Name: In vitro test Clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Scopri come modellare la clearance mesoteliale in vitro per studiare i primi passi della metastasi del cancro ovarico utilizzando microscopia a fluorescenza time-lapse. Questo metodo permette di quantificare l'invasione cellulare in tempo reale.

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Vorremmo ringraziare la Nikon Imaging Center presso la Harvard Medical School, in particolare Jennifer Waters, Lara Petrak e salmone Wendy, per la formazione e l&#39;uso delle loro microscopi timelapse. Vorremmo anche ringraziare Rosa Ng e Achim Besser per le discussioni importanti. Questo lavoro è stato supportato dal NIH di Grant 5695837 (da M. Iwanicki) e GM064346 di ACC, da una sovvenzione dal Dott. Miriam e Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (a JSB).

1. Ovarian Cancer Cell Formazione Spheroid <ol><li> RFP-esprimono cellule di cancro ovarico vengono coltivate in terreno di base 10% (una consuetudine mezzo di coltura cellulare contenente una miscela 50:50 di 199 e MCDB105, 10% siero fetale bovino inattivato e 1% pen-strep). Per esprimere RFP in cellule non marcate cancro ovarico, trasfettare le cellule con un plasmide contenente RFP e per selezionare cellule esprimenti RFP. In alternativa, vettori virali possono essere usati per esprimere transitoriamente proteine ​​fluorescenti, o le cellule possono essere pre-incubare con fluorescente rossa cella inseguitore colorante (Invitrogen). </li><li> Prima di formare sferoidi di cancro ovarico, è necessario preparare bassa aderenza e rotonde 96 piastre di coltura fondo. Per produrre i bassa aderenza piastre di coltura, 30μl poli-HEMA (6mg polyhydroxyethylmethacrylate in 1 ml di EtOH 95%) soluzione viene aggiunta a ciascun pozzetto di un pozzo 96 piatto di coltura cellulare Corning. Le piastre a 96 pozzetti vengono incubate a 37 ° C non incubatore umidificato per far evaporare l&#39;etanolo, Leaving una pellicola di poli-HEMA in ciascun pozzetto. Questo poli-HEMA pellicola impedisce alle cellule di attaccarsi al fondo del pozzo, costringendo le cellule a crescere in sospensione 18. [In alternativa, Ultra-Low piastre di coltura Attachment (Corning) può essere usato al posto di piatti rivestiti poly-HEMA.] </li><li> Dopo bassa aderenza piastre di coltura vengono preparati, Tripsinizzare una piastra di cellule tumorali ovariche, pellet delle cellule in una centrifuga da tavolo (Heraeus) a 900 RCF per 3 minuti, aspirare il supernatante e risospendere in terreno di base 10%. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Regolare la concentrazione di tali cellule che ci sono 100 cellule per 50 microlitri di terreno di base 10%. </li><li> Aggiungere 50 microlitri della sospensione cellulare diluita uniformemente sospeso in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti poli-HEMA cultura rivestita. </li><li> Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 ° C incubatore di coltura cellulare per 16 ore (tale quantità di tempo dovrebbe essere aumentata o diminuita a seconda della quantità di tempo necessario peruna linea cellulare particolare per formare sferoidi multicellulari o desiderati condizioni sperimentali) permettere alle cellule del carcinoma ovarico a raggrupparsi, formando un unico sferoide multicellulare in ciascun pozzetto. Alcune cellule tumorali possono apoptosi durante questo periodo, quindi è importante scegliere un momento prima della induzione di apoptosi. </li></ol> 2. Mesoteliali formazione di cellule monostrato <ol><li> In una cappa coltura cellulare, pre-rivestimento dei pozzetti di una ben 6 fondo di vetro piatto MatTek con fibronectina aggiungendo 2 ml di fibronectina 5μg / mL di soluzione salina in ogni pozzetto della piastra e incubando a temperatura ambiente per 30 minuti. La qualità ottica dei fondi di vetro in piatti MatTek consentono immagini ad alta risoluzione microscopico. </li><li> GFP-esprimono cellule mesoteliali vengono coltivate in terreno di base 10%. Tripsinizzare un piatto di cellule mesoteliali, spin down in una centrifuga da tavolo (Heraeus) a 900RPM per 3 minuti, aspirare il surnatante, e risospendere in terreno di base del 10%. Ilcellule mesoteliali usati qui sono stati già esprimendo GFP quando sono stati ottenuti, ma non marcati cellule mesoteliali può essere prodotto da trasfezione con un plasmide contenente cDNA GFP, o preincubating le cellule in un verde fluorescente cella inseguitore colorante (Invitrogen). </li><li> Dopo l&#39;incubazione di 30 minuti fibronectina (in fase 2.1), lavare i pozzetti del piatto MatTek con 2 ml PBS. </li><li> Aspirare il PBS e la piastra 6 x10 5 cellule mesoteliali per bene in ciascun pozzetto della piastra ben 6 MatTek. Incubare il piatto MatTek a 37 ° C incubatore per colture cellulare notte per consentire le cellule mesoteliali per collegare al piatto e formano un monostrato. </li></ol> 3. Mesoteliali cella Assay Clearance <ol><li> Utilizzare una pipetta per raccogliere gli sferoidi carcinoma ovarico da ben 96 poli-HEMA piastra rivestita. </li><li> Aspirare il mezzo da un pozzetto della piastra ben 6 MatTek contenente un monostrato di cellule mesoteliali. Lavare una volta con 2 ml PBS. Aggiungere tutti gli sferoidi dal 96 pozzetti ptardi per un pozzetto della piastra MatTek (~ 3x il numero di sferoidi che stanno per essere ripreso in considerazione per l&#39;atterraggio sferoidi parte del piatto che non può essere ripreso). </li><li> Porre la capsula MatTek sul palco di un microscopio invertito widefield a fluorescenza in grado di eseguire time-lapse imaging per la durata di almeno 8 ore. Utilizzare uno stadio motorizzato a posizioni più immagini nel piatto, con più eventi di intercalazione sferoidali, in un singolo esperimento. Usiamo un Ti-E Nikon invertito motorizzato widefield fluorescenza time-lapse microscopio integrato con un sistema di messa a fuoco perfetta e bassa [20x-0.75 apertura numerica (NA)] ingrandimento / NA contrasto differenziale di interferenza (DIC) l&#39;ottica, un transilluminatore alogena Nikon con 0,52 NA lunga distanza di lavoro (LWD) condensatore, Nikon veloce (&lt;100 millisecondi tempo di commutazione), filtri di eccitazione e di emissione (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter veloce trasmessi e epifluorescenza percorso Valvola luce intelligenteTERS, una lineare codificato Nikon stadio motorizzato, un ORCA Hamamatsu-AG raffreddato charge-coupled device (CCD), macchina fotografica, una custom-built camera di incubazione microscopio con la temperatura e CO 2 di controllo, Nikon NIS-Elements AR software versione 3, e un TMC vibrazioni tavolo isolamento. </li><li> Gli sferoidi di cellule di cancro ovarico si depositerà sul fondo del piatto e allegare il monostrato cellulare mesoteliali. Raccogliere GFP, RFP e le immagini di fase di 20 + sferoidali / monostrato interazioni, ogni 10 minuti, per 8 ore. </li><li> Le RFP che esprimono sferoidi di cellule di cancro ovarico si invadere la GFP che esprimono monostrato di cellule mesoteliali la creazione di un buco nel monostrato. Dopo 8 ore, misurare le dimensioni dei fori tracciando i buchi neri nelle immagini GFP usando software Elements (o un altro software adatto come immagine J). Normalizza le dimensioni del foro alla dimensione iniziale sferoide dividendo la dimensione del foro a 8 ore dalla dimensione dello sferoide nell&#39;immagine RFP corrispondente al tempo zero. In questo exampio, la dimensione del foro è stata misurata una volta sola, ma può essere misurata più volte durante l&#39;esperimento otto ore per comprendere meglio le dinamiche di intercalazione. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi In questo esempio, abbiamo confrontato la capacità mesoteliali liquidazione dei OVCA433 sferoidi di cellule di cancro ovarico che hanno attenuato l&#39;espressione della Talin-1 per controllare OVCA433 sferoidi. OVCA433 sferoidi di ciascun gruppo sono stati aggiunti ad un piatto MatTek contenente ZT monostrati di cellule mesoteliali. Sei sferoidi di ogni gruppo sono stati ripresi ogni 10 minuti per otto ore (Figura 4, Movie 3, Movie 4). I fori prodotti nella monostrato dai sferoidi diffusione sono state misurate e sei posizioni di ciascun gruppo sono stati mediati. La figura 4 mostra che l&#39;area di clearance media creato da Talin 1 sferoidi atterramento era significativamente più piccola rispetto alla superficie media creato da sferoidi di controllo, suggerendo che Talin è necessario per la loro liquidazione mesoteliali da OVCA433 carcinoma ovarico sferoidi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig1.jpg" /> Figura 1. Cancer Metastasi ovarica. Tumori ovarici primari sviluppare sia dall&#39;epitelio di superficie ovarico o tube di Falloppio. Le cellule tumorali / cluster staccarsi dal tumore primario e raccogliere nella cavità peritoneale. Le cellule tumorali possono quindi aggregare per formare sferoidi multicellulari. Sferoidi quindi allegare ai monostrati di cellule mesoteliali che rivestono la cavità peritoneale. Le cellule mesoteliali sono esclusi da sotto lo sferoide allegata cancro ovarico, consentendo gli sferoidi di accedere alla membrana basale sottostante. Movie 1. Metastasi del cancro ovarico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_1_Lower_Quality.mp4">Clicca qui per vedere il film</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig2.jpg" /> Figura 2. </strong&gt; Linea mesoteliale cellule della superficie del tessuto umano peritoneale e sono esclusi da sotto gli impianti di cellule di cancro ovarico. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig3.jpg" /> Figura 3. Assay Clearance mesoteliali. Sferoidi carcinoma ovarico formate incubando 100 RFP cellule esprimenti carcinoma ovarico per pozzetto in una poli-HEMA rivestita 96 piatto fondo del pozzetto rotondo coltura a 37 ° C per 16 ore. Poly-HEMA impedisce alle cellule di attaccarsi alla piastra di coltura, permettendo alle cellule di rimanere in sospensione e aderire l&#39;una all&#39;altra a formare un unico cluster per pozzetto. Monostrati di cellule mesoteliali sono preparati mediante placcatura 6x10 5 cellule mesoteliali per pozzetto in una fibronectina rivestito 6 ben piatto MatTek e incubando la piastra a 37 ° C per 16 ore. Gli sferoidi sono poi trasferiti al piatto MatTek con il monostrato mesoteliali e le due popolazioni cellulari vengono esposte ogni 10 minuti per 8 ore utilizzando un legame Ti-E Nikon Inverted motorizzato widefield fluorescenza time-lapse microscopio e software Elements. Movie 2. Saggio Clearance mesoteliali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_2_lower_quality.mp4">Clicca qui per vedere il film</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig4.jpg" /> Attenuazione Figura 4. Di Talin uno espressione in OVCA433 sferoidi possono diminuire la capacità mesoteliali clearance. OVCA433 sferoidi (rosso) con e senza l&#39;espressione attenuata di Talin 1 sono stati autorizzati a cui attaccarsi e invadere in un monostrato ZT mesoteliali (verde). Le due popolazioni cellulari sono stati ripresi ogni 10 minuti per 8 ore utilizzando una Ti-E Nikon invertito motorizzato widefield fluorescenza time-lapse microscopio e software elementi. Il grafico mostra che Talin 1 attenuazioneriduce significativamente la clearance delle cellule mesoteliali (plot Quantile con barre verdi i mezzi). Movie 3. Controllo OVCA433 sferoidi (rosso) che invadono in un monostrato mesoteliali (verde). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_3.mov">Clicca qui per vedere il film</a> . Attenuazione Movie 4. Di Talin uno espressione in OVCA433 sferoidi (rosso) diminuisce mesoteliali (verde) capacità di clearance. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_4.mov">Clicca qui per vedere il film</a> .

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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Il &quot;test Liquidazione mesoteliale&quot; qui presentata usa microscopia time-lapse per monitorare le interazioni di sferoidi multicellulari di cancro ovarico e monostrati di cellule mesoteliali, in grande dettaglio spaziale e temporale. In precedenza, diversi gruppi 8-14 aveva usato saggi endpoint per dimostrare che le cellule tumorali ovariche attaccarsi e invadere monostrati di cellule mesoteliali. Questo saggio è unico in quanto utilizza celle fluorescente di distinguere le cellule tumorali da cellule ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> OVCA433 Ovarian Cancer Cells </td><td></td><td></td><td> Regalo da Dr. Dennis Slamon </td></tr><tr><td> ZT cellule mesoteliali </td><td></td><td></td><td> Regalo da Dr. Tan Ince </td></tr><tr><td> Medium 199 </td><td> Gibco </td><td> 19950 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB105 </td><td> Cella Applications Inc. </td><td> 117-500 </td><td></td></tr><tr><td> -FBS inattivato al calore </td><td> Gibco </td><td> 10082 </td><td></td></tr><tr><td> Pen-Strep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Piastre da 96 pozzetti </td><td> Corning Costar </td><td> 3799 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 192066-25G </td><td> Per poli-HEMA soluzione sciogliere 6mg poli-HEMA polvere in 1 ml di 95% EtOH </td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Pharmco-aaper </td><td> 111ACS200 </td><td> Diluire al 95% in DH 2 0 </td></tr><tr><td> Coltura cellulare cappuccio </td><td> Nuaire </td><td> NU-425-300 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue incubatore per colture </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> incubatore di poly-HEMA piastre </td><td> Labline Instruments </td><td> Imperial III 305 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga da tavolo </td><td> Heraeus </td><td> 75003429/01 </td><td></td></tr><tr><td> 6 pozzetti con fondo di vetro piatto </td><td> MatTek corp. </td><td> P06G-1.5-20-F </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Sigma </td><td> F1141-1MG </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Timelapse microscopio: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Nikon </td><td></td><td> Ti-E motorizzato invertito a fluorescenza time-lapse microscopio integrato con un sistema di messa a fuoco perfetta </td></tr><tr><td> Lente </td><td> Nikon </td><td></td><td> 20X-0.75 apeture numerica </td></tr><tr><td> Alogena transilluminatore </td><td> Nikon </td><td></td><td> 0,52 NA lunga distanza di lavoro del condensatore </td></tr><tr><td> Eccitazione ed emissione filtri </td><td> Chroma filtri passa singoli Nikon custodia </td><td></td><td> GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 </td></tr><tr><td> Trasmessi e Epifluoresce percorso della luce </td><td> Sutter </td&gt; <td></td><td> Persiane Smart </td></tr><tr><td> Linear-encoded stage motorizzato </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Raffreddato charged-coupled fotocamera del dispositivo </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA-AG </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio camera di incubazione con la temperatura e CO 2 di controllo </td><td> custom-built </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isolamento delle vibrazioni tavolo </td><td> TMC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS-Elements software </td><td> Nikon </td><td></td><td> Versione 3 </td></tr></tbody></table>

in vitro test clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Il cancro ovarico è la quinta causa di decessi per cancro correlati negli Stati Uniti 1. Nonostante un iniziale risposta positiva alle terapie, da 70 a 90 per cento delle donne con tumore ovarico sviluppare nuove metastasi, e la ricorrenza è spesso fatale 2. Si tratta, quindi, necessario capire come metastasi secondarie sorgono al fine di sviluppare migliori trattamenti per il cancro fase intermedia e tardiva dell&#39;ovaio. Metastasi del cancro ovarico si verifica quando le cellule maligne si staccano dal tumore primario e diffondere in tutta la cavità peritoneale. Le cellule diffusi possono formare aggregati multicellulari, o sferoidi, che uno rimanga unattached, o impianto sul organi all&#39;interno della cavità peritoneale 3 (figura 1, film 1). Tutti gli organi all&#39;interno della cavità peritoneale sono rivestite con un unico strato continuo di cellule mesoteliali 4-6 (Figura 2). Tuttavia, le cellule mesoteliali sono assenti da sottomasse tumorali peritoneali, come rivelato dagli studi al microscopio elettronico di sezioni umani asportati 3,5-7 tessuto tumorale (Figura 2). Questo suggerisce che le cellule mesoteliali sono esclusi da sotto la massa tumorale da un processo sconosciuto. Precedente esperimenti in vitro hanno dimostrato che cellule primarie di cancro ovarico collegare in modo più efficace matrice extracellulare che di cellule mesoteliali 8, e studi più recenti hanno dimostrato che le cellule primarie peritoneali mesoteliali in realtà costituiscono una barriera per l&#39;adesione delle cellule del cancro ovarico e l&#39;invasione (rispetto alla adesione e l&#39;invasione su supporti che non sono stati coperti con le cellule mesoteliali) 9,10. Questo suggerisce che le cellule mesoteliali fungere da barriera contro il cancro ovarico metastasi. I meccanismi cellulari e molecolari con cui le cellule del cancro ovarico violare questa barriera, ed escludere il mesotelio hanno, fino a poco tempo, è rimasto sconosciuto. Qui si descrive °metodologia e di un test in vitro che modella l&#39;interazione tra sferoidi di cellule di cancro ovarico e cellule mesoteliali in vivo (figura 3, Movie 2). Il nostro protocollo è stato adattato da metodi descritti in precedenza per analizzare le interazioni delle cellule tumorali ovariche con monostrati mesoteliali 8-16, ed è stata descritta in un rapporto che mostra che le cellule tumorali ovariche utilizzano un integrina-dipendente l&#39;attivazione della miosina e la forza di trazione per promuovere l&#39;esclusione del cellule mesoteliali da sotto un tumore 17 sferoide. Questo modello si avvale di time-lapse microscopia a fluorescenza per monitorare le due popolazioni cellulari in tempo reale, fornendo informazioni spaziale e temporale sull&#39;interazione. Le cellule del carcinoma ovarico esprimere la proteina fluorescente rossa (RFP), mentre le cellule mesoteliali esprimere la proteina fluorescente verde (GFP). RFP che esprimono sferoidi di cellule di cancro ovarico allegare alla GFP-esprimere monostrato mesoteliali. La diffusione sferoidi, invadere, eforzare le cellule mesoteliali parte creando un foro nel monostrato. Questo foro è visualizzato come lo spazio negativo (nero) nell&#39;immagine GFP. L&#39;area del foro può essere misurata per analizzare quantitativamente differenze di attività di gioco tra le popolazioni di controllo e sperimentali di cancro ovarico e / o cellule mesoteliali. Questo saggio necessita soltanto un piccolo numero di cellule di cancro ovarico (100 cellule per sferoidali X 20-30 sferoidi per condizione), quindi è possibile eseguire questo saggio con preziosi campioni di cellule del tumore primario. Inoltre, questa analisi può essere facilmente adattato per lo screening ad alto rendimento.

Il saggio di liquidazione mesoteliali qui descritto si avvale di cellule fluorescente e microscopia time-lapse video visualizzare e misurare quantitativamente le interazioni di sferoidi multicellulari di cancro ovarico e monostrati di cellule mesoteliali. Questo saggio modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico.

In vitro test Clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico

Il cancro ovarico è la quinta causa principale di morte per cancro negli Stati Uniti1. Nonostante una risposta iniziale positiva alle terapie, dal 70 al 90...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la capacità degli steroidi multicellulari del carcinoma ovarico di invadere un monocstrato mesoteliale. Questo viene ottenuto innanzitutto incubando cellule del carcinoma ovarico che esprimono la proteina fluorescente rossa in piastre per colture a bassa adesione, al fine di formare steroidi multicellulari. Il passo successivo consiste nel seminare cellule mesoteliali che esprimono la proteina fluorescente verde su piatti per colture con fondo in vetro rivestito di fibronectina, al fine di formare monocstrati. L'ultimo passaggio consiste nel trasferire i foci di cancro ovarico dalle piastre a bassa adesione alle piastre contenenti i monociti mesoteliali. Infine, la microscopia video a fluorescenza con acquisizione temporale viene utilizzata per quantificare l'abilità relativa delle cellule di cancro ovarico di controllo e sperimentali. SP di formare un foro nel monocito mesoteliale.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai saggi endpoint esistenti consiste nell'utilizzo di una combinazione di cellule marcate con fluorescenza e microscopia video in time-lapse per monitorare nel tempo la dinamica della rimozione mesiale. Prima della formazione di phe di carcinoma ovarico, è necessario preparare piastre per coltura a 96 pozzetti con fondo rotondo a bassa adesione. Per produrre queste piastre, aggiungere 30 microlitri di soluzione di poli-hema in ciascun pozzetto di una piastra per coltura cellulare a 96 pozzetti.Incubare le piastre a 96 pozzetti in un'incubatrice non umidificata a 37 gradi Celsius per 24-48 ore per far evaporare l'etanolo, lasciando un film di poli-HEMA su ciascun pozzetto. Questo film di poli-HEMA impedisce alle cellule di attaccarsi al fondo del pozzetto, costringendole a crescere in sospensione. Le cellule di carcinoma ovarico che esprimono la proteina fluorescente rossa in questo esperimento vengono coltivate in un mezzo basale al 10%, un mezzo di coltura cellulare personalizzato, una volta che le piastre per coltura a bassa adesione sono pronte.Trasferire le cellule di cancro ovarico trattandole con tripsina lavando prima la piastra con PBS, quindi aggiungendo un millilitro di tripsina e incubando la piastra a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver aggiunto il mezzo base al 10% per neutralizzare la tripsina, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico in polipropilene da 15 millilitri. Centrifugare le cellule in un centrifuga da banco a 900 RCF per tre minuti, aspirare il soprannatante e risospendere le cellule nel mezzo base al 10%.Dopo aver contato le cellule utilizzando un emocitometro, regolare la concentrazione delle cellule a 100 cellule per 50 microlitri di mezzo 10%Base; aggiungere 50 microlitri della sospensione cellulare diluita e uniformemente sospesa in ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti rivestita con poli-HEMA. Incubare la piastra da 96 pozzetti in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius per 16 ore, consentendo alle cellule di cancro ovarico di aggregarsi, formando un singolo steroide multicellulare in ciascun pozzetto. Per iniziare questa procedura, prerivestire i pozzetti di una piastra da 6 pozzetti con fondo in vetro (MatTek) con fibronectina. Aggiungere due millilitri di soluzione di fibronectina in PBS in ciascun pozzetto della piastra e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.Le cellule mesoteliali esprimenti la proteina fluorescente verde, utilizzate per formare un monostrato di cellule mesoteliali, vengono coltivate in mezzo base al 10%. Dopo aver trattato con tripsina la piastra di cellule mesoteliali, si centrifugano le cellule in una centrifuga da banco a 900 giri al minuto per tre minuti. Si asporta il soprannatante e si risospendono le cellule nel mezzo base al 10%, aggiustando la concentrazione desiderata con mezzo base al 10%. Al termine dell'incubazione di trenta minuti con fibronectina della piastra Mat Tech, si lavano le pozzette con due millilitri di PBS, si asporta il PBS e si seminano 6 × 10⁵ cellule mesoteliali per pozzetta in ciascuna pozzetta della piastra Mat Tech a sei pozzette.Incubare la piastra mat tech in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius durante la notte, in modo da permettere alle cellule mesoteliali di aderire alla piastra e formare un monostrato. Per iniziare questo saggio, utilizzare una pipetta per raccogliere il PHE del carcinoma ovarico dalla piastra poli-hema rivestita a 96 pozzetti, aspirare il mezzo da un pozzetto della piastra mat tech a sei pozzetti contenente un monostrato di cellule mesoteliali, lavare una volta con due millilitri di PBS, quindi aggiungere tutto il PHE proveniente dalla piastra a 96 pozzetti in un pozzetto della piastra mattec. Questo corrisponde a circa tre volte il numero di cellule stromali che verranno analizzate, per compensare il PHE che si deposita su aree della piastra non visibili in fase di imaging.Poiché si desidera immaginare un solo steroido per campo visivo, è necessario evitare l'aggregazione degli steroidi. Agitare delicatamente la piastra da un lato all'altro per distribuire uniformemente gli steroidi sull'intero monolayer prima che si attacchino. Posizionare la piastra Mat Tech sul piatto di un microscopio a fluorescenza invertito a campo chiaro.In grado di eseguire acquisizioni temporali per una durata di almeno otto ore. Utilizzare uno stage motorizzato per acquisire più posizioni nella piastra con multipli eventi di intercollazione OID. In un singolo esperimento, la cellula di carcinoma ovarico PHE si depositerà sul fondo della piastra e si attaccherà alla cellula mesoteliale.Il monocstrato acquisisce immagini di G-F-P-R-F-P e in fase di oltre 20 interazioni tra sferoidi e monocstrato ogni 10 minuti per otto ore. Nel saggio di eliminazione delle cellule mesoteliali, la cellula tumorale ovarica esprimente RFP PHE invaderà il monocstrato di cellule mesoteliali esprimenti GFP, creando dei fori nel monocstrato. Le dimensioni dei fori vengono misurate tracciando i fori neri nelle immagini GFP utilizzando il software Element o un altro software adeguato come ImageJ. La dimensione del foro viene quindi normalizzata rispetto alla dimensione iniziale dello sferoide dividendo la dimensione del foro a otto ore per la dimensione dello sferoide corrispondente nell'immagine RFP al tempo zero. Il saggio di eliminazione delle cellule mesoteliali può essere utilizzato per confrontare l'abilità invasiva di sferoidi di cellule tumorali ovariche che sono stati modificati geneticamente, al fine di chiarire i meccanismi molecolari attraverso cui gli sferoidi di cellule tumorali ovariche eliminano.Il monolayer mesoteliale in questo esempio, l'abilità di clearance MESOTELIALE delle cellule di carcinoma ovarico OVCA 433. I PHE che presentavano espressione attenuata di Talon-1 sono stati confrontati con quelli di controllo OVCA 433 OIDs. I fori prodotti nel monolayer dallo spreading dei PHE sono stati misurati e le sei posizioni di ciascun gruppo sono state mediate.Come mostrato in questo grafico, l'area media di clearance creata dai steroidi con silenziamento di Talon era significativamente più piccola rispetto all'area media creata dagli steroidi di controllo, suggerendo che Talon è necessario per il clearance mesoteliale da parte delle cellule tumorali ovariche OVCA 4 33. Questo filmato in time-lapse mostra uno steroide rosso OVCA 4 33 di controllo che invade un monocstrato mesoteliale verde. Questo successivo filmato in time-lapse mostra uno steroide rosso OVCA 4 33 con espressione attenuata di Talon uno che invade un monocstrato mesoteliale verde.Rispetto al filmato precedente, è evidente che l'attenuazione dell'espressione di Talon uno negli steroidi riduce la capacità di clearance mesoteliale. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come monitorare nel tempo l'interazione tra cancro ovarico, steroidi multicellulari e monociti di cellule mesoteliali mediante microscopia video a tempo differito.

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Eterotipica tridimensionale<em&gt; In Vitro</emModellazione&gt; di stromale-epiteliali interazioni Durante iniziazione e la progressione del cancro ovarico

In questo video, dimostriamo lo sviluppo di un modello tridimensionale in vitro del rivestimento della cavità peritoneale. Questa coltura organotipica può aiutare a studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

Modellazione delle metastasi del cancro ovarico nel rivestimento della cavità peritoneale: un metodo per stabilire un modello 3D in vitro del rivestimento peritoneale

Questo video descrive una tecnica per misurare quantitativamente l'interazione degli sferoidi del cancro ovarico con le cellule mesoteliali, utilizzando cellule marcate in fluorescenza e microscopia video time-lapse. Questo test in vitro modella l'interazione tra gli sferoidi delle cellule tumorali ovariche metastatizzanti e le cellule mesoteliali che rivestono la cavità peritoneale in vivo.

Saggio di clearance mesoteliale: una tecnica in vitro per quantificare la capacità di invasione degli sferoidi del cancro ovarico nei monostrati di cellule mesoteliali

Ovarico invasione delle cellule di cancro nel rivestimento mesoteliali del peritoneo è un processo dinamico nel tempo. Utilizzando un analizzatore in tempo reale, la capacità invasiva delle cellule tumorali ovariche in una cella modello di co-coltura sferoide-mesoteliali può essere quantificato in periodi di tempo prolungati, fornendo approfondimenti fattori che regolano il processo metastatico.

Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l&#39;invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Delineiamo un protocollo che implementa approcci sia in vivo che ex vivo per studiare la colonizzazione del cancro ovarico dei tessuti adiposi peritoneali, in particolare dell'omento. Inoltre, presentiamo un protocollo per quantificare e analizzare le strutture cellulari immunitarie nell'omento, note come macchie lattiginose, che promuovono le metastasi del adiposo peritoneale.

In vivo ed ex vivo approcci per studiare il cancro ovarico metastatico colonizzazione delle strutture Lattea Spot in peritoneale adiposo

Le metastasi del cancro ovarico sono caratterizzate da numerose lesioni diffuse intra-peritoneali, tali da rendere difficile un'accurata quantificazione visiva del carico tumorale.  Qui descriviamo un metodo per la quantificazione in situ ed ex vivo del carico tumorale metastatico utilizzando cellule tumorali marcate con proteina fluorescente rossa (RFP) e imaging ottico.

La quantificazione di intra-peritoneale del cancro ovarico metastasi

Qui, presentiamo un protocollo per costruire un modello tridimensionale in vitro del rivestimento della cavità peritoneale, composto da cellule mesoteliali umane primarie e fibroblasti stratificati con matrice extracellulare, come strumento per studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

Modellazione Piazza precoci di cancro ovarico Diffusione in una cultura Organotipica della Cavità peritoneale umano

Per chiarire il processo a più fasi di diffusione peritoneale del carcinoma ovarico, questo studio presenta un modello sperimentale murino di sviluppo del tumore originale e metastasi peritoneali tramite inoculazione ortotopico con queste cellule tumorali.

Modello murino sperimentale di sviluppo del tumore originale e peritoneale Metastasi<em&gt; via</em&gt; Ortotopico inoculazione con cellule dell&#39;ovaio Carcinoma

Per studiare la progressione del tumore ovarico in un modello fisiologicamente rilevanti, sferoidi multicellulari sono state coltivate in un Microdevice sotto flusso del fluido simulato. Questo modello 3D dinamica emula l'ambiente intraperitoneale con i componenti cellulari e meccanici in cui si verifica metastasi del cancro ovarico.

Modellazione Comportamento Ovarian Cancer multicellulare Spheroid in un Microdevice dinamica 3D peritoneale

Questo protocollo descrive la creazione di un modello tridimensionale (3D) ex vivo dell'interazione cellula tumorale-omento. Il modello fornisce una piattaforma per chiarire i meccanismi pro-tumorali all'interno della nicchia adiposa e per testare nuove terapie.

Un modello ex vivo di metastasi peritoneali del carcinoma ovarico con omento umano

Scopri come modellare la clearance mesoteliale in vitro per studiare i primi passi della metastasi del cancro ovarico utilizzando microscopia a fluorescenza time-lapse. Questo metodo permette di quantificare l'invasione cellulare in tempo reale.

In vitro test Clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico

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