Name: Flussi di lavoro di etichettatura della proteasi e catalizzata da acidi Impiegando 18 O arricchita di acqua (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Scopri i flussi di lavoro per l'etichettatura con isotopi stabili di digeriti proteici e peptidi sintetici utilizzando acqua arricchita con 18O. Questi metodi combinano workflow assistiti da proteasi e catalizzati da acidi per studi proteomici quantitativi e qualitativi.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIDCR sovvenzione 1R01DE019796.

Le presentati leo-flussi di lavoro consentono una etichettatura degli isotopi stabili di proteine ​​e peptidi sintetici digerisce. Questi esperimenti tempo (Figura 1) sono applicabili a comparativi e quantitativi studi di proteomica e la ricerca della proteasi. Ogni flusso di lavoro è costituito da due fasi sperimentali (Figura 2): A) Il tempo di campionamento risolta del rispettivo 18 O-isotopi stabili con codifica reazione (proteasi-catalizzata clivaggio peptide; proteasi-catalizzata carbossilico reazione di scambio di ossigeno, acido-catalizzata scambio di ossigeno carbossilico reazione) e B) analisi mediante spettrometria di massa e la rappresentazione grafica di 18-O incorporazione cinetica. A. TimeCourse Esperimenti I. Paleo-TimeCourse: Proteasi-catalizzata etichettatura dei cleavages proteolitici <ol><li> (Opzionale) legami disolfuro di proteine ​​(10 mM) e peptidi (250 mM) sono ridotte con DTT (concentrazione finale 2.5 mM)in 25 mM NH 4 HCO 3 (sia preparata) mediante incubazione per 30 minuti a 50 ° C. </li><li> (Facoltativo) cisteine ​​libere sono alchilata con iodoacetamide (concentrazione finale 10 mM) in 25 mM di NH 4 HCO 3 mediante incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> A seconda della proteasi di interesse, di proteine ​​/ peptidi soluzioni devono essere ripulito per eliminare i residui di tampone e agente di alchilazione. Utilizzare PepClean colonne C-18 di spin (Thermo) per la pulizia peptide e Vivaspin centrifuga Concentratori (Sartorius) per scambiare i buffer per campioni di proteine. </li><li> Ridisciogliere / peptidi / proteine ​​di cambio in 20 microlitri di buffer di reazione proteasi (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenente 1:1 (v / v) def H 2 18 O (95%, Sigma Isotec). </li><li> Prelevare un campione di zero punto temporale prima dell&#39;aggiunta della proteasi: Mix 0,5 microlitri della miscela di reazione e 0,5 microlitri alpha ciano-4-idrossicinnamicoacido matrice (10 mg / ml in 50% acetonitrile, 0,1% di TFA). Caricare il campione su un Opti-TOF 384 piastra segnale MALDI (AB SCIEX) e lasciare le goccioline di solvente a temperatura ambiente fino a secco (circa 5 minuti). </li><li> Dividere la soluzione di reazione in due aliquote. La prima aliquota viene incubato con la proteasi di interesse (ECE-1: 75 nM; tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura raccomandata per il particolare enzima. La seconda aliquota sarà incubata senza proteasi e servirà come campione di controllo. La prima aliquota rappresenta un campione standard di proteasi-catalizzata 18 O-etichettatura e può essere utilizzato per l&#39;identificazione di peptidi e proteine, rilevamento di attività proteolitiche e monitoraggio delle reazioni di scissione proteolitica. La seconda aliquota è usato per mostrare che il 18 O-incorporazione è indotta dalla proteasi, quindi, né etichettatura né scissione è prevista per questo esempio. </li><li> Seguire la reazione rimuovendo aliquote di reazione e spotting come described sotto passaggio 5 a intervalli di tempo, come sembra in forma. Le condizioni di reazione descritte sopra sono usati per controllare una reazione proteolitica fino a quattro giorni (circa 24 punti). Avviare il campionamento ogni 5 min fino al 30 min, quindi individuare ogni 30 minuti fino a 2 ore, poi ogni ora fino a 8 ore e ogni 8 ore fino a 4 giorni. Prodotti di scissione dovrebbe apparire entro i primi 12 ore e il supporto deve essere completamente idrolizzato dopo 24 ore. Estesa tempi di incubazione di reazione permettono di definire i prodotti di reazione stabili che sono discreti da intermedi di reazione, che vengono ulteriormente elaborati. Seconda domanda di ricerca e di proposta enzima-substrato coppie, i tempi di individuazione e temperatura di incubazione devono essere modulata per assicurare campionamento ottimale reazione. </li><li> Dopo l&#39;ultimo punto di tempo di reazione è macchiata o tra lunghi intervalli di avvistamento, la piastra di mira MALDI è sottoposto a MALDI-TOF/TOF MS / MS come descritto di seguito (sezione B). </li></ol> II. Paleo-TimeCourse: Postdigetichettatura estion di Termini proteolitici <ol><li> (Facoltativo) legami disolfuro di proteine ​​(10 pM) e peptidi (250 mM) sono ridotte con DTT (concentrazione finale di 2,5 mM) in 25 mM di NH 4 HCO 3 (entrambi preparati) mediante incubazione per 30 minuti a 50 ° C. </li><li> (Facoltativo) cisteine ​​libere sono alchilata con iodoacetamide (concentrazione finale 10 mM) in 25 mM di NH 4 HCO 3 mediante incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> A seconda della proteasi di interesse, di proteine ​​/ peptidi soluzioni devono essere ripulito per eliminare i residui di tampone e agente di alchilazione. Utilizzare le colonne PepClean C-18 di spin per la pulizia peptide e Vivaspin centrifuga Concentratori per lo scambio delle proteine ​​buffer. </li><li> Ridisciogliere / scambiare gli ripulito prodotti peptidici / proteine ​​in 20 microlitri di buffer di reazione proteasi tripsina (es: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) e digerire con proteasi di interesse al completamento (es. tripsina: 0,04 nM; 37 ° C, 12 ore). </li><li> Scissione Cleanup con colonne PepClean C-18 di spin. Questo passo sarà eliminare le attività residue della proteasi. </li><li> Ridisciogliere / scambiare gli ripulito prodotti peptidici in 20 microlitri di buffer di reazione proteasi (tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenente 1:1 (v / v) def H 2 O. 18 </li><li> Prelevare un campione di zero punto temporale prima dell&#39;aggiunta di enzima: Mix 0,5 microlitri della miscela di reazione e 0,5 microlitri alpha ciano-4-idrossicinnamico matrice di acido (10 mg / ml in 50% acetonitrile, 0,1% di TFA). Spot campione su una piastra MALDI e lasciare le goccioline di solvente a temperatura ambiente fino a secco (circa 5 min). </li><li> Dividere la soluzione di reazione in due aliquote. La prima aliquota viene incubato con proteasi di interesse (ad esempio tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura consigliata per la particolare enzima. La seconda aliquota sarà incubata senza proteasi e servirà come controllo. Il primoUn&#39;aliquota rappresenta un campione standard per proteasi-catalizzata 18 O-postdigestion etichettatura e può essere utilizzato per la quantificazione delle proteine ​​e peptidi. La seconda aliquota è usato per mostrare che il 18 O-incorporazione è catalizzata dalla proteasi, pertanto, alcuna etichettatura è prevista per questo esempio. </li><li> Seguire la reazione rimuovendo aliquote di reazione e spotting come descritto al punto 7.) Ad intervalli di tempo, come sembra in forma. Per esempio, abbiamo scoperto inizialmente ogni 5 minuti fino a 30 minuti e ogni 15 minuti dopo che per monitorare il carbossile reazione di scambio di ossigeno catalizzata da tripsina. </li><li> Dopo l&#39;ultimo punto di tempo di reazione è macchiata o tra lunghi intervalli di avvistare la piastra di mira MALDI è sottoposto a MALDI-TOF/TOF MS / MS come descritto di seguito (sezione B). </li></ol> III. Aleo-TimeCourse: acido-catalizzata etichettatura dei gruppi carbossilici <ol><li> Incubare singoli peptidi (50 nM) con 1:1 (v / v) 18 O-acqua arricchita in tegli presenza o assenza (controllo) del 0,1% (v / v) finale di acido trifluoroacetico (volume totale 30 microlitri). </li><li> I prodotti di reazione del campione al giorno per 48 giorni per co-spotting una aliquota 0,5 microlitri della miscela con 0.5μl di alfa ciano-4-idrossicinnamico matrice di acido (10 mg / ml in 50% acetonitrile, 0,1% TFA) direttamente su un bersaglio MALDI piastra. </li><li> Tra gli intervalli di spotting e dopo aver individuato il punto finale tempo di reazione presenta una piastra segnale per MALDI-TOF/TOF MALDI MS / MS, come descritto di seguito nella sezione B. </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MS di acquisizione dati e analisi <ol><li> Gli spettri di massa sono invece acquistati su MALDI 4800 TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX). </li><li> Prima dell&#39;analisi, lo strumento è tarato con una miscela di standard peptide (Messa Kit standard per la calibrazione di AB SCIEX TOF / TOF strumenti), con una tolleranza massima di errore di massa di misura di ± 50 ppm e un numero minimo di sei picchi da abbinare. </li><li> MS (range di massa400 - 4.000 m / z) sono acquisiti in triplice copia utilizzando la modalità di ioni positivi con una intensità del laser regolabile (3.400 - 3.800; passo di 50) con un accettabile campo di intensità base del picco di 2.000 - 45.000. Scatti singoli vengano acquistate per sub-spettri, con 400 colpi totali / spettro, stop condizioni entreranno in vigore dopo 800 sub-spettri vengono acquisiti (positivo o negativo) o 400 sub-spettri criteri di accettazione passaggio. In caso di bassa abbondanti campioni o in presenza di complessi ambienti biologici l&#39;estremità inferiore del campo di rilevamento MS dovrebbe essere portato a 800 m / z. Inoltre, può essere necessario rimuovere sale e altri composti che interferiscono con un passo di pulitura campione come descritto in precedenza, o mediante separazione LC. </li><li> MS i file di dati (. T2D file) sono esportati dalla serie 4000 di acquisizione dati e software Explorer importati nella nostra in-house sistema di laboratorio informazione, che utilizza il software Distiller MASCOT (Matrix Science) per l&#39;elaborazione spettrale e il rilevamento di picco. Buste isotopichesono deconvoluto e 18 O-incorporazione coefficienti determinati automaticamente utilizzando un algoritmo simile a quello descritto da Mason et al. 12 e adattato dal nostro gruppo 9. Alternativamente, strumenti software come ZoomQuant Viper 13 e 14, nonché pacchetti software commerciali quali come Bioworks Xpress (Thermo Fisher Scientific) e Mascot Distiller quantificazione Toolbox (Matrix Science) può deconvolute 18 O-tipo di dati 15,16. 18 O-incorporazione rapporti sono espressi come i contributi relativi delle singole specie isotopi peptide (cioè, peptidi contenenti almeno il 16 O, 18 O 18 O 1 o 2) per la busta isotopica. </li><li> Per ogni esperimento TimeCourse, le masse molecolari ([M + H] +) per tutte le specie peptidiche rilevati vengono estratti dai file di dati associati MS ed i valori categorizzata in una larghezza 100 ppm di massa. </li><li> Lat almeno tre [M + H] + sono impostati per essere tenuti a compilare un bidone. Nel caso di supporti noti, l&#39;elenco bin filtrato viene confrontato con l&#39;elenco dei prodotti di scissione proteolitica previsto dalla sequenza di peptide substrato utilizzando lo strumento ExPASy FindPept 17 ( <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) e 200 ppm di massa tolleranza di errore di accettazione. </li><li> MS / MS sono acquisiti per tutti i valori di massa dei prodotti di scissione previsti dallo strumento FindPept e per valori bin che hanno 18 O-incorporazioni essi associati. MS / MS dati sono stati acquisiti in MALDI 4800 TOF / TOF Analyzer in modalità riflettore 1 kV ione positivo, con una intensità del laser fissa di 4200 e CID-gas in modalità off. 50 scatti vengono acquisiti in un modello randomizzato per ogni sub-spettri fino a un totale di 40 sotto-spettri per spot (producendo un totale di 2.000 scatti / spot). </li><li> MS / MS i file di dati (. T2D file) sono esportati dalla Serie 4000 Explorer software di acquisizione dati e importati nella nostra in-house sistema di laboratorio informazione, i picchi vengono rilevati e MS / MS liste di punta sono associati con i corrispondenti dati raggruppate MS. </li><li> Per l&#39;identificazione peptide, MS / MS liste di picco sono confrontati con il database SwissProt utilizzando il motore di ricerca MASCOT con i seguenti parametri di ricerca: nessuna specificità dell&#39;enzima, 150 ppm di ione precursore e 0,2 Da frammento tolleranze di massa di ioni. </li><li> Identificazioni peptidi possono inoltre essere convalidati utilizzando il software Data Explorer (AB SCIEX) confermando le caratteristiche 18 O-incorporazione modelli in tutto y serie frammenti ionici come descritto da Shevchenko et al. 18. </li></ol> C. Preparazione del Tempo spettrale e 18 O-incorporazione Personaggi Grafici spettrali tempo: MS file di dati (. T2D file) per ogni punto il tempo di reazione vengono esportati dal software Data Explorer come ASCII-file utilizzando unmacro e importato in un programma di analisi dei dati e software di grafica (ad esempio origine OriginLab) e visualizzati come grafici a cascata (Figura 3). 18 O-incorporazione piazzole: Per ogni prodotto peptide cestinate scissione, dei contributi delle singole specie isotopi peptide (16 O 18 O 18 O 1 o 2) vengono estratti attraverso punti di tutti i tempi di reazione e funzione del tempo (Figura 4).

<ol><li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li>
<li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li>
<li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li>
<li>Fenselau, C., Yao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18O2-labeling+in+quantitative+proteomic+strategies%3A+a+status+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).</li>
<li>Miyagi, M., Rao, K. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+18O-labeling+strategies+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics.</a> Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).</li>
<li>Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18O+stable+isotope+labeling+in+MS-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct.+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">18O stable isotope labeling in MS-based proteomics.</a> Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).</li>
<li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics%3A+a+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).</li>
<li>Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+proteolytic+18O+labeling%3A+endoprotease-catalyzed+16O-to-18O+exchange+of+truncated+peptide+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates.</a> Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).</li>
<li>Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry-based+strategy+for+detecting+and+characterizing+endogenous+proteinase+activities+in+complex+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples.</a> Proteomics. 8, 435-445 (2008).</li>
<li>Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+endothelin-converting+enzyme-1%3A+a+regulator+of+beta-arrestin-dependent+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).</li>
<li>Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin+cleavage+site-specificity+of+the+Plasmodium+falciparum+cysteine+proteases+falcipain-2+and+falcipain-3%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3.</a> PLoS ONE. 4, e5156(2009).</li>
<li>Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+automatically+interpreting+mass+spectra+of+18O-labeled+isotopic+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).</li>
<li>Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+and+identification+using+18O+labeling+with+an+ion+trap+mass+spectrometer+and+the+analysis+software+application+%22ZoomQuant%26quot%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant&quot.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).</li>
<li>Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-catalyzed+oxygen-18+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics.</a> Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).</li>
<li>Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+computing+%2818%29O%2F%2816%29O+ratios+of+differentially+stable-isotope+labeled+peptides+in+the+context+of+postdigestion+%2818%29O+exchange%2Flabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling.</a> Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).</li>
<li>Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveying+proteolytic+processes+in+human+cancer+microenvironments+by+microdialysis+and+activity-based+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry.</a> Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).</li>
<li>Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FindPept%2C+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).</li>
<li>Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+%27de+novo%27+peptide+sequencing+by+a+combination+of+nanoelectrospray%2C+isotopic+labeling+and+a+quadrupole%2Ftime-of-flight+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).</li>
<li>Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li>
<li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li>
<li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Combinando etichettatura isotopo stabile e ad alta risoluzione spettrometria di massa in un tempo risolto modo, il paleo-TimeCourse metodo permette una analisi dinamica della generazione di prodotti peptidici. Il saggio può essere utilizzato per generare peptidi marcati con isotopi stabili per quantitativi e qualitativi studi di proteomica e di valutare la cinetica con cui vengono generati peptidi proteotypic. Inoltre, Paleo-TimeCourse è progettato per valutare percorsi proteolitici sotto specifica, fisiologicamente ril...

<table border="1"><tbody><tr><td> Denominazione del prodotto </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Colonne PepClean C-18 Spin </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 MALDI obiettivo piastra </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Materiali <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Alfa ciano-4-idrossicinnamico acido </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Ditiotreitolo (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Iodoacetamide (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> L&#39;endotelina-1 enzima di conversione (ECE-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Tripsina Oro </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Acqua-18 O, 97% atomo 18 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> Acido trifluoroacetico (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> Messa Kit standard per la calibrazione di AB SCIEX TOF / TOF strumenti </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti

flussi di lavoro di etichettatura della proteasi e catalizzata da acidi impiegando<sup&gt; 18</sup&gt; o arricchita di acqua

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Isotopi stabili sono strumenti essenziali in spettrometria di massa biologica. Storicamente, 18 O-isotopi stabili sono stati ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi catalitici di enzimi proteolitici 1-3. Con l&#39;avvento di spettrometria di massa a base di proteomica, la enzimaticamente catalizzata incorporazione di 18 atomi di O-da stabile l&#39;acqua arricchita con isotopi è diventato un metodo popolare per confrontare quantitativamente i livelli di espressione di proteine ​​(recensione da Fenselau e Yao 4, Miyagi e Rao 5 e Ye et al. 6). 18 O-etichettatura costituisce un&#39;alternativa semplice ea basso costo per chimica (ad esempio iTRAQ, ICAT) e metaboliche (es. SILAC) tecniche di etichettatura 7. A seconda della proteasi utilizzato, 18 O-etichettatura può provocare l&#39;incorporazione di fino a due atomi di O-18 nel C-terminale gruppo carbossilico del prodotto di scissione 3 </sup&gt;. La reazione di marcatura può essere suddiviso in due processi indipendenti, la scissione del legame peptidico e il carbossile reazione di scambio di ossigeno 8. Nel nostro Paleo (p rotease-a ssisted e Abeling l mploying 18 O arricchita di acqua) l&#39;adeguamento delle enzimatica 18 O-etichettatura, abbiamo utilizzato il 50% 18 O arricchita di acqua per ottenere le firme isotopiche distintive. In combinazione con alta risoluzione matrix-assisted laser ionizzazione desorbimento tempo di volo spettrometria di massa tandem (MALDI-TOF/TOF MS / MS), le buste isotopici caratteristici possono essere utilizzati per identificare prodotti di taglio con un elevato grado di specificità. Abbiamo in precedenza hanno usato il Paleo-metodologia per individuare e caratterizzare proteasi endogene 9 e monitorare le reazioni proteolitici 10-11. Poiché Paleo codifica l&#39;essenza stessa della reazione taglio proteolitico, la configurazione sperimentale è enri semplice e biochimichepassi chment di prodotti di dissociazione può essere aggirato. Il Paleo-metodo può essere facilmente esteso per esperimenti di tempo (i) del corso che controllano la dinamica delle reazioni taglio proteolitico e (ii) l&#39;analisi della proteolisi in campioni biologici complessi che rappresentano le condizioni fisiologiche. Paleo-TimeCourse esperimenti di aiuto per identificare il tasso di limitazione fasi di lavorazione e prodotti intermedi di reazione in complesse reazioni pathway proteolitici. Inoltre, il paleo-reazione ci permette di identificare enzimi proteolitici come la tripsina serina proteasi che è in grado di associare nuovamente i suoi prodotti di scissione e catalizzare l&#39;incorporazione di un secondo 18 O-atomo. Tali &quot;doppio&quot; etichettatura enzimi possono essere usati per postdigestion 18 O-etichettatura, in cui i peptidi sono etichettati esclusivamente dalla reazione carbossile scambio di ossigeno. La terza strategia si estende l&#39;etichettatura impiegando 18 O arricchita di acqua al di là degli enzimi e utilizza condizioni di pH acido per introdurre 18 O-stabile segno isotopoture in peptidi.

Abbiamo usato il Paleo-TimeCourse flusso di lavoro per monitorare in modo dinamico l&#39;incorporazione di 18 O-isotopi stabili in prodotti di dissociazione peptidici generati dagli enzimi proteolitici. L&#39;approccio presentato è uno strumento versatile per studiare comparativamente percorsi di elaborazione proteolitici per substrati diversi e combinazioni di proteasi. Campionando reazioni proteolitici ripetutamente nel corso della reazione, il paleo-TimeCourse esperimento fornisce istantanee risolta nel te...

Isotopi stabili flussi di lavoro in materia di etichettatura che impiegano<sup&gt; 18</sup&gt; O-acqua arricchita (Leo-flussi di lavoro) sono strumenti versatili per quantitativi e qualitativi studi di proteomica. In flussi di lavoro proteasi assistite (Paleo),<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomi sono introdotti da scissione proteolitica e carbossilici reazioni di scambio dell&#39;ossigeno mediata da proteasi. Nel acido-catalizzata (Aleo) del flusso di lavoro,<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomi sono introdotti da scambio di ossigeno carbossile a pH basso.

Flussi di lavoro di etichettatura della proteasi e catalizzata da acidi Impiegando<sup&gt; 18</sup&gt; O arricchita di acqua

Gli isotopi stabili sono strumenti essenziali nella spettrometria di massa biologica. Storicamente, gli isotopi stabili dell'18O sono stati ampiamente utilizzati per studiare la catalisi...

Questa presentazione illustra i flussi di lavoro per la marcatura isotopica stabile di digesti proteici e peptidi sintetici mediante acqua arricchita con ossigeno 18, utilizzata inizialmente nell'esperimento cronologico paleoproteomico catalizzato da proteasi, in cui il substrato e la proteasi vengono incubati in presenza di acqua arricchita al 50% con ossigeno 18 per incorporare atomi di ossigeno-18. Successivamente, se la proteasi è in grado di una doppia marcatura, ripetere l'incubazione dei prodotti derivanti dal taglio post-digestione con la proteasi di interesse in presenza di acqua arricchita al 50% con ossigeno 18.Il flusso di lavoro EO esegue l'incorporazione catalizzata da acido di atomi di ossigeno 18 in gruppi funzionali a intervalli temporali definiti. Aliquote prelevate a intervalli regolari dalle miscele di reazione, depositate con matrice su piastre target sporche, durante l'acquisizione dei dati spettrometrici di massa generano grafici spettrali nel tempo delle reazioni di scissione dei peptidi, nonché grafici di incorporazione dell'ossigeno 18 per singole specie peptidiche. I prodotti di scissione marcati selezionati vengono sottoposti a identificazione sequenzial

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Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono proteine ​​multidominio che codificano sia GTPase e domini di chinasi e che sono fosforilata nelle cellule. Qui vi presentiamo un protocollo per etichettare LRRK1 e LRRK2 in cellule con 32 P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i loro livelli complessivi di fosforilazione cellulare.

Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

Etichettatura isotopi stabili di peptidi da dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un rapido strategia economica per proteomica accurate di massa a base di spettrometria-quantitativi. Qui mostriamo un metodo efficace per la preparazione e l'analisi di miscele proteiche che utilizzano l'approccio Redi che può essere applicato a quasi qualsiasi tipo di campione.

La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling

DNA e proteine ​​sono la sequenza-specifica etichettati con affinità o gruppi reporter fluorescente con DNA o proteine ​​metiltransferasi e analoghi cofattore sintetici. A seconda della specificità cofattore di enzimi, aziridina o doppi analoghi cofattore attivati ​​sono impiegati per l'etichettatura di uno o due step.

Specifici Sequenza Etichettatura degli acidi nucleici e proteine ​​con metiltransferasi e cofattore Analoghi

Qui, presentiamo un protocollo per introdurre sonde chimiche sito-specifiche in un frammento di anticorpo incorporando geneticamente un amminoacido contenente azide, e successivamente accoppiando l'azide con una sonda chimica mediante cicloaddizione azide-alchino promossa dal ceppo (SPAAC).

Efficiente e anticorpi etichettatura per cicloaddizione azide-alchino Strain-promosso site-specific

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Maggiore Campione Multiplexing dei tessuti utilizzando combinata Precursore isotopica etichettatura e isobarica Tagging (CPilot)

Questo protocollo descrive una procedura sperimentale per in modo completo e quantitativamente studiare il metabolismo di più fonti di nutrienti. Questo flusso di lavoro, basato su una combinazione di tracciante isotopico esperimenti e una procedura analitica, permette il destino dei nutrienti consumati e l'origine metabolica delle molecole sintetizzate da microrganismi deve essere determinato.

Flusso di lavoro basato sulla combinazione di tracciante isotopico esperimenti per studiare il metabolismo microbico di più fonti di nutrienti

Qui, presentiamo un protocollo per valutare l'omogeneità d'etichettatura per ogni specie di proteine in un campione di proteina complessa a livello di singola molecola.

Quantificazione di tutto il proteoma di etichettatura omogeneità a livello di singola molecola

L'uso di uracil tiolato per purificare in modo sensibile e specifico l'RNA appena trascritto dal lievito Saccharomyces cerevisiae.

Etichettatura metabolica estremamente rapida e specifica dell'RNA In Vivo con 4-Thiouracil (Ers4tU)

L'ossidazione del tiolo proteico ha implicazioni significative in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche normali. Descriviamo i dettagli di un metodo di proteomica redox quantitativa, che utilizza la cattura assistita da resina, la marcatura isobarica e la spettrometria di massa, consentendo l'identificazione sito-specifica e la quantificazione dei residui di cisteina ossidati in modo reversibile delle proteine.

Cattura assistita da resina accoppiata con etichettatura isobarica Tandem Mass Tag per la quantificazione multiplexata dell'ossidazione del tiolo proteico

La capacità di misurare la cinetica di rilascio delle vescicole può contribuire a fornire indicazioni in alcuni dei principi fondamentali della neurotrasmissione. Qui abbiamo usato imaging in tempo reale delle vescicole etichettati con il colorante rosso fluorescente FM 4-64 per misurare la velocità di rilascio delle vescicole presinaptiche in culture neuronali dell'ippocampo.

Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM

Scopri i flussi di lavoro per l'etichettatura con isotopi stabili di digeriti proteici e peptidi sintetici utilizzando acqua arricchita con 18O. Questi metodi combinano workflow assistiti da proteasi e catalizzati da acidi per studi proteomici quantitativi e qualitativi.

Flussi di lavoro di etichettatura della proteasi e catalizzata da acidi Impiegando

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