Isolamento e analisi del genoma di virioni singole utilizzando "Genomica singolo virus '

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di isolare singole variane da un consorzio misto e di sequenziare il materiale genomico ottenuto per identificare virus da una varietà di ambienti senza necessità di coltivazione. Ciò si ottiene isolando prima le singole variane utilizzando la selezione citometrica del flusso su perle di aro. La cattura di un singolo ione viene quindi convalidata mediante microscopia confocale.

Successivamente, il materiale genomico viene isolato dagli ioni e amplificato utilizzando l'amplificazione a spostamento multiplo o MDA per generare la quantità di DNA necessaria per il sequenziamento. Infine, il DNA virale viene sequenziato utilizzando tecnologie ad alto rendimento per generare una copertura in eccesso del genoma del virione, aiutando sostanzialmente l'assemblaggio e l'annotazione del genoma. In definitiva, le tecniche bioinformatiche volte a utilizzare approcci di sottocampionamento di sequenze per aumentare le dimensioni della con, consentono l'analisi di von isolati.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ecologia virale fornendo un contesto genomico al vasto pool di geni del plancton OC annotati, oltre a consentire la scoperta di nuovi genomi da vari ecosistemi. In generale, gli individui che sono nuovi a questo metodo possono avere difficoltà perché l'amplificazione e l'isolamento di singoli ioni stanno spingendo i limiti della tecnologia attuale. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo valutando l'uso di MDA sulle comunità di plancton Vero e ci siamo resi conto che era possibile selezionare una singola particella virale e sequenziare e quindi assemblare un genoma virale completo da queste comunità complesse Per selezionare i virus utilizzando un citometro a flusso dotato di tubi fotomoltiplicatori a dispersione diretta personalizzati o F-S-C-P-M-T iniziare diluendo le particelle virali in tris filtrato da 0,1 micron, L'EDTA per un assemblaggio misto contenente particelle di fago T quattro e lambda imposta F-S-C-P-M-T a 1000 e SSC a 200 per massimizzare il rapporto segnale/rumore.

Dopo aver eseguito i campioni di controllo, eseguire circa 100 microlitri della sospensione virale sostenuta per un totale di 5.000 eventi. Quindi usa quello verde cibernetico e i grafici F-S-C-P-M-T per posizionare un cancello stretto al centro delle particelle virali. Ora aggiungere cinque microlitri di aros a basso punto di fusione all'1% in tampone TBE raffreddato a 37 gradi Celsius a ciascun pozzetto su un vetrino da microscopio A-P-T-F-E e quindi caricare il vetrino nel citometro a flusso per catturare le particelle virali selezionate.

Iniziare lo smistamento, catturando 10 o più eventi di particelle virali in alcuni pozzetti per facilitare il rilevamento della profondità dei virus durante la microscopia a scansione laser confocale. Al termine dello smistamento, rimuovere il vetrino dal citometro a flusso e aggiungere altri cinque microlitri di aros a basso punto di fusione raffreddati a 37 gradi Celsius in ciascun pozzetto. Incorporamento delle particelle virali per una singola variazione.

Impostare il microscopio a scansione laser confocale su 488 nanometri. L'eccitazione quindi visualizza le particelle incorporate utilizzando un obiettivo a lunga distanza di lavoro 63 x per verificare che sia presente una sola particella e che non siano impilati più virus l'uno sull'altro. Quindi, una volta identificati i pozzetti con singoli virus, utilizzare una lama di rasoio per rimuovere le perle di agros desiderate dal vetrino e posizionarle in una provetta PCR sterile.

Posizionare la provetta nel blocco termico di un termociclatore impostato a 94 gradi Celsius per tre minuti per eliminare la particella virale in situ. Quindi, dopo aver eseguito un MDA modificato, trasferire il DNA genomico in provette da 1,7 millilitri e aggiungere un decimo volume di acetato di sodio a tre molari in tampone TBE Per purificare il materiale genomico amplificato, posizionare i campioni a 55 gradi Celsius per 10 minuti per sciogliere l'aros e quindi spostare le provette a 42 gradi Celsius per ridurre la temperatura prima di aggiungere l'enzima. Ora aggiungi due unità di beta aasi a ciascuna provetta e incuba le provette per due ore.

Quindi aggiungere un volume di una soluzione tampone di fenolo saturo a ciascuna provetta. Mescolare energicamente e centrifugare le provette per 15 minuti a 3.500 volte G.At temperatura ambiente, trasferire il DNA contenente SURNATANTI in una nuova provetta da 1,7 millilitri. Quindi, aggiungere un volume di isopropanolo al 100% e un microlitro di glico blu alle provette e capovolgere le provette per mescolarle dopo aver centrifugato nuovamente le provette.

Questa volta per 60 minuti a 28.000 volte G e quattro gradi Celsius. Decantare l'isopropanolo, facendo attenzione a non disturbare il pellet e aggiungere 150 microlitri di etanolo al 70% in ogni tubo. Far girare i tubi per 10 minuti a 28.000 volte.

G a temperatura ambiente. Decantare l'etanolo all'aria, il pellet di DNA e risospendere il DNA in un volume appropriato di tampone tris EDTA. Questa ricostruzione tridimensionale di una particella virale colorata di colore verde cibernetico all'interno di una velocità agro dimostra come la microscopia laser confocale possa essere utilizzata per visualizzare e confermare che un singolo virione viene ottenuto in ciascun pozzetto dopo essere stato catturato e incorporato in aros, il riquadro mostra un ingrandimento maggiore della particella virale isolata.

Qui viene mostrato un grafico di profilo della fluorescenza relativa della singola particella virale colorata all'interno di una perlina di aros. Questa serie finale di dati mostra come quasi l'intero genoma di Lambda, ad eccezione delle prime cinque coppie di basi, sia stato recuperato per questo virus rappresentativo. Ecco il grafico GC per il singolo virus.

Viene mostrato il genoma identificato. Questa figura mostra la mappa del genoma di lambda. Infine, viene mostrata la mappatura di un singolo genoma virale per il batterio rappresentativo isolato e amplificato fago lambda.

L'asse X mostra la posizione del genoma. L'asse Y mostra la percentuale di copertura. Quando si tenta questa procedura, è importante utilizzare una tecnica sterile e prendersi il tempo necessario per evitare la contaminazione.

Seguendo questa procedura, possono essere utilizzati altri metodi per valutare la tassonomia delle variane isolate prima del sequenziamento dell'intero genoma. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come isolare singole variane utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, la microscopia confocale e l'amplificazione dell'intero genoma.