Coltura e Applicazioni di bioreattore rotante Vessel parete Derivato di modelli 3D di cellule epiteliali

Questo protocollo non convenzionale presenta un sistema semplice e robusto per coltivare cellule epiteliali umane in modelli tridimensionali organotipici che riproducono il tessuto umano in vivo. Innanzitutto, le cellule epiteliali vengono coltivate fino a formare uno strato monolayer confluenziale in un fiasco da coltura cellulare, raccolte e quindi combinate con microperle in un bioreattore STLV; si fa ruotare lo STLV sulla piattaforma per creare un ambiente di caduta libera costante con basso taglio idraulico, consentendo alle cellule di aderire e crescere sulle perle e formare aggregati cellulari dopo 96 ore e circa ogni giorno successivo.

Ricambiare il mezzo nel SDLV per compensare il metabolismo cellulare dopo la formazione degli aggregati; esaminare campioni mediante microscopia ottica settimanalmente per monitorare il progresso dello sviluppo, una volta completata la formazione degli aggregati e la differenziazione cellulare. Seminare gli aggregati per analisi sperimentali successive e saggi. In definitiva, questo sistema può generare modelli organotipici simili a quelli in vivo per una molteplicità di indagini scientifiche.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la coltura cellulare convenzionale, è che le cellule epiteliali si differenzieranno e polarizzeranno formando aggregati simili a tessuti, comportandosi quindi morfologicamente e funzionalmente in modo analogo al tessuto umano reale. Questo sistema modello in 3D fornisce ulteriori approfondimenti sulla biologia delle cellule epiteliali, sulle interazioni tra ospite e patogeno e sull'interazione complessa tra i diversi tipi cellulari che possono essere introdotti nel sistema. Dr. Andrea Radkey.

Un ricercatore postdottorato del mio laboratorio illustrerà ora questa procedura per disintossicare il bioreattore laterale a lenta rotazione. Coprire le porte aperte con tappi a vite. Riempire il bioreattore STLV con etanolo al 95% ed equilibrare per 24 ore.

Rimuovere l'etanolo, quindi riempire con acqua distillata sterilizzata e incubare per 24 ore utilizzando gli strumenti forniti dal produttore, allentare tutte le viti e rimuovere il tappo centrale dallo STLV. Posizionarli in un sacchetto per sterilizzazione e autoclavare a 110 gradi Celsius per 20 minuti. Riassemblare lo STLV e ripetere la detossificazione per garantire la sterilità.

Successivamente, stringere le viti del STLV. Collegare un rubinetto monodirezionale pre-sterilizzato a ciascuna porta. Ora rimuovere gli stantuffi da una siringa lock a tenuta da 10 millilitri e da una da 5 millilitri e riporre gli stantuffi nelle rispettive confezioni.

Per mantenere la sterilità, avvitare le siringhe al rubinetto a tre vie. Procedere aggiungendo DPBS alla siringa da 10 millilitri finché l'STLV è pieno e la siringa da cinque millilitri inizia a riempirsi. Quindi reinserire gli stantuffi sterili in ciascuna siringa ed eliminare eventuali bolle residue nel bioricettacolo alternando la spinta degli stantuffi delle siringhe.

Chiudere i rubinetti e collegare lo STLV alla piattaforma verticale rotante. Ruotare per un minimo di 24 ore per monitorare eventuali perdite in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere 15 millilitri di DPBS a 250 milligrammi di microperline di CytoDex e sottoporre ad autoclave dopo il raffreddamento.

Rimuovere il DPBS eseguendo tre lavaggi con il mezzo di coltura per le cellule epiteliali. Ruotare il tubo per risospendere le microsfere. Successivamente, risospendere le microsfere in 15 millilitri di mezzo di coltura.

Coltivare inizialmente una volta 10 alla settima cellule epiteliali come monocapato in fiasche per coltura tissutale. Raccogliere le cellule e contare il numero di cellule determinando al contempo la vitalità cellulare mediante esclusione del blu di trian. Dopo la colorazione, aggiungere le cellule alle microsfere preparate.

Risciacquare il tubo conico per assicurarsi che tutte le cellule siano trasferite. Successivamente, rimuovere il DPBS e le siringhe dallo STLV. Inoltre, rimuovere il tappo dal porto centrale utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri.

Caricare la sospensione di cellule epiteliali con perline nel STLV. Risciacquare una volta il tubo conico per trasferire tutte le cellule e le perline. Quindi sostituire il tappo del porto centrale.

Successivamente, rimuovere gli stantuffi da una siringa da cinque millilitri e da una da 10 millilitri e reinserire gli stantuffi nelle rispettive confezioni. Per mantenere la sterilità, avvitare i raccordi in pollice delle siringhe con rubinetti aperti. Riempire lo STLV con il mezzo di coltura.

Sostituire i pistoni e chiudere il rubinetto a tre vie. Ora equilibrare la coltura di STLV appena seminata in un incubatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti senza rotazione. Dopo aver rimosso lo STLV dall'incubatore, aprire il rubinetto a tre vie.

Rimuovere eventuali bolle d'aria utilizzando gli stantuffi e chiudere il rubinetto. Impostare quindi la STLV in rotazione continua a 20 giri/min nell'incubatore. Dopo 96-120 ore, sostituire il mezzo rimosso le siringhe e aprendo entrambi i rubinetti inclinando la STLV per permettere alle perle e alle cellule di sedimentare.

Dopo che si sono assestati, versare circa il 75% del mezzo dal porto laterale utilizzando le siringhe per eseguire il protocollo di alimentazione. Inoltre, continuare a rifornire il mezzo secondo necessità in base al metabolismo cellulare. Monitorare inoltre la crescita e la vitalità degli aggregati ogni cinque o sette giorni.

Per evitare la rottura degli aggregati, utilizzare una punta per pipetta da 1000 microlitri che sia stata tagliata a circa due centimetri dalla punta e sterilizzata. Rimuovere con attenzione 200 microlitri di aggregati dal pozzetto centrale e suddividerli in due provette da 1,5 millilitri. Utilizzare un’aliquota per monitorare la vitalità cellulare. Dopo il distacco delle cellule dalle microsferette, valutare la vitalità mediante esclusione del blu di trian.

Colorazione per l'immagine di aggregati cellulari. Aggiungere da 0,5 a un millilitro di mezzo al secondo aliquota di aggregati di 1,5 millilitri e trasferire in una piccola piastra di Petri utilizzando una punta di pipetta da 1000 microlitri tagliata. Immagine degli aggregati con pipetta.

Utilizzando un microscopio ottico invertito per alcuni modelli di cellule epiteliali, è necessario trasferire gli aggregati in un contenitore monouso dimezzato per aumentare l'aerazione della coltura circa una settimana prima del raccolto degli aggregati. Per l'analisi, rimuovere le siringhe dallo STLV e versare circa il 50% del mezzo dal porto laterale. Rimuovere il tappo centrale e versare con attenzione tutti i contenuti in un tubo conico da 50 millilitri dal porto centrale.

Risciacquare due volte lo STLV con cinque millilitri di mezzo e combinare i risciacqui con gli aggregati raccolti. Successivamente, trasferire gli aggregati dal tubo conico da 50 millilitri allo Harv. Dopo una settimana, raccogliere con attenzione gli aggregati per potenziali formati di saggio; i saggi e l'analisi hanno mostrato che aggregati epiteliali umani differenziati sono stati coltivati nel sistema di bioreattore STLV.

Le immagini di SEM e TEM sono state ottenute da cellule vaginali umane coltivate nello STLV per 39 giorni. Si noti che gli aggregati tridimensionali mostrano caratteristiche ultrastrutturali simili a quelle dei tessuti, come microsolchi, invaginazioni, vescicole secretorie intracellulari e microvilli sulla superficie apicale. Le immagini di microscopia confocale a immunofluorescenza di cellule vaginali tridimensionali indicano l'espressione di mucina e di marcatori specifici per cellule epiteliali e per la differenziazione terminale. Fenotipi fisiologicamente rilevanti costituiscono inoltre un'eccellente piattaforma per la valutazione della tossicità di composti.

Il saggio MTT, un metodo comunemente utilizzato per misurare la vitalità cellulare, il metabolismo o la proliferazione, può essere impiegato per valutare la tossicità di diverse sostanze chimiche e composti. In alternativa, è possibile misurare la tossicità dopo il trattamento con composti in esame mediante esclusione del blu di tripano. In questo esempio, dopo il trattamento con il NONOXINOL nove, gli aggregati vaginali hanno mostrato una risposta tossica simile a quella dei modelli di espianto cervicale X, ma un profilo diverso rispetto ai monocapani.

Gli aggregati 3D sono funzionalmente reattivi, ad esempio, dopo stimolazione con molecole derivate da microrganismi che vengono riconosciute dai recettori di tipo toll. Gli aggregati rispondono secernendo citochine pro-infiammatorie, inclusa l'espressione proteica di IL-6 e trascritti del recettore per la progesterone. Un recettore che risponde alla stimolazione ormonale può essere osservato anche nelle cellule vaginali.

Gli aggregati tridimensionali non solo sono in grado di rispondere a molecole di patogeni e ormoni, ma possono anche sostenere funzionalmente un'infezione da virus dell'herpes simplex di tipo due. Un'immagine di microscopia confocale di aggregati vaginali tridimensionali infettati da HSV-2 dimostra l'infezione. Le proprietà fisiche e funzionali delle singole cellule all'interno degli aggregati possono inoltre essere quantificate mediante citometria a flusso, ad esempio tramite un saggio di citometria a flusso per misurare l'espressione superficiale di MUC1 sulle singole cellule vaginali.

Gli aggregati vaginali tridimensionali esprimevano una percentuale inferiore di muck uno sulla loro superficie rispetto ai monocap strati dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori nei campi della biologia dei tessuti e delle malattie infettive di studiare la struttura e le risposte fisiologiche agli stimoli. Utilizzando questi modelli organotipici, meglio riproduciamo la biologia umana.