Imaging bioluminescenza di attività NADPH ossidasi in diversi modelli animali

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un approccio minimamente invasivo per il monitoraggio in tempo reale della generazione di specie reattive dell'ossigeno, o ROS, derivanti dalla N-A-D-P-H ossidasi in tre diversi modelli murini infiammatori. Il primo modello è l'amministrazione intratracheale di Xan, in cui la molecola pro-infiammatoria Xan viene iniettata nella trachea di topi anestetizzati. Xan è un prodotto derivato dalla parete cellulare fungina che può attivare la N-A-D-P-H ossidasi.

Il secondo modello è la legatura e puntura, o CLP. In questo caso, l'addome del topo viene aperto e il cieco viene legato con un filo di seta e quindi punzecchiato mediante un ago per indurre sepsi intra-addominale e infiammazione polmonare acuta secondaria con danno tissutale. Il terzo modello consiste nell'amministrazione di tetracloruro di carbonio mediante sondino orale.

Il tetracloruro di carbonio provoca necrosi epatocellulare e può essere utilizzato per modellare sia il danno epatico acuto che la fibrosi epatica. L'imaging bioluminescente viene eseguito su topi modello per valutare la produzione di ROS. I dati ottenuti indicano che l'ossidasi N-A-D-P-H è la principale fonte di generazione di ROS in risposta a stimoli infiammatori.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, ad esempio la sonda di Florence, è che questo metodo fornisce un approccio minimamente invasivo per il monitoraggio in tempo reale della generazione di RS durante l'infiammazione in vivo. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali sull'infiammazione e sul danno post-infezione, come il ruolo delle RS nell'infiammazione e nel danno polmonare. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo iniziato a studiare il ruolo delle specie reattive dell'ossigeno nella difesa dell'ospite per tutti e tre i modelli animali di generazione di ROS mostrati in questo video.

Utilizzare topi nulli per P 47 Fox e topi C 57 BL sei DBA con età e sesso abbinati. Ottenere l'approvazione per gli esperimenti dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali in preparazione all'amministrazione intratracheale di xin. Sterilizzare la piattaforma chirurgica con etanolo al 70% e coprirla con un pad sterile.

L'intervento chirurgico deve essere eseguito indossando una camice chirurgico pulito, guanti, mascherina e utilizzando strumenti sterili per l'anestesia. Riempire il vaporizzatore di un sistema di somministrazione continua di isoflurano con il 2-3% di isoflurano e accenderlo. Successivamente, posizionare i topi nella camera anestetica dopo due o tre minuti, verificando che siano completamente anestetizzati mediante un test di pizzicamento della zampa e osservando la respirazione e i movimenti.

La frequenza respiratoria dovrebbe essere ridotta di circa il 50%. Successivamente, utilizzando un rasoio elettrico, rasare la zona dell'incisione sulla parte anteriore del collo del topo. Posizionare il topo sulla piattaforma chirurgica in posizione supina e posizionare un cono nasale per mantenere l'anestesia. Applicare alternativamente Betadine ed etanolo al 70% sul collo per tre volte.

Successivamente, utilizzando forbici dritte e affilate, tagliare la cute del collo anteriore di circa 0,5 centimetri. Poi, con pinze curve, dissezionare il muscolo intorno alla trachea per esporla e somministrare Xan per via intratracheale. Utilizzare una siringa dotata di un ago da 27 gauge per perforare la trachea nella parte centrale tra gli anelli cartilaginei.

Quindi dirigere l'ago anteriormente e iniettare lentamente un microgrammo per grammo di peso corporeo di Xan. Chiudere l'incisione con cinque punti di sutura in nylon sterile a calibro 5 dopo l'intervento. Posizionare il topo in una gabbia di recupero rivestita con carta piatta e collocare metà della gabbia di recupero su un tappetino riscaldante.

Monitorare i topi fino a quando non sono svegli e si muovono liberamente. Per eseguire una legatura e puntura seca, rasare l'addome di un topo anestetizzato con un rasoio elettrico e posizionare il topo su una piattaforma chirurgica in posizione supina. Quindi disinfettare l'area chirurgica con Betadine ed etanolo al 70%.

Come in precedenza utilizzando un bisturi, praticare un'incisione di 1,5 centimetri nella cute della linea mediana addominale utilizzando forbici. Tagliare il peritoneo e aprire la cavità addominale con un retrattore per localizzare ed esporre il cieco, che si trova sul lato sinistro della cavità addominale. Utilizzando pinze non schiaccianti, esteriorizzare.

Quindi legare il 50% distale del secum esposto con quattro punti di sutura in seta. Utilizzare un ago da 21 gauge per praticare una puntura nel secum a valle della legatura. Riposizionare il secum nell'addome.

Chiudere la parete addominale con quattro punti di sutura in nylon sterile in O. Quindi chiudere l'incisione con cinque punti di sutura in nylon sterile. Somministrare 0,5 millilitri di soluzione salina con 2,5 microgrammi di buprenorfina per via sottocutanea ed effettuare l'osservazione postoperatoria come in precedenza.

Il tetracloruro di carbonio orale è un modello di danno epatico dipendente dalle specie reattive dell'ossigeno. Per somministrare il tetracloruro di carbonio mediante gavaggio orale, afferrare il topo per la nuca e anestetizzarlo, mantenendo la testa allineata verticalmente con l'esofago. Inserire quindi la punta di un ago da 22 gauge, contenente tetracloruro di carbonio, dietro gli incisivi, indirizzandolo verso la parte posteriore della gola e lungo l'esofago, quindi premere lo stantuffo per somministrare il tetracloruro di carbonio. Monitorare il recupero del topo come in precedenza; le immagini bioluminescenti devono essere acquisite prima e a 4 e 20 ore dopo l'induzione della produzione di ROS.

Per fare ciò, aprire il software Live Image 4.2. Successivamente, inizializzare il sistema di imaging ivus 200. Fare clic su Inizializza e impostare il sistema sulla modalità luminescenza.

Attendere il blocco della temperatura del dispositivo a accoppiamento di carica, che verrà indicato sullo schermo nel software. Impostare il tempo di esposizione a 40 secondi. Quindi impostare il Benning su medio e il diaframma su un ottavo.

Posizionare un topo anestetizzato nella camera di imaging con il supporto a temperatura controllata e metterlo in posizione supina. Posizionare un cono nasale per somministrare l'anestesia come in precedenza due minuti prima di ogni acquisizione dell'immagine. Utilizzare una siringa da un millilitro con un ago da 27 gauge per somministrare 50 microlitri del derivato luminale L 0 1 2 per via endovenosa.

Eseguire un'iniezione retroorbitale. Infine, acquisire le immagini e analizzarle come descritto. Nella sezione successiva del video, analizzare i dati raccolti utilizzando il software Living Image versione 4.2 nel software.

Aprire un'immagine e fare clic sugli strumenti ROI nella tavolozza degli strumenti. Successivamente, nel menu degli strumenti ROI, selezionare la forma dell'ROI e fare clic sul cerchio nell'elenco a discesa. Selezionare il numero di ROI che verranno aggiunti all'immagine.

Regolare la posizione della ROI sul torace e/o sull'addome per quantificare l'intensità del segnale o il flusso di fotoni dalla regione di interesse nel menu degli strumenti ROI. Fare clic sul pulsante di misurazione per aprire la tabella delle misurazioni ROI, che visualizza i dati relativi a tutte le ROI create nelle immagini. Utilizzare un pacchetto software per l'analisi statistica per eseguire un'analisi a due vie a novo con test post hoc di Bonferroni nei singoli punti temporali al fine di confrontare la generazione di ROS nei polmoni di tipo selvatico e privi di ossidasi N-A-D-P-H.

Topi nulli per P 47 Fox dopo stimolazione con Xan. Xan è stata somministrata come descritto in questo video al basale, a quattro e a 24 ore. I topi sono stati sottoposti a imaging come mostrato qui.

Si è verificato un aumento significativo dell'emissione di fotoni a livello toracico nei topi di tipo selvaggio, ma non nei topi P 47. Fox sno, a quattro ore e a 24 ore rispetto ai valori basali. Questo suggerisce che la N-A-D-P-H ossidasi sia la principale fonte di generazione di ROS nei polmoni dopo l'amministrazione di XUS Sand.

In seguito, la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è stata valutata nel modello di sepsi indotta da CLP. La sepsi è un disturbo potenzialmente letale associato a lesioni d'organo terminale, inclusa lesione polmonare acuta e sindrome da distress respiratorio acuto. Il danno mediato da ROS è stato considerato un fattore importante che contribuisce alla disfunzione multiorgano indotta dalla sepsi.

Come mostrato in questo grafico, le ROS sono risultate significativamente aumentate a livello del torace quattro ore dopo il CLP e a livello dell'addome 24 ore dopo il CLP nei topi di tipo selvatico. Tuttavia, i livelli di ROS nei topi null per P 47 Fox erano simili ai livelli basali in entrambi i punti temporali. Questi risultati dimostrano che la generazione di ROS nel modello murino di sepsi indotta da CLP dipende dalla ossidasi N-A-D-P-H.

Infine, l'imaging bioluminescente è stato utilizzato per rilevare la produzione di ROS in un modello di danno epatico indotto da tetracloruro di carbonio. A differenza dei modelli di infiammazione e danno precedentemente descritti, la produzione di ROS nell'addome è aumentata moderatamente, di circa il 35% rispetto al valore basale, nei topi P 47, Fox null quattro ore dopo la somministrazione di tetracloruro di carbonio. Tuttavia, l'entità della generazione di ROS indotta dal tetracloruro di carbonio è risultata significativamente maggiore nei topi wildtype rispetto ai topi P 47, Fox null.

Questi dati indicano che sia la generazione di ROS dipendente sia quella indipendente dalla N-A-D-P-H ossidasi contenente P 47 Fox si verificano nel danno epatico acuto indotto da cloruro di carte. Il risultato dell'immagine bio-luminescente ha dimostrato un aumento del livello di ROS nei topi Wildtime rispetto ai P 47. L'analisi Knock Mized ha indicato che l'ossidasi DP H è una fonte principale di generazione di RS in risposta a uno stimolo infiammatorio.

Questo metodo fornisce un approccio minimamente invasivo per il monitoraggio in tempo reale della generazione di RS durante l'infiammazione in vivo.