In tempo reale Imaging digitale di leucociti-endotelio in ischemia-riperfusione (IRI) del muscolo Cremaster Rat

La microscopia intravitale della microcircolazione del tessuto CRE è un metodo pratico per ottenere informazioni sull'ischemia e sul danno da riperfusione nel tessuto muscolare striato. In un protocollo passo dopo passo, illustriamo come iniziare con un'anestesia controllata mediante respirazione, sotto un adeguato monitoraggio tramite cannullatura arteriosa, per mantenere l'animale stabilmente anestetizzato per lunghi periodi di tempo. Spieghiamo come cannullare la vena giugulare e successivamente descriviamo il preparato del tessuto CRE come una sottile lamina piana, ideale per un'elevata risoluzione ottica.

Forniamo un protocollo per l'imaging dei leucociti in modelli di lesione da ischemia-riperfusione che è stato ben consolidato nei nostri laboratori. Questo modello può essere utilizzato per analizzare l'attivazione dei leucociti in condizioni di ischemia. Ricerca sulla lesione da riattivazione del flusso sanguigno.

Il danno da riperfusione è implicato in un'ampia gamma di condizioni patologiche, come l'infarto miocardico, l'ischemia intestinale e quelle successive a trapianto e interventi cardiochirurgici. L'iperperfusione del tessuto precedentemente ischemico, sebbene essenziale per prevenire lesioni tissutali irreversibili, provoca un'eccessiva infiammazione del tessuto interessato, associata alla produzione di specie reattive dell'ossigeno, all'attivazione del sistema del complemento e all'aumento della permeabilità microvascolare. L'attivazione dei leucociti rappresenta uno dei principali fattori coinvolti nella cascata patologica del danno tissutale infiammatorio durante la riperfusione.

Promuoviamo qui la microscopia intravitale del capillare post-manuale come metodo pratico per analizzare l'attivazione dei leucociti nel danno da ischemia-riperfusione. Illustreremo inoltre gli errori più comuni e forniremo suggerimenti utili che permetteranno al lettore di comprendere appieno e di eseguire in sicurezza tale metodo. Dopo aver ottenuto l'approvazione del comitato etico, anestetizzare ratti maschi con un peso corporeo compreso tra 120 e 180 grammi, posizionare il ratto all'interno di una scatola in plexiglass ed erogare dal due al tre percento in volume di isoflurano tramite vaporizzatore di isoflurano.

Non appena si raggiunge il livello appropriato di anestesia, il ratto viene pesato e rasato nell'area cervicale ventrale. Posizionare l'animale in posizione supina su un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius ed applicare isoflurano al due percento in volume utilizzando una maschera in silicone. Le seguenti preparazioni vanno eseguite preferibilmente utilizzando un microscopio chirurgico.

Eseguire un'incisione cutanea orizzontale di due centimetri nella regione della fossetta sternale delle SRA. Mobilizzare lateralmente le ghiandole salivari. A questo punto si incontrano i muscoli ventrali del collo.

Separarli con attenzione lungo la linea mediana e individuare la trachea. Esposizione di uno o due centimetri di trachea e posizionare una pinzetta microchirurgica al di sotto per sollevarla. A questo punto, inserire per circa metà della lunghezza nel lato ventrale della trachea un tubo di calibro 14 come cannula tracheale nella parte inferiore della trachea, che in precedenza è stato collegato a un ventilatore per animali.

La respirazione può quindi essere controllata in volume con una frequenza di 35 a 45 atti respiratori al minuto. Un volume corrente di 4,5 a cinque M e una concentrazione di fluoroiso di 1,5 a due volumi percentuali per la cannullazione carotidea. Il muscolo ioideo sternale destro viene separato mediante dissezione ottusa.

Per individuare un'arteria carotide, separare con attenzione il nervo vago dall'arteria carotide e posizionare l'arteria su pinzette microchirurgiche Anki per bloccare il flusso sanguigno dal cuore, passando due legature sotto l'arteria carotide in riferimento al cuore; la legatura più distale viene legata strettamente, mentre quella prossimale viene legata in modo lento attorno all'arteria carotide. L'applicazione di una seconda legatura prossimale previene il sanguinamento dopo aver rimosso le pinzette microchirurgiche utilizzando forbici microchirurgiche, effettuando un piccolo taglio nell'arteria carotide tra le due legature. Inserire un catetere in polietilene riempito con soluzione salina fisiologica, collegato a un trasduttore di pressione.

Rimuovere la pinzetta microforza e inserire ulteriormente il catetere nell'arteria. Eseguire analisi intermittenti del gas sanguigno arterioso mediante un analizzatore di gas del sangue e mantenere il pH del sangue entro i limiti fisiologici per l'applicazione endovenosa di coloranti fluorescenti o altri farmaci di interesse. Concentrarsi sull'area della vena giugulare sinistra utilizzando il microscopio operatorio con una pinzetta in ciascuna mano, quindi lacerare la sottile fascia per esporre la vena giugulare.

Montare la vena su una pinzetta microchirurgica inclinata per arrestare il flusso sanguigno. Utilizzando la pinzetta, passare in modo identico a quanto fatto per la cannullazione della carotide due pezzi di sutura di uguale lunghezza sotto la vena giugulare, praticare un piccolo taglio nella vena giugulare ed inserire un catetere in polietilene che sia stato precedentemente lavato con soluzione della linea cellulare. Introdurre il catetere in direzione del cuore e stringere il legaccio più vicino al cuore.

Attorno alla vena e al catetere, utilizziamo un imaging cremasterico di grado quattro in alluminio che raggiunge rapidamente la temperatura desiderata del cuscinetto riscaldante. L'incisione iniziale viene praticata sulla cute e sul fascio spermatico esterno al di sopra dello scroto, nell'estremità più distale, seguita da una cauta dilatazione dello spazio sottocutaneo mediante forbici fini. Non appena il tessuto viene esposto, viene inumidito con una soluzione salina preriscaldata.

Il tessuto connettivo tra la fascia spermatica esterna e il muscolo CRE master viene accuratamente rimosso per liberare i muscoli del trimestre dai tessuti circostanti. La superfusione continua durante la dissezione idrata il tessuto, facilitando la visibilità e la rimozione, ad esempio dell'estremità distale del CRE master S, per mantenere ferma e leggermente estendere l'estremità del S all'interno dell'estremità distale della sacca sulla faccia ventrale ed elongare l'incisione in direzione prossimale. Utilizzando forbici microchirurgiche, identificare con cura i vasi sanguinanti lungo le linee di incisione.

Utilizzando una termica di Cory, il muscolo cremasterico dell'apertura del granchio giace piatto sulla dose del piedistallo in alluminio, ancora collegato da sottili legamenti agli EPI sotto il testicolo, inclusa una piccola arteria e una vena. Usare l'ery per sigillare i vasi e per tagliare i legamenti connettivi tra il tessuto discali e quello cremasterico. Spingere delicatamente il testicolo isolato all'interno del canale inguinale.

Oltre alla prima fissazione, prendere il tessuto e attaccare con cautela i fili in modo da stendere radialmente il tessuto cremasterico sulla piastra di alluminio. Posizionare le due estremità di un catetere in polietilene vicino al tessuto cremasterico per predisporre il sistema di superfusione. Tracciare una linea di vaselina intorno al muscolo cremasterico utilizzando una siringa per creare una camera liquida.

Posizionare un vetrino quadrato sul tessuto crico e fissarne saldamente i bordi alla linea di vaselina. Il tessuto cremasterico è ora pronto per l'imaging microscopico. L'allestimento di base per l'osservazione intra vitale può variare.

Utilizziamo un microscopio epi fluorescente intravitale dotato di una sorgente luminosa LED da 470 nanometri per la laminazione EP. Con un obiettivo a immersione in acqua, otteniamo un ingrandimento di circa 800 x e registriamo le osservazioni mediante una telecamera digitale ad alta risoluzione. Per l'acquisizione di immagini in epifluorescenza, l'esperimento deve essere eseguito in una stanza buia.

Per l'etichettatura dei leucociti, iniettare rumina sei J per via endovenosa attraverso il catetere giugulare a una concentrazione di 0,4 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo. Scegliere un venule postcapillare per l'osservazione. Il diametro del vaso deve essere compreso tra 20 e 60 micrometri e il flusso sanguigno deve essere sufficiente.

Prima che si verifichi l'ischemia, lasciare stabilizzare il tessuto per 30 minuti. Successivamente, effettuare una registrazione di 30 secondi per stabilire i valori basali del rotolamento e dell'adesione dei leucociti. Posizionare delicatamente una clip vascolare bemer all'estremità prossimale del tessuto cremasterico esposto utilizzando pinze applicatrici.

Rimuovere la pinza sul vaso dopo 30 minuti di isch. Successive registrazioni possono essere effettuate per tutto il periodo di riperfusione. Per la quantificazione del rotolamento dei leucociti, definire una linea virtuale che intersechi verticalmente il vaso, mantenendola costante in tutti i tracciati.

Contare manualmente il numero di leucociti rotolanti che attraversano la linea entro 30 secondi. Per la quantificazione dei leucociti aderenti, definire una sezione vascolare di 200 micrometri costante in tutti i registri.

Contare il numero di leucociti chiaramente visibili che rimangono statici per 30 secondi. I risultati rappresentativi sono forniti all'interno del protocollo scritto. Sebbene il danno da ischemia-riperfusione sia stato implicato in vari sistemi organici, qui descriviamo un metodo per analizzare l'interazione tra leucociti e endotelio nel danno da ripertusione del tessuto muscolare striato.

Pertanto, particolarmente rilevante per la chirurgia dei lembi liberi, poiché si ritiene che il danno tissutale post-ischemico di altri organi coinvolga gli stessi meccanismi infiammatori. Il metodo descritto può essere utilizzato per ottenere informazioni fondamentali sui meccanismi patologici della lesione da ischemia-riperfusione. L'induzione di ischemia nel muscolo cremasterico può essere facilmente eseguita e riflette perfettamente condizioni clinicamente rilevanti, come la chirurgia del lembo libero.

Inoltre, modifiche come ischemia fredda o ischemia calda o la sovrafusione cromica con sostanze che influenzano l'infiammazione possono essere facilmente applicate. L'iniezione intraorale potrebbe essere il metodo di scelta quando è necessario un trattamento, ore o giorni prima della registrazione.