Isolamento e analisi del genoma di virioni singole utilizzando "Genomica singolo virus '

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare singoli virioni da una consorteria mista e sequenziare il materiale genetico ottenuto per identificare virus provenienti da diversi ambienti, senza la necessità di coltivazione. Questo viene realizzato isolando innanzitutto i singoli virioni mediante ordinamento citofluorimetrico su microsfere di agarosio. L'acquisizione di singoli virioni viene quindi convalidata mediante microscopia confocale.

Successivamente, il materiale genetico viene isolato dai virioni e amplificato mediante amplificazione a spostamento multiplo o MDA per generare la quantità di DNA necessaria per il sequenziamento. Infine, il DNA virale viene sequenziato utilizzando tecnologie ad alto rendimento per ottenere una copertura eccessiva del genoma del virione, facilitando in modo significativo l'assemblaggio e l'annotazione del genoma. In definitiva, tecniche bioinformatiche basate su approcci di sottocampionamento delle sequenze per aumentare la dimensione dei contig permettono l'analisi dei virioni isolati.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ecologia virale fornendo un contesto genomico all'ampio insieme di geni del virioplancton non annotati, oltre a permettere la scoperta di nuovi genomi provenienti da diversi ecosistemi. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché l'amplificazione e l'isolamento di singoli virioni rappresentano una sfida ai limiti delle attuali tecnologie. Abbiamo concepito per la prima volta questo metodo mentre stavamo valutando l'utilizzo della MDA su comunità di virioplancton, rendendoci conto che era possibile separare una singola particella virale e sequenziarla, assemblando così un genoma virale completo a partire da queste comunità complesse. Per separare i virus mediante un citometro a flusso dotato di fotomoltiplicatori personalizzati per lo scattering in avanti (FSCPMT), iniziare diluendo le particelle virali in soluzione di tris-EDTA filtrata su filtro da 0,1 micron. Per un campione misto contenente particelle fagiche T4 e lambda, impostare l'FSCPMT su 1000 e l'SSC su 200 per massimizzare il rapporto segnale-rumore.

Dopo aver eseguito i campioni di controllo, analizzare circa 100 microlitri della sospensione virale colorata fino a un totale di 5.000 eventi. Successivamente, utilizzare i grafici SYBR Green One e FSC-PMT per posizionare un gate stretto al centro delle particelle virali. Aggiungere quindi cinque microlitri di agarosio a basso punto di fusione all'1% in tampone TBE raffreddato a 37 gradi Celsius in ogni pozzetto del vetrino microscopico in P-T-F-E e inserire il vetrino nel citometro a flusso per catturare le particelle virali ordinate.

Iniziare il sorting, acquisendo 10 o più eventi di particelle virali in alcune delle pozzette per facilitare il rilevamento della profondità dei virus durante la microscopia a scansione laser confocale. Al termine del sorting, rimuovere la lamella dal citometro a flusso e aggiungere altre cinque microlitri di agarosio a basso punto di fusione raffreddato a 37 gradi Celsius in ciascuna pozzetta, incorporando così le particelle virali. Per i singoli virioni, impostare il microscopio a scansione laser confocale su un'eccitazione di 488 nanometri. Successivamente, acquisire immagini delle particelle incorporate utilizzando un obiettivo con lunga distanza di lavoro 63x per verificare la presenza di un singolo virione e assicurarsi che più virus non siano sovrapposti. Una volta identificate le pozzette contenenti singoli virus, utilizzare una lametta per rimuovere le perle di agarosio desiderate dalla lamella e posizionarle in una provetta PCR sterile.

Posizionare il tubo nel blocco riscaldante di un termociclatore impostato a 94 gradi Celsius per tre minuti al fine di lisare in situ la particella virale. Successivamente, dopo aver eseguito una MDA modificata, trasferire il DNA genomico in tubi Eppendorf da 1,7 millilitro e aggiungere un decimo del volume di acetato di sodio 3 molare in tampone TBE per purificare il materiale genico amplificato. Mantenere i campioni a 55 gradi Celsius per 10 minuti per sciogliere l'agarosio, quindi spostare i tubi a 42 gradi Celsius per ridurre la temperatura prima di aggiungere l'enzima. Aggiungere ora due unità di Beta-agarasi a ciascun tubo e incubare i tubi per due ore.

Quindi aggiungere a ogni provetta un volume di soluzione fenolica satura tamponata. Mescolare vigorosamente e centrifugare le provette per 15 minuti a 3.500 ×g a temperatura ambiente. Trasferire i soprannatanti contenenti il DNA in una nuova provetta Eppendorf da 1,7 millilitro. Successivamente, aggiungere a ogni provetta un volume di isopropanolo al 100% e un microlitro di glyco-blue e capovolgere le provette per mescolare. Dopo aver centrifugato nuovamente le provette, questa volta per 60 minuti a 28.000 ×g e a quattro gradi Celsius, decantare l’isopropanolo, avendo cura di non disturbare il pellet, e aggiungere 150 microlitri di etanolo al 70% a ogni provetta. Centrifugare le provette per 10 minuti a 28.000 ×g a temperatura ambiente. Decantare l’etanolo, lasciare asciugare all’aria il pellet di DNA e risospendere il DNA in un volume appropriato di tampone tris-EDTA. Questa ricostruzione tridimensionale di una particella virale colorata con sybr green, una, all’interno di un granello di agarosio dimostra come la microscopia confocale a laser possa essere utilizzata per visualizzare e confermare che un singolo virione viene ottenuto in ogni pozzetto dopo essere stato catturato e incorporato nell’agarosio; l’ingrandimento mostra un’ulteriore amplificazione della particella virale isolata.

Qui viene mostrato un grafico del profilo della fluorescenza relativa della singola particella virale marcata all'interno di una perla di agarosio. Questa serie finale di figure mostra come quasi l'intero genoma di Lambda, ad eccezione delle prime cinque coppie di basi, sia stato recuperato per questo virus rappresentativo. Qui viene mostrato il grafico GC per il genoma virale singolo identificato. Questa figura mostra la mappa del genoma di lambda. Infine, viene mostrata la mappatura del genoma di un singolo virus per il batteriofago lambda isolato e amplificato in modo rappresentativo. L'asse X mostra la posizione nel genoma. L'asse Y mostra la percentuale di copertura.

Quando si tenta questa procedura, è importante utilizzare una tecnica sterile e prendersi il tempo necessario per garantire che venga evitata la contaminazione. Dopo aver eseguito questa procedura, possono essere utilizzati altri metodi per valutare la tassonomia dei virioni isolati prima del sequenziamento dell'intero genoma. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona idea su come isolare singoli virioni utilizzando la citometria a flusso attivata da fluorescenza, la microscopia confocale e l'amplificazione dell'intero genoma.