Coltura e Applicazioni di bioreattore rotante Vessel parete Derivato di modelli 3D di cellule epiteliali

Questo protocollo non convenzionale presenta un sistema di coltura facile e robusto. Cellule epiteliali umane in modelli 3D organotipici che ricapitolano il tessuto umano in vivo. In primo luogo, le cellule epiteliali vengono coltivate in un monostrato confluente in una fiaschetta di coltura tissutale raccolta, quindi combinate con microsfere portanti nel bioreattore STLV, ruotano l'STLV sulla piattaforma per creare un ambiente di caduta libera costante a basso taglio del fluido, consentendo alle cellule di attaccarsi e crescere sulle perle e formare aggregati cellulari dopo 96 ore e circa ogni giorno successivo.

Ricostituire il terreno nel SDLV per adattarsi al metabolismo cellulare dopo la formazione di campioni di immagini aggregate mediante microscopia ottica settimanalmente per monitorare la progressione dello sviluppo una volta che si è verificata la completa formazione dell'aggregato e la differenziazione cellulare. Semina gli aggregati per analisi sperimentali e saggi a valle. In definitiva, questo sistema può generare in vivo sistemi modello organotipici per una moltitudine di indagini scientifiche.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la coltura cellulare convenzionale, è che le cellule epiteliali si differenziano e si polarizzano in aggregati simili a tessuti, comportandosi quindi morfologicamente e funzionalmente in modo simile al tessuto umano autentico. Questo sistema di modelli 3D fornisce ulteriori informazioni sulla biologia delle cellule epiteliali, sulle interazioni tra i patogeni dell'ospite e sulla complessa interazione tra i tipi di cellule che possono essere introdotte nel sistema. Dott.ssa Andrea Radkey.

Un postdoc nel mio laboratorio, dimostrerà ora questa procedura per disintossicare il bioreattore a vaso laterale a rotazione lenta. Copri le porte aperte con i cappucci delle esche. Riempire l'STLV con etanolo al 95% ed equilibrare per 24 ore.

Rimuovere l'etanolo, quindi riempirlo con acqua distillata sterilizzata e incubare per 24 ore utilizzando gli strumenti forniti dal fornitore, allentare tutte le viti e rimuovere il tappo centrale dall'STLV. Metterli in una busta di sterilizzazione e sterilizzarli in autoclave a 110 gradi Celsius per 20 minuti. Rimontare l'STLV e ripetere la disintossicazione per garantire la sterilità.

Quindi, serrare le viti dell'STLV. Collegare il rubinetto unidirezionale pre-sterilizzato a ciascuna porta. Ora rimuovi gli stantuffi da una siringa di blocco dell'esca da 10 millilitri e cinque millilitri e solleva gli stantuffi negli involucri.

Per mantenere la sterilità, avvitare le siringhe sul rubinetto di arresto. Procedere con l'aggiunta di DPBS alla siringa da 10 millilitri fino a quando l'STLV è pieno e la siringa da cinque millilitri inizia a riempirsi. Quindi riposizionare gli stantuffi sterili in ciascuna siringa e rimuovere eventuali bolle residue nel bioreattore alternando gli stantuffi di guida delle siringhe.

Chiudere i rubinetti di arresto e fissare l'STLV alla piattaforma verticale rotante. Ruotare per un minimo di 24 ore per monitorare la presenza di perdite in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere 15 millilitri di DPBS a 250 milligrammi di perline cyto dex microcar e sterilizzare in autoclave dopo il raffreddamento.

Rimuovere il lavaggio DPBS tre volte con terreni di coltura per le cellule epiteliali. Roteare il tubo per risospendere le perline. Quindi risospendere le perle in 15 millilitri di terreno di coltura.

Prima coltura una volta 10 alla settima, cellule epiteliali come monostrati in coltura tissutale. I flaconi raccolgono le cellule e enumerano e determinano la vitalità cellulare mediante esclusione trian blue. Colorando, aggiungere le cellule alle perle preparate.

Sciacquare il tubo conico per assicurarsi che tutte le cellule siano trasferite. Quindi, rimuovere il DPBS e le siringhe dall'STLV. Inoltre, rimuovere il tappo dalla porta centrale utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri.

Caricare la sospensione della perlina di cellule epiteliali nell'STLV. Sciacquare una volta il tubo conico per trasferire tutte le cellule e le perline. Quindi sostituire la spina della porta centrale.

Quindi, rimuovere gli stantuffi da una siringa da cinque millilitri e una da 10 millilitri e riposizionare gli stantuffi negli involucri. Per mantenere la sterilità, avvitare le porte in pollici della siringa con i rubinetti aperti. Riempire l'STLV con i media.

Riposizionare gli stantuffi e chiudere l'arresto. Timoniere. Ora equilibra la coltura STLV appena seminata in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti senza rotazione. Dopo aver rimosso l'STLV dall'incubatrice, aprire il rubinetto di arresto.

Rimuovere eventuali bolle utilizzando gli stantuffi e chiudere il rubinetto di arresto. Quindi impostare l'STLV sulla rotazione continua a 20 giri/min nell'incubatrice. Dopo 96-120 ore, cambiare il terreno rimuovendo le siringhe e aprendo entrambi i rubinetti ha lavorato l'STLV per consentire alle perline e alle cellule di depositarsi.

Una volta sistemato, versare circa il 75% del terreno dalla porta laterale utilizzando le siringhe per eseguire il protocollo di alimentazione. Anche in questo caso, continuare a reintegrare i terreni secondo necessità in base al metabolismo cellulare. Monitorare anche la crescita e la redditività degli aggregati ogni cinque-sette giorni.

Per evitare il taglio degli aggregati, utilizzare un puntale per pipetta da 1000 microlitri tagliato a circa due centimetri dalla punta e sterilizzato Rimuovere con cautela 200 microlitri di aggregati dalla porta centrale e aliquotare in due provette da 1,5 millilitri. Utilizzare un'aliquota per monitorare la vitalità cellulare. Dopo aver dimensionato le celle delle perline, valutare la vitalità mediante esclusione trian blue.

Colorazione per l'imaging di aggregati cellulari. Aggiungere da 0,5 a un millilitro di terreno al secondo aliquo aggregato da 1,5 millilitri e trasferire in una piccola piastra di Petri utilizzando un taglio. Aggregati di immagini di puntali per pipette da 1000 microlitri.

Utilizzando un microscopio ottico invertito per alcuni modelli di cellule epiteliali, è necessario trasferire gli aggregati in una metà monouso per aumentare l'aerazione della coltura circa una settimana prima del prelievo degli aggregati. Per l'analisi, rimuovere le siringhe dall'STLV e versare circa il 50% del terreno dalla porta laterale. Rimuovere il tappo centrale e versare con cura tutto il contenuto in un tubo conico da 50 millilitri dalla porta centrale.

Sciacquare l'STLV due volte con un mezzo da cinque millilitri e combinare i risciacqui con gli aggregati raccolti. Successivamente, trasferire gli aggregati dal tubo conico da 50 millilitri all'Harv. Dopo una settimana, gli aggregati raccolti con cura per i potenziali formati di analisi, i saggi e l'analisi hanno differenziato gli aggregati epiteliali umani sono stati coltivati nel sistema di bioreattore STLV.

Le immagini SEM e TEM vengono raccolte da cellule vaginali umane coltivate nell'STLV per 39 giorni. Si noti che gli aggregati 3D mostrano caratteristiche ultra strutturali simili ai tessuti, le micro creste, le invaginazioni, le vescicole secretorie intracellulari e i microvilli sulla superficie apicale Le immagini di microscopia confocale a immunofluorescenza delle cellule vaginali 3D indicano l'espressione della mucina e marcatori specifici per le cellule epiteliali e la differenziazione terminale. I fenotipi fisiologicamente rilevanti fungono anche da eccellente piattaforma per valutare la tossicità dei composti.

Il test MTT, un test comunemente usato per misurare la vitalità cellulare, il metabolismo o la proliferazione, può essere utilizzato per misurare la tossicità di varie sostanze chimiche e composti. In alternativa, misurare la tossicità dopo il trattamento con i composti in esame mediante trian blue exclusion. In questo esempio, dopo il trattamento con NONOXINOL nine, gli aggregati vaginali hanno dimostrato una risposta di tossicità simile a quella dei modelli X explan cervicali, ma un profilo diverso rispetto ai monostrati.

Gli aggregati 3D rispondono funzionalmente, ad esempio, alla stimolazione con molecole derivate da microbi che vengono riconosciute dai recettori toll-like. Gli aggregati rispondono e secernono citochine pro-infiammatorie, tra cui la proteina IL 6 e l'espressione del trascritto del recettore del progesterone. Nelle cellule vaginali si può osservare anche un recettore che risponde alla stimolazione ormonale.

Gli aggregati 3D non solo hanno la capacità di rispondere a molecole patogene e ormonali, ma sono anche in grado di supportare funzionalmente un'infezione da virus dell'herpes simplex di tipo due. Un'immagine al microscopio confocale di HSV, due aggregati vaginali 3D infetti, dimostra l'infezione. Le proprietà fisiche e funzionali delle singole cellule all'interno degli aggregati possono anche essere quantificate mediante citometria a flusso, ad esempio del test di citometria a flusso per misurare l'espressione della superficie di muck one sulle singole cellule vaginali.

Gli aggregati vaginali 3D hanno espresso una percentuale inferiore di letame sulla loro superficie rispetto ai monostrati Dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della biologia dei tessuti e delle malattie infettive di studiare la struttura e le risposte fisiologiche agli stimoli. Utilizzando questi modelli organotipici, meglio capitoliamo la biologia umana.