Microfluidica Endothelialized per lo studio delle interazioni microvascolari nelle patologie ematologiche

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un dispositivo microfluidico rivestito con cellule endoteliali. Ciò si ottiene fabbricando prima lo stampo microfluidico. Il secondo passaggio consiste nel creare il canale PDMS.

Successivamente, le cellule endoteliali vengono seminate nel dispositivo. Il passaggio finale consiste nel coltivare le cellule all'interno del dispositivo. In definitiva, i dispositivi microfluidici rivestiti di cellule endoteliali vengono utilizzati per mostrare le interazioni cellula-cellula in vitro.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che fornisce al ricercatore controlli rigorosi sulle condizioni biologiche e biofisiche ed è compatibile con la microscopia a fluorescenza. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni biofisiche tra cellule cellulari nelle malattie ematologiche, può anche essere applicato a fenomeni come la biologia dei leucociti, le metastasi tumorali e la biologia delle cellule staminali ematopoietiche. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché le condizioni devono essere strettamente controllate per il successo dell'inserimento delle celle.

In preparazione per la fabbricazione, crea una maschera fotografica inviando un'immagine di progettazione assistita da computer del dispositivo Microfluid a un fornitore di maschere esterne. Una volta ricevuta, la maschera è composta da uno strato di cromo su vetro soda calcico. Qui la larghezza del canale microfluidico è di 30 micron.

Per iniziare la fabbricazione del dispositivo microfluidico, pulire un wafer di silicone nudo con piranha per 15 minuti, quindi risciacquare con acqua deionizzata per 10 secondi. Quindi immergere il wafer di silicone in acido fluoridrico per 30 secondi e risciacquare con acqua deionizzata per circa 10 secondi. Successivamente, utilizzando uno spin coter spin micro chem SU 8 20 25 photo resist sul wafer a un'altezza di 30 micron utilizzando una velocità di centrifuga di 3000 rotazioni al minuto.

Posizionare il wafer rivestito SU 8 20 25 su una piastra calda impostata a 95 gradi Celsius per cinque minuti per eliminare il solvente in eccesso. Si sconsiglia l'uso di un forno per questo passaggio. Ora, posiziona la maschera fotografica sopra il wafer ed esponi alla luce UV in un rivestimento della maschera per reticolare il fotoresist SU 8 20 25.

Dopo la reticolazione, riposizionare il wafer sulla piastra calda a 95 gradi Celsius per altri cinque minuti. Per accelerare ulteriormente la polimerizzazione del fotoresist SU 8 20 25. Quindi immergere il wafer nello sviluppatore SU otto, che è composto principalmente da P-G-M-E-A per quattro minuti.

In questo modo verrà rimossa la foto SU 8 20 25 non reticolata. Resistere. Sciacquare il wafer di nuova concezione con alcol isopropilico al 100% per 10 secondi, quindi asciugarlo utilizzando azoto pressurizzato o lasciando evaporare il solvente dal wafer in una cappa aspirante pulita per diversi minuti. Ora, fissa con del nastro adesivo il wafer essiccato al centro della capsula di Petri, facendo attenzione a posizionare il nastro ai bordi del wafer.

Infine, pipettare 500 microlitri di sigma coat sul wafer. Coprire la capsula di Petri con il coperchio, quindi agitare la piastra per garantire il completo rivestimento del wafer. Togliete il coperchio e lasciate asciugare il wafer per alcuni minuti fino a quando tutto il solvente non sarà evaporato.

Dopo aver miscelato il polimero PDMS e l'agente indurente con un rapporto peso/peso di 10 a uno, rimuovere le bolle d'aria utilizzando un essiccante sottovuoto per alcuni minuti o un'ora, a seconda della forza del sistema di vuoto disponibile. Dopo che tutte le bolle d'aria sono state rimosse, versare il composto nel piatto in modo che la cialda e la superficie del piatto siano coperte. Per creare un foglio di PDMS di circa cinque millimetri di spessore.

Create anche un pezzo sottile e privo di caratteristiche di PDMS di un millimetro di spessore. Quindi polimerizzare il composto in un forno a 60 gradi Celsius per una notte. Il giorno successivo, utilizzare un coltello o un bisturi per tagliare intorno al wafer e rimuovere più dispositivi microfluidici PDMS.

Quindi tagliare il foglio per isolare i singoli dispositivi. Tagliare il foglio di PDMS leggermente più grande del dispositivo microfluidico. Ora usa una morsa a spillo, un unicorno Harris o un dispositivo simile per creare fori di ingresso e uscita nel dispositivo microfluidico.

Successivamente, pulire le superfici del dispositivo microfluidico e il foglio utilizzando dello scotch. Quindi utilizzare un pulitore al plasma per esporre le superfici del dispositivo microfluidico e del foglio PDMS al plasma di ossigeno per 30 secondi. Il plasma di ossigeno crea specie reattive sulla superficie esposta del PDMS, che si legano quando vengono messe in contatto fisico.

Quindi, riempire una siringa da un millilitro dotata di un ago a punta smussata calibro 20 con 50 microgrammi per millilitro. La fibronectina dal plasma umano in PBS inserisce quindi un pezzo di tubo sopra l'ago. Inserire un pezzo di tubo più sottile nel primo pezzo di tubo per creare un accoppiamento ad attrito tra i due pezzi di tubo.

Quindi collegare l'altra estremità del pezzo di tubo più sottile all'ingresso del dispositivo microfluidico. Applicare pressione sulla siringa per riempire completamente i canali con una soluzione di fibronectina e per creare una piccola goccia da 100 microlitri alla porta di uscita per garantire che i canali rimangano bagnati. Ora, incubare il dispositivo microfluidico in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius per 40-60 minuti.

Dopo l'incubazione, collegare una siringa nuova riempita di PBS all'ago a punta smussata. Applicare pressione per lavare il dispositivo microfluidico con PBS. Preparare da 500.000 a 2 milioni di cellule per millilitro di cellule endoteliali della vena ombelicale umana o avere in terreni di crescita endoteliali con l'8% di destrano.

L'aggiunta di destrano aumenta la probabilità che le cellule aderiscano e coltivino con successo all'interno del dispositivo microfluidico. Filler: siringa pulita, dotata di un ago a punta smussata e di un tubo più largo con la sospensione cellulare e di un tubo più lungo, lungo circa un metro. È fondamentale assicurarsi che il tubo sia ben aderente per eliminare le perdite tra le connessioni.

Adescare il tubo con una soluzione cellulare, assicurandosi che non siano presenti bolle né nella siringa né in nessuno dei tubi Per ottimizzare le prestazioni del sistema. A questo punto è fondamentale evitare che eventuali perdite o bolle entrino nel sistema. Qualsiasi perdita di soluzione o presenza di bolle nel terreno impedirà il corretto posizionamento delle cellule endoteliali.

Una volta eliminate tutte le bolle e innescata l'intera lunghezza del tubo con sospensione cellulare, posizionare la siringa sulla pompa e collegare l'altra estremità all'ingresso microfluidico. La pompa a siringa è regolata alla stessa altezza del dispositivo microfluidico. La lunga lunghezza del tubo viene accuratamente arrotolata all'interno dell'incubatore per garantire che le celle e i terreni siano adeguatamente riscaldati prima di entrare in contatto con il dispositivo.

Quindi la sospensione cellulare viene infusa nel dispositivo microfluidico a una portata volumetrica di 1,23 microlitri al minuto per due ore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica nel nostro sistema. Il tasso di influenza volumetrico di 1,23 microlitri al minuto corrisponde a una velocità media di un millimetro al secondo nei canali più piccoli. Questo si avvicina a una sollecitazione di taglio della parete di un centesimo per centimetro quadrato in quei canali utilizzando sangue intero.

Una volta completata l'infusione della sospensione cellulare, utilizzare la stessa pompa a siringa e un tubo lungo con una siringa più grande per infondere terreni di crescita freschi per due-otto giorni a una velocità di 1,23 microlitri al minuto. Quando il monostrato cellulare si trova al livello di confluenza desiderato, iniettare sangue o sospensione cellulare nel sistema per la sperimentazione. Qui, il dispositivo microfluidico viene mostrato prima dell'endotelizzazione.

Il dispositivo microfluidico è stato infuso con colorante alimentare per illustrare le dimensioni, la scala e il design generale del dispositivo che imita la fisiologia del sistema vascolare. La microscopia in campo chiaro rivela l'endotelizzazione di un dispositivo microfluidico. Questa immagine è stata acquisita meno di 48 ore dopo la semina utilizzando il protocollo descritto, la tecnica di perfusione ottimizzata consente alle cellule endoteliali di fondere fluentemente l'intera superficie interna del sistema microfluidico.

Entro 24-48 ore dalla semina cellulare. Come mostrato in questa immagine confocale, il tumore microvascolare su un chip con micro canali si avvicina alla dimensione di 30 micron delle vele post-capillari, il sito della maggior parte degli eventi ostruttivi microvascolari dell'anemia falciforme. In questo esperimento, il sangue intero di pazienti sani viene infuso in un microsistema vascolare su un dispositivo chip in condizioni deossigenate.

Questo filmato mostra che il flusso di sangue intero nel nostro sistema microfluidico endoteliale è regolare, regolare e continuo senza aree di ostruzione dei microcanali. Qui, il sangue intero di pazienti con anemia falciforme viene infuso in un microsistema vascolare su un dispositivo a chip. In condizioni deossigenate, si osservano cambiamenti significativi nel flusso sanguigno con occlusioni complete presenti in diversi canali.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non introdurre bolle d'aria quando si cambia il tubo. Il dispositivo finito è compatibile con la microscopia a fluorescenza e può essere adattato ai tradizionali saggi di fluorescenza. Questa tecnica apre la strada agli ematologi sperimentali per condurre esperimenti utilizzando singole cellule in un ambiente biofisico ed emodinamico controllato.

Niente bolle.