Flussi di lavoro di etichettatura della proteasi e catalizzata da acidi Impiegando

Questa presentazione illustra i flussi di lavoro per la marcatura isotopica stabile di digesti proteici e peptidi sintetici mediante acqua arricchita con ossigeno 18, utilizzata inizialmente nell'esperimento cronologico paleoproteomico catalizzato da proteasi, in cui il substrato e la proteasi vengono incubati in presenza di acqua arricchita al 50% con ossigeno 18 per incorporare atomi di ossigeno-18. Successivamente, se la proteasi è in grado di una doppia marcatura, ripetere l'incubazione dei prodotti derivanti dal taglio post-digestione con la proteasi di interesse in presenza di acqua arricchita al 50% con ossigeno 18.

Il flusso di lavoro EO esegue l'incorporazione catalizzata da acido di atomi di ossigeno 18 in gruppi funzionali a intervalli temporali definiti. Aliquote prelevate a intervalli regolari dalle miscele di reazione, depositate con matrice su piastre target sporche, durante l'acquisizione dei dati spettrometrici di massa generano grafici spettrali nel tempo delle reazioni di scissione dei peptidi, nonché grafici di incorporazione dell'ossigeno 18 per singole specie peptidiche. I prodotti di scissione marcati selezionati vengono sottoposti a identificazione sequenziale basata su MSM S. In definitiva, questi flussi di lavoro offrono strumenti versatili per studi proteomici qualitativi e quantitativi.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sulle proteasi, come l'identificazione della velocità, dei passaggi limitanti e degli intermedi di reazione in percorsi proteolitici complessi. Le firme proteolitiche identificate mediante l'andamento temporale paleo forniscono informazioni importanti riguardo alla specificità del substrato. Inoltre, i timer dei dati utilizzano anche informazioni cinetiche.

Un ricercatore postdottorato del mio laboratorio illustrerà ora la procedura. Il flusso di lavoro della serie temporale paleoproteomica monitora la dinamica delle reazioni di scissione proteolitica basandosi sull'incorporazione di ossigeno 18 catalizzata dalla proteasi; per la reazione da 20 microlitri, aggiungere i peptidi campione al tampone di reazione della proteasi contenente acqua arricchita con ossigeno 18, miscelare 0,5 microlitri della miscela di reazione con 0,5 microlitri di matrice su un piatto target MALDI da 384 spot e lasciare evaporare le gocce di solvente a temperatura ambiente fino a completa essiccazione. Nel frattempo, dividere la miscela di reazione in due provette.

Controllo e campione per il tubo del campione. Aggiungere la proteasi di interesse e incubare alla temperatura raccomandata per la reazione enzimatica. Aggiungere i punti temporali specificati.

Prelevare un'aliquote di 0,5 microlitri da mescolare con 0,5 microlitri di matrice e depositare sulla piastra con multi-target. Procedere all'analisi della dinamica della reazione mediante spettrometria di massa MALDI-TOF MS come descritto successivamente in questo protocollo di etichettatura post-digestione. SN produce enzimi come la tripsina, che catalizzano la reazione di scambio dell'ossigeno carbossilico per incorporare l'ossigeno-18. Dopo aver eseguito una digestione proteica senza etichettatura con ossigeno-18, far passare i prodotti di scissione attraverso una colonna C18 per pep clean in spin per eliminare le attività proteasiche residue.

Quindi risospendere i campioni in 20 microlitri di tampone di reazione della tripsina contenente acqua arricchita con ossigeno 18. Prelevare un'aliquote di 0,5 microlitri e mescolarla con un volume uguale di matrice. Successivamente, depositare su una piastra target maldi opti off 3 84 e lasciare asciugare all'aria.

Successivamente, suddividere la soluzione di reazione in provette di controllo e provette campione per la provetta campione. Aggiungere la tripsina e incubare a 37 gradi Celsius. Per monitorare la reazione, prelevare un'aliquota di 0,5 microlitri.

Mescolare con 0,5 microlitri di matrice e depositare su una piastra in malto. Analizzare la dinamica di questa reazione di scambio dell'ossigeno carbossilico mediante analisi Maldi Toof MSM S. Il flusso di lavoro IEO basato sul tempo si basa sulle reazioni di scambio dell'ossigeno carbossilico catalizzate da acido nei gruppi laterali e terminali acidi dei peptidi.

Incubare innanzitutto 50 nanomolar di peptidi singoli con acqua arricchita con ossigeno 18 in rapporto uno a uno in presenza o assenza di acido tricloroacetico allo 0,1% finale. Prelevare aliquote di 0,5 microlitri della reazione ogni giorno per 48 giorni e co-spotarle direttamente con la matrice su una piastra target MALDI. Sottoporre regolarmente la piastra target MALDI ad analisi dei prodotti mediante spettrometria di massa MALDI TOF MS. Questa sezione è descritta in dettaglio nel manoscritto allegato.

Acquisire innanzitutto tre spettri MS in modalità ioni positivi. Dopo aver calibrato il multiplo e impostato l'acquisizione MS, acquisire singoli spari per sottospettri. Successivamente, esportare i file di dati MS dal software di acquisizione dati Explorer della serie 4.000.

Quindi importare in un sistema informativo interno che utilizza il software Mascot Distiller per l'elaborazione degli spettri e il rilevamento dei picchi. Deconvolvere gli involucri isotopici e determinare automaticamente i rapporti di incorporazione dell'ossigeno 18, annotando tali rapporti come contributi relativi delle singole specie isotopiche del peptide all'intero involucro isotopico. Filtrare l'elenco dei bin e raggruppare almeno tre valori con una larghezza di massa di 100 PPm per ogni esperimento in corso temporale.

Estrarre le masse molecolari di tutte le specie peptidiche rilevate dai file di dati MS associati. Ora, utilizzando X pacey, impostare un set di peptidi con una tolleranza di errore di massa accettabile del 200 PPM. Confrontare l'elenco dei bin con i dati dei prodotti di scissione proteolitica previsti a partire dalla sequenza del peptide substrato.

Procedere all'acquisizione di spettri msms per tutti i valori di massa dei prodotti di scissione predetti dallo strumento find pep e per i valori bin associati all'incorporazione di ossigeno 18. Raccogliere dati MSM S di 50 colpi in un modello randomizzato per ogni sottospettro con fino a 40 sottospettri per spot ed esportare i file msms. Successivamente, esportare i file di dati MSM S nel sistema di analisi per la rilevazione dei picchi e per ottenere liste di picchi MSM S associati ai corrispondenti dati di bend MS per l'identificazione dei peptidi.

Impostare questi parametri di ricerca nel motore di ricerca Mascot: nessuna specificità enzimatica, tolleranza di massa di 150 PPM per gli ioni precursore e di 0,2 Dalton per gli ioni frammento. Eseguire la ricerca delle liste M-S-M-S-P contro il database Swiss-Prot. Le identificazioni dei peptidi possono inoltre essere convalidate utilizzando un software di analisi dati, confermando i caratteristici schemi di incorporazione dell'ossigeno 18 nei frammenti ionici per i grafici temporali degli spettri.

Esportare i file di dati MS per ogni punto temporale della reazione dai file ASCI del software data explorer utilizzando una macro. Successivamente, importare i file in un programma di analisi dati e grafica e visualizzarli come grafici a cascata per creare grafici di incorporazione dell'ossigeno 18 per ogni curva. Dal prodotto di scissione del peptide, estrarre i contributi relativi delle singole specie isotopiche del peptide in tutti i punti temporali della reazione, quindi tracciarli in funzione del tempo.

I grafici spettrali nel tempo come questo mostrano la dinamica delle reazioni di scissione proteolitica. Questo esperimento analizza la scissione del peptide bioattivo endo e C da parte dell'enzima di conversione endoteliale uno. Una disposizione a cascata riporta gli spettri di spettrometria di massa (MS) degli esperimenti in serie temporale per monitorare contemporaneamente la degradazione del substrato e la comparsa di prodotti intermedi e finali.

I prodotti di scissione sono identificati mediante MSMS e dalle caratteristiche firme di incorporazione dell'ossigeno 18 nei loro spettri isotopici. Questo meccanismo di reazione della tripsina indica che le proteasi di tipo serinico mediano l'incorporazione di fino a due atomi di ossigeno 18 nei prodotti di scissione peptidica. Nel protocollo di marcatura basato su proteasi, la reazione di scissione del legame peptidico determina un rapporto di incorporazione del 50% di un singolo atomo di ossigeno 18 nei prodotti di scissione peptidica appena generati; proteasi come la tripsina, che rilegano i prodotti della reazione, catalizzano ulteriormente l'incorporazione di un secondo atomo di ossigeno 18 attraverso la reazione di scambio degli ossigeni carbossilici.

All'equilibrio, il marcatore ossigeno 18 è distribuito in un rapporto di uno a due a uno tra prodotti non marcati, singolarmente marcati e doppiamente marcati. Nel protocollo di marcatura con pre-digestione dei termini proteolitici, non avvengono scissioni dei legami peptidici. Al contrario, l'incorporazione di fino a due atomi di ossigeno 18 si basa esclusivamente sulla reazione di scambio degli ossigeni carbossilici.

Pertanto, l'incorporazione dell'ossigeno 18 avviene solo con le proteasi che legano nuovamente i prodotti del taglio peptidico. La marcatura con ossigeno 18 catalizzata da acido porta all'incorporazione di due atomi di ossigeno 18 per ogni gruppo carbossilico. Nel corso di questo esperimento, gli spostamenti multipli di due Dalton dell'inviluppo isotopico dell'angiotensina uno possono essere mappati in base all'assorbimento degli atomi di ossigeno 18.

Combinando l'etichettatura con OPE e la spettrometria di massa ad alta risoluzione in modo risolto nel tempo, il metodo della serie temporale paleontologica consente un'analisi dinamica della generazione di prodotti peptidici. Il saggio può essere utilizzato per generare peptidi etichettati in modo topico e stabilizzati per studi proteomici qualitativi e quantitativi, e per valutare la cinetica con cui vengono generati i peptidi Protopic.

Il corso temporale Paleo è progettato per valutare i percorsi proteolitici in condizioni fisiologicamente rilevanti. Questa tecnica ha aperto la strada al nostro recente studio sui processi litici nei microambienti del cancro umano.