Affinità Precipitazioni di Active Rho-GEFs Utilizzo di un GST-tagged Mutant proteina Rho (GST-RhoA (G17A)) da lisati di cellule epiteliali

L'obiettivo generale di questa procedura è seguire l'attivazione di RO, un fattore specifico di scambio G-D-P-G-T-P o gafs, in cellule in coltura, utilizzando una proteina fusione mutante RO A GST che presenta un'elevata affinità per gs attivato. Ciò viene ottenuto innanzitutto producendo la proteina mutante RO etichettata con GST in batteri. Successivamente, la proteina GST-RO A accoppiata a perline viene purificata.

Quindi, la purezza e la concentrazione della proteina GST RO A vengono valutate mediante elettroforesi SDS-PAGE. Infine, vengono preparati i lisati cellulari ed eseguito un saggio di precipitazione GEF con la proteina GST RO A. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano un aumento della precipitazione di GS attivata nelle cellule trattate, attraverso l'analisi western blot delle proteine precipitate con un anticorpo specifico anti-GF e la quantificazione mediante densitometria.

Questo metodo può contribuire a rispondere a numerose domande interessanti nel campo delle GTPS grezze, ad esempio in che modo i numerosi fattori di scambio G-D-P-G-T-P sono regolati in maniera specifica per ciascun segnale e come viene coordinata la loro attività? Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontra inizialmente delle difficoltà, poiché la proteina GST RO G 17 A è relativamente instabile e può degradarsi durante la preparazione. È inoltre fondamentale ricordare di eseguire rapidamente e in modo costante il saggio di precipitazione GF. A dimostrare questa procedura sarà Pfizer Vahid, uno studente magistrale del mio laboratorio, per la trasformazione di e coli.

Trasferire rapidamente un quarto di cellule competenti DH5α in un bagno di ghiaccio e aggiungere un microlitro di DNA PX row A G 17 A alla concentrazione di 25-50 nanogrammi per microlitro. Agitare delicatamente il tubo per mescolare e incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Sottoporre le cellule a shock termico a 42 gradi Celsius per 45 secondi, quindi riposizionarle sul ghiaccio per due minuti.

Aggiungere 900 microlitri di mezzo per calzini e coltivare per un'ora a 37 gradi Celsius con agitazione. Utilizzando una pipetta sterile piegata per pasta, distribuire da 50 a 100 microlitri dei batteri trasformati su una piastra in agar LB e persina preparata in precedenza. Incubare la piastra nel verso giusto in un incubatore a 37 gradi Celsius per cinque minuti, quindi capovolgerla e far crescere durante la notte.

Scegliere una colonia ben isolata di batteri trasformati e utilizzarla per inoculare 50 millilitri di LB con ampicillina. Far crescere per tutta la notte a 37 gradi SIU con agitazione. Quando la coltura ha raggiunto la massima densità, diluirla con 450 millilitri di LB con ampicillina e far crescere per ulteriori 30 minuti. A 37 gradi Celsius, indurre i batteri a produrre la proteina ricombinante aggiungendo 500 microlitri di IPTG 100 millimolare a una coltura di 500 millilitri.

Ridurre la temperatura a 22-24 gradi Celsius e coltivare per circa 16 ore. Centrifugare la coltura a 3.600 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Congelare i pellet per almeno un'ora o, preferibilmente, durante la notte a meno 80 gradi Celsius.

Dopo aver preparato 200 millilitri di buffer di lisi secondo quanto descritto nel protocollo scritto, preparare il buffer di lisi aggiuntivo aggiungendo a 10 millilitri di buffer 1 millimolare di DTT, 1 millimolare di PMSF e una compressa di inibitore delle proteasi, operando sul ghiaccio. Aggiungere 10 millilitri di buffer di lisi aggiuntivo ai pellet di Thor e sospenderli accuratamente mediante pipettaggio e vortex. Sonicare la sospensione sul ghiaccio per un minuto al livello quattro con impulso al 50%.

Centrifugare il lisato sonicato a 15.000-20.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il sonicato chiarificato in un tubo sterile da 15 millilitri con tappo. Preparare le perle di glutathione sferiche mescolando delicatamente la sospensione al 75% e utilizzando una punta larga per trasferire 335 microlitri in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di PBS freddo e centrifugare a 500 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Scartare il surnatante. Aggiungere un millilitro di tampone di lisi più ai microsfera e centrifugare nuovamente. Scartare nuovamente il surnatante e aggiungere il tampone di lisi.

Inoltre, per preparare una sospensione al 50%, combinare due aliquote da 50 microlitri di sospensione di perle equilibrate con il sopranatante preparato. Incubare a quattro gradi Celsius per 45 minuti. Preparare l'HBS più aggiungendo cloruro di magnesio 5 millimolare e DTT 1 millimolare a 100 millilitri di tampone HBS; centrifugare il sopranatante e le perle a 500 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Scartare il soprannadante e lavare le perle due volte con 10 millilitri di buffer di lisi più e due volte con 10 millilitri di HBS più. Dopo l'ultimo lavaggio, preparare un sospeso al 50% risospendendo le perle in HBS più integrato con inibitore delle proteasi. Diluire 10 microlitri della preparazione finale di perle con buffer campione due volte lam ly contenente beamr cap due etanolo.

Quindi preparare tre campioni standard di BSA mescolando rispettivamente 10 microlitri, 5 microlitri e 2,5 microlitri di una soluzione madre di BSA a 2 milligrammi per millilitro con 10 microlitri di buffer lammy.

Fare bollire i campioni per cinque minuti, quindi centrifugarli brevemente e caricarli tutti, insieme a un marcatore di peso molecolare, su un gel di poliacrilamide SDS al 10%. Dopo la colorazione, des il gel e stimare la GST row A G 17 A utilizzando gli standard di BSA come riferimento. Aliquotare un volume uguale di perline contenente circa da 10 a 15 microgrammi di proteina in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro. Per preparare il saggio di immunoprecipitazione a cascata (GF pull down), coltivare le cellule fino alla confluenza in piastre da 10 centimetri e privarle di siero per almeno tre ore prima del saggio.

Subito prima dell'inizio del saggio, preparare il buffer di lisi fresco con inibitori delle proteasi, lavorando sul ghiaccio. Rimuovere il mezzo di coltura dalle piastre e lavare con HBS freddo di ghiaccio.

Rimuovere tutto il HBS e aggiungere 700 microlitri di buffer di lisi plus a ogni piastra. Lasciare agire il buffer in modo da coprire tutte le aree.

Quindi raschiare e raccogliere i lisati in provette numerate da 1,5 millilitri. Centrifugare a 15.000 ×g per un minuto a quattro gradi Celsius. Conservare il sopranatante per il saggio; se il numero di cellule era equivalente in ogni piastra, prelevare 30 microlitri di ciascun sopranatante e mescolarli con 30 microlitri di buffer campione riducente 2×.

Quindi portare a ebollizione e mettere da parte su ghiaccio. Aggiungere i soprannatanti rimanenti a aliquote di perle GST row a G 17 A e ruotare per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Centrifugare le perle a 6.800 ×g per 10 secondi a quattro gradi Celsius.

Scartare il soprannadante e lavare le perle tre volte con buffer di lisi. Utilizzando una siringa da 1 ml dotata di ago da 30 gauge, rimuovere completamente l'ultimo lavaggio e aggiungere 20 microlitri di buffer campione riducente 2x. Portare a ebollizione i campioni per cinque minuti, centrifugare per far sedimentare le perle ed eseguire i lisati cellulari totali e i campioni proteici precipitati su un gel SDS-PAGE della percentuale appropriata in base alla dimensione della GF in studio.

Infine, eseguire un'analisi mediante western blot per rilevare l'attivazione del fattore di scambio GFH1, indicativa di un saggio GF riuscito. Qui viene mostrato il rilevamento dell'attivazione del fattore di scambio GFH1. La proteina A G17A cattura una certa quantità di GFH1 dai lisati cellulari di controllo, suggerendo che GFH1 possiede un'attività basale.

La quantità precipitata tuttavia è aumentata nelle cellule trattate con la citochina infiammatoria fattore di necrosi tumorale alfa, in accordo con l'ipotesi che TNF alfa attivi G FH uno. Importante, il lisato totale delle cellule mostra quantità simili di gfh uno nel campione di controllo e in quello trattato, suggerendo che il trattamento non ha alterato i livelli di G FH uno e che l'input utilizzato nel saggio era equivalente. Durante l'adattamento di questa procedura, è fondamentale mantenere la proteina GSE RO G 17 A e i CELLIS eights sul ghiaccio.

Eseguire rapidamente e in modo costante il saggio GF, utilizzando controlli positivi adeguati che consentano l'invalidazione e il troubleshooting.