, 118-125 (2010).</li>
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<li>Hwang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+murine+embryonic+stem+cells%2C+alginate+encapsulation%2C+and+rotary+microgravity+bioreactor+in+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 30, 499-507 (2009).</li>
<li>Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+functional+cartilage+tissue+using+stem+cells+from+synovial+lining%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study.</a> Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;utilizzo della tecnologia bioreattore RWV qui presentato può fornire ai ricercatori la possibilità di avanzare la loro attuale sistema di coltura cellulare per un modello più fisiologicamente rilevanti organotipica coltura cellulare. Il sistema di bioreattore RWV coltura cellulare fornisce un microambiente shear a bassa che permette alle cellule di formare aggregati cellulari 3-D in vivo, con caratteristiche simili, comprese le giunzioni strette, la produzione di mucina, processi extracellulari (es. micro...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A21131 </td><td> Usato diluizione 1:500 </td></tr><tr><td> FACSDiva </td><td> BD </td><td></td><td> Citometro a flusso </td></tr><tr><td> β-tublin anticorpo </td><td> Calbiochem </td><td> 654162 </td><td> Usato diluizione 1:5000 </td></tr><tr><td> Bio-Plex 2000 </td><td> BioRad </td><td> 171-000205 </td><td> v5 software </td></tr><tr><td> Bioreattori e componenti </td><td> Synthecon </td><td> RCCS-4 </td><td></td></tr><tr><td> Cella filtro </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td> 40 ≠ m dimensione dei pori </td></tr><tr><td> Tubo conico (50 ml) </td><td> Corning </td><td> 5-538-60 </td><td></td></tr><tr><td> Coprivetrini </td><td> VWR </td><td> 48366067 </td><td></td></tr><tr><td> Citochine kit matrice tallone </td><td> BioRad </td><td> Kit che umano </td><td></td></tr><tr><td> Cytodex perline </td><td> Sigma </td><td> C3275 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> ED-500G </td><td> Etilendiammintetraacetato </td></tr><tr><td> Epiteliale anticorpo specifico (ESA) </td><td> Chemicon </td><td> CBL251 </td><td> Usato diluizione 1:50 </td></tr><tr><td> Siero bovino fetale (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 10438 </td><td> Inattivato al calore </td></tr><tr><td> Harv (monouso) </td><td> Synthecon </td><td> D-405 </td><td></td></tr><tr><td> Acido cloridrico </td><td> Sigma </td><td> 258148 </td><td> 37% </td></tr><tr><td> Involucrina anticorpi </td&gt; <td> Sigma </td><td> I 9018 </td><td></td></tr><tr><td> Vetrini </td><td> VWR </td><td> 16004-368 </td><td></td></tr><tr><td> MTT reagente </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 194592 </td><td> 3 - (4,5-Dimethylthiazolyl 1-2) -2,5-difenil Bromuro Tetrazolium </td></tr><tr><td> MUC1 anticorpo (microscopia) </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-7313 </td><td> Usato diluizione 1:50 </td></tr><tr><td> MUC1 anticorpo (citometria a flusso) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559774 </td><td> Anche chiamato CD227, 20μL utilizzare per test </td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 15710 </td><td> Diluito al 4% in DPBS </td></tr><tr><td> Petri (piccolo) </td><td> BD Falcon </td><td> 353002 </td><td></td></tr><tr><td> Provetta di polistirene con filtro </td><td> BD Falcon </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Polistirolo tubo di flusso </td><td> BD Falcon </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> PR anticorpi </td><td> DAKO </td><td> M3569 </td><td> Usato diluizione 1:100 </td></tr><tr><td> Prolungare oro </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> Supporti di montaggio con DAPI </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74903 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio dodecil solfato </td><td> Sigma </td><td> 71725 </td><td></td></tr><tr><td> Sterilizzazione pouch </td><td> VWR </td><td> 11213-035 </td><td></td></tr><tr><td> Rubinetti (solo andata) </td><td> Medex </td><td> MX5061L </td><td></td></tr><tr><td> Siringa (10 ml) </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td> Luer-lock punta </td></tr><tr><td> Siringa (5 ml) </td><td> BD </td><td> 309603 </td><td> Luer-lock punta </td></tr><tr><td> Trypan blu </td><td> Invitrogen </td><td>T10282 </td><td></td></tr><tr><td> VP5 anticorpi </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-13525 </td><td> HSV-2 anticorpo Clone 6F10; utilizzato in diluizione 1:5000 </td></tr></tbody></table>

coltura e applicazioni di bioreattore rotante vessel parete derivato di modelli 3d di cellule epiteliali

Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models

Cellule e tessuti in condizioni di sperimentare il corpo ambientali che influenzano la loro architettura, le comunicazioni intercellulari e le funzioni generali. Per i modelli cellulari in coltura in vitro per simulare con precisione il tessuto di interesse, l&#39;ambiente di crescita della cultura è un aspetto critico da considerare. Comunemente utilizzati convenzionali sistemi di coltura cellulare propagano cellule epiteliali su superfici piane bidimensionali (2-D) impermeabili. Sebbene molto sia stato appreso dai sistemi convenzionali di coltura cellulare, molti risultati non sono riproducibili in studi clinici umani o espianti di tessuto, potenzialmente a causa della mancanza di un microambiente fisiologicamente rilevante. Qui, si descrive un sistema di coltura che supera molti dei confini delle condizioni di coltura di 2-D colture cellulari, utilizzando l&#39;innovativo rotante parete del vaso (RWV) tecnologia bioreattore. Noi e altri hanno mostrato che organotipiche RWV derivati ​​i modelli possono ricapitolare Structure, la funzione e autentiche risposte umane a stimoli esterni in modo simile ai tessuti umani espianti 1-6. Il bioreattore RWV è un sistema di coltura in sospensione che consente la crescita di cellule epiteliali in condizioni fisiologiche bassa fluido di taglio. I bioreattori sono disponibili in due diversi formati, ad alta aspetto recipiente rotante (Harv) o una lenta rotazione vaso laterale (STLV), in cui si distinguono per la loro fonte aerazione. Le cellule epiteliali vengono aggiunti al bioreattore di scelta in combinazione con porosi, collagene perle rivestite microveicolo (Figura 1A). Le cellule utilizzano le perline come una crescita ponteggio durante la caduta libera costante nel bioreattore (figura 1B). Il microambiente fornito dal bioreattore permette alle cellule di formare aggregati tridimensionali (3-D) mostrano in vivo caratteristiche simili spesso non osservata sotto standard 2-D condizioni di coltura (Figura 1D). Queste caratteristiche includono giunzioni strette, MUCCi produzione, apicale / basale orientamento, nella localizzazione delle proteine ​​vivo, e ulteriori cellule epiteliali di tipo proprietà specifiche. La progressione da un monostrato di cellule epiteliali completamente differenziate 3-D aggregato varia in base al tipo di cellula 1, 7-13. Campionamento periodico dal bioreattore consente il monitoraggio del epiteliale formazione di aggregati, marcatori di differenziazione cellulare e vitalità (Figura 1D). Una volta che la differenziazione cellulare e formazione di aggregati è stabilito, le cellule sono raccolte dal bioreattore, e simili saggi eseguiti su cellule 2-D possono essere applicati agli aggregati 3-D con alcune considerazioni (Figura 1E-G). In questo lavoro, si descrive la procedura dettagliata di come la cultura in 3-D aggregati di cellule epiteliali del sistema di bioreattore RWV e una varietà di potenziali saggi e analisi che possono essere eseguiti con le 3-D aggregati. Queste analisi includono, ma non sono limitati a, strutturale / mAnalisi orphological (confocale, scansione e microscopia elettronica a trasmissione), di citochine / chemochine e la secrezione di segnalazione cellulare (mediante citometria a matrice tallone e Western blot), le analisi di espressione genica (real-time PCR), tossicologiche / droga analisi e interazioni ospite-patogeno. L&#39;utilizzo di questi test creato le basi per studi più approfonditi ed espansivo come metabolomica, trascrittomica, proteomica e di altre applicazioni basate su array. Il nostro obiettivo è quello di presentare una non convenzionali mezzi di coltura di cellule epiteliali umane per produrre organotipiche modelli 3-D che ricapitolano l&#39;essere umano nel tessuto vivo, in un sistema facile e robusto per essere utilizzato da ricercatori con diversi interessi scientifici.

Un rotante sistema di coltura cellulare che consente alle cellule epiteliali di crescere in condizioni fisiologiche con conseguente 3-D formazione di aggregati cellulare viene descritto. Gli aggregati di visualizzazione generato<em&gt; In vivo</em&gt; Caratteristiche simili non osservata in modelli di colture convenzionali e servire come un sistema più accurato modello di organotipica per una moltitudine di ricerche scientifiche.

Coltura e Applicazioni di bioreattore rotante Vessel parete Derivato di modelli 3D di cellule epiteliali

Le cellule e i tessuti dell'organismo sono esposti a condizioni ambientali che influenzano la loro architettura, le comunicazioni intercellulari e le funzioni complessive. ...

Questo protocollo non convenzionale presenta un sistema semplice e robusto per coltivare cellule epiteliali umane in modelli tridimensionali organotipici che riproducono il tessuto umano in vivo. In primo luogo, le cellule epiteliali vengono coltivate fino a formare uno strato monolayer confluenziale in un fiasco da coltura cellulare, raccolte e quindi combinate con microsferette in un biorreattore STLV; il biorreattore STLV viene fatto ruotare sulla piattaforma per creare un ambiente di caduta libera costante con basso taglio idraulico, consentendo alle cellule di aderire e crescere sulle microsferette e formare aggregati cellulari dopo 96 ore e circa ogni giorno successivo.Ricambiare il mezzo nel SDLV per compensare il metabolismo cellulare dopo la formazione degli aggregati; esaminare i campioni mediante microscopia ottica settimanalmente per monitorare il progresso dello sviluppo, una volta completata la formazione degli aggregati e la differenziazione cellulare. Seminare gli aggregati per analisi sperimentali successive e saggi. In definitiva, questo sistema può generare modelli organotipici simili a quelli in vivo per una molteplicità di indagini scientifiche.Il vantaggio pri

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In passato in molti sistemi di coltura in vitro - principalmente colture monostrato - spesso sofferto lo svantaggio che le cellule differenziate primarie ha avuto un relativamente breve durata e de-differenziato durante cultura. Come conseguenza, la maggior parte del loro organo-specifiche funzioni sono state perse rapidamente. Pertanto, al fine di riprodurre condizioni migliori per queste cellule in vitro, le modifiche e gli adattamenti sono stati fatti per colture monostrato convenzionale.

Intervista: Bioreattori e nobilitati-Modified 3D-Ponteggi per la ricerca sulle cellule staminali

Tradizionale, bidimensionale tecniche di coltura cellulare spesso sfociano in caratteristiche alterate rispetto ai marcatori di differenziazione, citochine e fattori di crescita. Tridimensionale di coltura cellulare nel sistema delle cellule di rotazione cultura (CCR) ristabilisce l'espressione di molti di questi fattori, come illustrato qui con una linea di cellule extravilloso trofoblasto.

Rotazione Cultura sistemi cellulari per colture cellulari umane: cellule del trofoblasto umano come modello

Il comportamento funzionale delle cellule in coltura può essere migliorata coltivando in più in vivo -come ambienti di coltura 3 dimensioni 16-21. Questo manoscritto descrive il set-up e il funzionamento di un sistema a fibra cava bioreattore per vivo -come mammiferi coltura di tessuti in.

Bioreattori fibra cava per<em&gt; In Vivo</em&gt; -come Mammiferi Tissue Culture

Cellule che crescono in un ambiente tridimensionale (3-D) rappresentano un netto miglioramento rispetto coltura cellulare in ambienti 2-D (ad esempio, flaconi o piatti). Qui si descrive lo sviluppo di un modello 3-D organotipica multicellulare della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità fornito ruotando parete dei vasi (RWV) bioreattori.

Sviluppo di un multicellulare tridimensionale Organotipica Modello della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità

Questo manoscritto descrive una tecnica di litografia morbida a base di ingegnerizzare matrici uniformi di tridimensionale (3D) tessuti epiteliali di geometria definita circondati da matrice extracellulare. Questo metodo è suscettibile di una grande varietà di tipi di cellule e contesti sperimentali e consente di high-throughput screening di replicati identici.

Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all&#39;interno di matrice extracellulare

Il protocollo descrive come progettare una rete vascolare perfusable in uno sferoide. Microambiente circostante di sferoide è inventato per indurre l'angiogenesi e collegare la sferoide a microcanali in un dispositivo microfluidico. Il metodo consente la perfusione della sferoide, che è una tecnica tanto atteso nelle culture tridimensionale.

Perfusable rete vascolare con un modello di tessuto in un dispositivo microfluidico

L'obiettivo di questo protocollo è quello di biostampare direttamente le cellule epiteliali del seno come sferoidi multicellulari su reti endoteliali pre-formate per creare rapidamente modelli di co-coltura endoteliale del seno 3D che possono essere utilizzati per studi di screening farmacologico.

Biostampa diretta di Sferoidi mammari multicellulari 3D su reti endoteliali

Questo protocollo presenta un metodo per la coltura e la crescita 3D di cellule simili agli ameloblasti in microgravità per mantenere la loro forma allungata e polarizzata e l'espressione proteica specifica dello smalto. Sono inoltre descritte le condizioni di coltura per la coltura dei costrutti di ingegneria parodontale e degli organi polmonari in microgravità.

Propagazione di cellule e organi dentali e respiratori in microgravità

In questo articolo, un inserto stampato in 3D di nuova concezione viene presentato come modello di co-coltura e convalidato attraverso lo studio della comunicazione intercellulare paracrina tra cellule endoteliali e cheratinociti.

Un innovativo inserto stampato in 3D progettato per consentire colture cellulari 2D e 3D semplici

Qui, dimostriamo come le cellule epiteliali coltivate con fibroblasti nel sistema a due strati basato su membrana nanofibrosa possano aderire e crescere stabilmente sulla membrana.

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Scopri come coltivare cellule epiteliali umane in bioreattore rotante per generare modelli 3D organotipici che replicano il tessuto in vivo. Questo metodo consente studi avanzati di biologia cellulare e interazioni patogeno-ospite.

Coltura e Applicazioni di bioreattore rotante Vessel parete Derivato di modelli 3D di cellule epiteliali

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