Name: In tempo reale Imaging digitale di leucociti-endotelio in ischemia-riperfusione (IRI) del muscolo Cremaster Rat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: Impara la microscopia intravitale digitale per studiare le interazioni leucocito-endotelio durante l'ischemia-riperfusione nel muscolo cremasterico del ratto. Questo protocollo dettagliato permette l'osservazione in tempo reale dei meccanismi infiammatori.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una concessione del &quot;Deutsche Forschungsgemeinschaft&quot; a SU Eisenhardt (EI 866/1-1).

1. Anestesia e monitoraggio <ol><li> Etico competente nazionale e istituzionale dovrebbe essere a posto prima di effettuare esperimenti su animali. Dopo l&#39;approvazione al comitato etico anestetizzare ratti Sprague Dawley maschi con un peso corporeo 120-180 g. Consegna 2 - 3% vol isoflurano a una finestra di plexiglas con vaporizzatore isoflurano e posizionare all&#39;interno ratto. </li><li> Non appena il livello adeguato di anestesia si ottiene (mancanza di reazione a punta o la coda pizzico), il ratto è ponderato e rasato l&#39;area ventrale del collo dell&#39;utero. </li><li> Posizionare il ratto in decubito dorsale su un tappetino di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C e applicare isoflurano al 2% vol utilizzando una maschera di silicone. </li></ol> Le fasi di preparazione seguenti sono meglio realizzato utilizzando un microscopio chirurgico. <ol start="4"><li> Per la preparazione della trachea, l&#39;arteria carotide e la vena giugulare, eseguire una incisione cutanea orizzontale 2 cm nella zona of soprasternale e mobilitare le ghiandole salivari lateralmente. </li><li> Si trovano ora ad affrontare i muscoli del collo ventrali. Separarli accuratamente sulla linea mediana e trovare la trachea. Esporre 1 - 2 cm della trachea e posizionare una pinza micro sotto di esso in modo da sollevarla. </li><li> Ora, tagliato a metà attraverso il lato ventrale della trachea. Fare attenzione a non tagliare tutto il modo attraverso, se lo fai, alla fine taglio della trachea scivolerà nuovamente dentro il petto e essere molto difficile da lavorare. </li><li> Inserire un tubo Abbocath (14G) utilizzato come tubo tracheale nella parte inferiore della trachea, che è stato precedentemente collegato ad un ventilatore animale. Suggerimento: Studio su staffe di fissaggio magnetico, nonché la sutura della trachea intorno al tubo è essenziale per mantenere il tubo tracheale in posizione. Generalmente si usa Terylene 5/0 sutura, il materiale di sutura tuttavia simile può essere utilizzato. </li><li> La respirazione può quindi essere controllata in volume (frequenza, 35 - 45 respiri al minuto, volume corrente, 4.5 - 5 ml; FiO 2 </sub&gt;, 0,35-0,50;. isoflurano 1,5-2% vol) 14 Atelettasia può essere evitata mantenendo una positiva pressione di fine espirazione di 5 a 10 mm di H 2 O. 15 </li><li> Per la canulation carotide, il muscolo destra sterno viene separato per via smussa per individuare l&#39;arteria carotide. </li><li> Separare il nervo vago con attenzione dalla carotide e montare l&#39;arteria su un angolo micro pinza per fermare il sangue che scorre dal cuore. </li><li> Passare due pezzi di lunghezza uguale di sutura sotto la carotide. In riferimento al cuore, la sutura più distale è strettamente legato a occludere il sangue che fluisce dalla regione della testa, mentre la sutura viene legata prossimale liberamente attorno carotide. </li><li> Utilizzando forbici micro un piccolo taglio viene effettuato nella carotide tra i due legature. </li><li> Inserire un catetere di polietilene (0,28 mm di diametro interno) riempito con soluzione fisiologica che è collegato ad un trasduttore di pressione. </li><li> Remuovere le pinze micro e filo ulteriormente il catetere nell&#39;arteria. Quindi stringere la legatura prossimale intorno all&#39;arteria e il catetere. Suggerimento: Applicazione di una seconda sutura prossimale impedisce sanguinamento dopo la rimozione delle micro pinze. </li><li> Legare la legatura distale intorno alla carotide e il catetere per l&#39;ancoraggio aggiuntivo. </li><li> Monitorare costantemente l&#39;anestesia dal monitoraggio della frequenza cardiaca e pressione arteriosa. Eseguire intermittenti arterioso emogas analisi utilizzando un analizzatore di gas di sangue 16. Una frequenza cardiaca inferiore a 300 bpm o superiore a 360 bpm e una pressione arteriosa media cadere di sotto di 80 mmHg per più di 5 minuti sono i criteri di esclusione. 17, 18 Mantenere il sangue pH nei limiti fisiologici (7,35-7,45). Nel caso in cui l&#39;esperimento deve essere chiuso a causa di tassi anomali di monitoraggio, scarificare l&#39;animale dal collo o dislocazione exanguation. </li></ol> Per la somministrazione endovenosa di coloranti fluorescenti o altri farmaci of interesse, effettuare le seguenti operazioni: <ol start="17"><li> Fuoco l&#39;area della vena giugulare sinistra con il microscopio chirurgico. </li><li> Con una pinza in ogni mano, strappare il sottile fascia di rivelare la vena giugulare. Montare la vena su una pinza ad angolo micro. Il flusso di sangue si fermerà. </li><li> Con pinze, due pezzi di lunghezza uguale di sutura vengono passati sotto la vena giugulare concorde al canulation carotide. Legare saldamente la sutura distale e prossimale della sutura liberamente attorno alla vena giugulare. </li><li> Fate un piccolo taglio nella vena giugulare e inserire un catetere di polietilene (0,28 mm di diametro interno) che è stata lavata con soluzione salina. Contrassegnare che incisione e canulation può essere più impegnativo e richiede tempo di quello della carotide. </li><li> Passare il catetere verso il cuore e stringere la legatura più vicina al cuore intorno alla vena e il catetere. </li><li> Dopo la pervietà conforme, legare legatura distale intorno al catetere. Suggerimento: fissaggio supplementare di bocateteri ° con nastro può impedire dislocamento. </li><li> Risciacquare cateteri frequentemente per evitare la coagulazione intraluminale. </li></ol> 2. Preparazione del Muscle Cremaster <ol><li> Usiamo una fase in alluminio di 1,5 - 2 cm di spessore per l&#39;imaging cremasterico. La fase adotta rapidamente la temperatura desiderata del termocuscino attenuando controllo termico del tessuto cremasterico. Questo è fondamentale per gli studi infiammazione. In alternativa, una piattaforma plexiglas può essere utilizzata se la regolazione della temperatura cremasterico è più difficile. Posizionare lo scroto al centro del palco. </li><li> L&#39;incisione iniziale è realizzata in pelle e fascia esterna spermatico sopra scroto alla fine distale seguita dalla dilatazione prudente dello spazio sottocutaneo usando forbici sottili. Evitare di toccare il tessuto sottostante con gli strumenti. </li><li> Non appena il tessuto è esposto è inumidito con pre-riscaldato (37 ° C) soluzione salina tamponata con fosfato with calcio e magnesio. Applicare questa soluzione a qualsiasi tessuto esposto. </li><li> Il tessuto connettivo tra la fascia spermatica esterna e il muscolo cremastere è accuratamente rimosso per liberare il muscolo cremastere dal tessuto circostante. </li><li> La superficie esterna del muscolo cremastere è poi cautamente alla rimozione del tessuto connettivo. Superfusione continuo durante idrati dissezione del tessuto connettivo, facilitando la visibilità e la rimozione. </li><li> Suturare l&#39;estremità distale del sacco cremastere di tenere premuto leggermente e prolungare l&#39;estremità del sacco. </li><li> Incidere l&#39;estremità distale del sacco sulla parte ventrale e allungato l&#39;incisione prossimale usando forbici micro. Con attenzione cauterizzare sanguinamento navi lungo le linee di incisione che utilizzano una cauterizzazione termica. Evitare inutili cauterizzazione per limitare ulteriori stimoli infiammatori. Tip:. Dinamica del flusso sanguigno vicino alla periferia della preparazione sono modificate dal presente danno tissutale 19 Pertanto, per ridurre l&#39;se influisce sulla raccolta di dati, i vasi sanguigni vicino al centro della preparazione deve essere usata per l&#39;imaging. </li><li> Il Cremaster aperto sia piatto sul piedistallo di alluminio anche se ancora collegati da un legamento sottile dell&#39;epididimo sotto il testicolo. Riflettendo il testicolo da un lato espone questo legamento tra cui una piccola arteria e la vena che collegano l&#39;epididimo. Utilizzare il cauterio per sigillare i vasi ed impiegare le forbici per tagliare il micro legamento connettivo tra testicolo e tessuto cremasterico. </li><li> Spingere delicatamente indietro il testicolo isolato nel canale inguinale. Altri autori resecare il testicolo dopo la legatura prossimale (orchiectomia) insieme con il pad associato moda inguinale 20. In un modello sensibile come l&#39;attivazione dei leucociti IRI indotta si cerca di evitare tutti gli stimoli aggiuntivi chirurgici, quindi ci asteniamo dalla resezione del testicolo, che non è di solito necessaria per ottenere una sufficiente esposizione del muscolo cremastere. </li><li> Oltre al primosutura quattro bordi di tessuto (due su ogni lato) e collegare i fili ai nastri di diffondere con cautela il tessuto cremasterico radialmente sul palco in alluminio. Lasciando uno spazio tra la fase di alluminio e l&#39;ingresso esterno del canale inguinale semplifica clipping successiva cremasterico per ischemia. </li><li> Inserire due estremità del catetere di polietilene (0,28 mm di diametro interno) vicino al tessuto cremasterico per l&#39;installazione superfusione. Assicurarsi che il lume è privo di aria, per evitare bolle d&#39;aria nella camera di fluido finale. </li><li> Tracciare una linea di vaselina (vaselina) intorno al muscolo cremastere con una siringa. La linea deve estendere la dimensione del vetrino che viene utilizzato per la copertura. </li><li> Per creare una camera di fluido, posizionare un foglio quadrato coperchio (32 x 32 mm) sul tessuto cremasterico e fissare i bordi alla linea di vaselina. </li><li> Nel caso in cui il tessuto non è cremasterico superfuso con un farmaco specifico, sostituzione continua delle influenza circostanteid è non essenziale. Una singola applicazione di soluzione salina tamponata con fosfato di calcio e magnesio nella camera creata può quindi essere sufficiente. Stimolazione locale con farmaci tuttavia deve essere eseguita in modo continuo tramite micro-perfusione pompa ad una velocità di 3 ml per ora. </li><li> Il tessuto cremasterico è ora pronto per l&#39;imaging microscopico. </li></ol> 3. Setup intravitale La configurazione di base intravitale possono variare. Per l&#39;imaging epifluorescenza gli esperimenti devono essere eseguiti in una stanza buia. <ol><li> L&#39;animale viene trasferito alla fase di un microscopio intravitale epifluorescenza dotato di un LED 470 nm sorgente luminosa per epi-illuminazione. Utilizzare un obiettivo ad immersione in acqua (20 × / 1,0) per ottenere un ingrandimento di circa 800 ×. Osservazioni record mediante una fotocamera digitale ad alta risoluzione e conservare dati su un personal computer per la valutazione in linea. </li><li> Per l&#39;etichettatura dei leucociti, iniettare rodamina6G via endovenosa attraverso il catetere giugulare a concentrazioni di 0,4 mg / kg di peso corporeo. </li><li> Scegli un venule postcapillari per l&#39;osservazione. Dimensioni delle navi deve essere compresa tra 20-60 micron e il flusso sanguigno dovrebbe essere sufficiente. Per ridurre al minimo l&#39;influenza di pre-attivazione del tessuto, in cui solamente navi rotolamento dei leucociti è &lt;20 cells/30 secondo e il numero di cellule aderenti &lt;10 cells/200μm dell&#39;endotelio venulare può essere utilizzato per ulteriori analisi. </li><li> Se possibile, fino a tre venule postcapillari può essere utilizzato per l&#39;osservazione, tuttavia devono essere situati in una corrispondente sezione del tessuto cremasterico non confondere i vasi in punti temporali diversi. </li></ol> 4. Ischemia-riperfusione (IIR) <ol><li> Lasciare tessuto stabilizzare per 30 minuti. </li><li> Eseguire una registrazione di 30 secondi per stabilire i valori basali di rotolamento e l&#39;aderenza dei leucociti. Idealmente, generano in totale tre registrazioni per verificare cellule basalinumeri e per ottenere deviazioni standard. </li><li> Posizionare delicatamente una clip nave Biemer intorno alla fine prossimale del tessuto cremasterico esposto utilizzando la pinza di applicazione. Stasi deve avvenire immediatamente e possono essere visualizzati mediante microscopia in epifluorescenza nella sezione nave osservata. </li><li> Una varietà di andamento nel tempo può essere utilizzato a seconda del livello di danni. Noi applichiamo 30 minuti di tempo di ischemia, come descritto da altri autori. 21-23 Rimuovere la fascetta nave dopo. Lasciare flusso sanguigno di stabilizzarsi per altri 15 minuti. </li><li> Le successive registrazioni di 30 secondi la durata può essere effettuata per tutto il periodo di riperfusione (ad esempio 30 secondi ogni 15 minuti). Salva le registrazioni in digitale per l&#39;analisi offline. </li><li> Per la chiusura del dell&#39;esperimento, il ratto è sacrificati mediante dislocazione cervicale in anestesia sufficiente premendo un corpo contundente come il bordo opaco di una lama forbice alla base del cranio. Con l&#39;altramano, la base della coda viene tirato in fretta, provocando la separazione delle vertebre cervicali dal cranio. </li></ol> 5. Analisi di riproduzione video offline <ol><li> Per l&#39;analisi offline la riproduzione video è utile utilizzare un software che consente la selezione di immagini distinte e l&#39;osservazione della sequenza video al rallentatore. Regolare il contrasto e la luminosità in modo appropriato. Si usa il software fornito dal produttore del microscopio che permette misure di lunghezza e ingrandimento digitale. </li><li> Per la quantificazione di laminazione leucociti, definiscono una linea virtuale che interseca la nave verticale che è coerente in tutti i record. Contare il numero di leucociti colline che passano la linea entro 30 secondi manualmente. </li><li> Per la quantificazione dei leucociti aderenti, definire una sezione a 200 micron nave che sia coerente in tutti i record 23 Contare il numero di leucociti ben visibili che rimangono statici per 30 secondi -. Così defied in quanto aderente 24. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi IRI del muscolo cremastere non ha alcun effetto sulla pressione arteriosa media (MAP), la frequenza cardiaca e del pH del sangue Utilizzando la configurazione summenzionata (figura 1), abbiamo studiato la microcircolazione in IRI su un protocollo due ore, ma un tempo di osservazione molto più lungo fino a 6 ore è possibile. Come mostrato in figura 2, IRI del muscolo cremastere non ha effetti significativi sulla circolazione macrohemodynamic ratto come pressione arteriosa media e della frequenza cardiaca rimanere stabile per tutto il periodo dell&#39;inchiesta. Inoltre abbiamo monitorato l&#39;omeostasi da misurazioni frequenti del pH del sangue arterioso che spaziava entro i limiti fisiologici e non ha mostrato significative differenze tra gruppi. IRI induce rotolamento dei leucociti in circolo cremasterico L&#39;interazione leucociti endoteliale è una chiaveevento nel infiammazione acuta. Per mezzo di microscopia intravitale abbiamo trovato un tempo-dipendente aumento del numero di leucociti di laminazione in IRI del muscolo cremastere (Figura 3A) concorde ai dati precedenti 21, 25. Rotolamento montato sopra il tempo di osservazione due ore ad un massimo di 137,63 ± 22,55% del valore basale dopo 120 minuti di riperfusione e quindi raggiunto la significatività statistica rispetto agli animali fittizi azionati (137,63 ± 22,55 vs 99,43 ± 14,04% del valore basale). IRI induce l&#39;adesione dei leucociti in circolo cremasterico Per ulteriore valutazione dei leucociti-endotelio abbiamo analizzato l&#39;adesione dei leucociti in una sezione di 200 micron nave. IRI indotto un aumento del numero di leucociti aderenti notevolmente superati i valori di sham azionato animali dopo 60 minuti (118,33 ± 6,83 vs 96,27 ± 5,78% del valore basale) e ASCE ulteriorended da 120 minuti di riperfusione (Figura 3B). In sintesi, la descritta nel modello in vivo fornisce dati consistenti di acuta attivazione leucocitaria IRI in termini di sopravvivenza degli animali, mentre la circolazione e la stabilità è garantita. <img src="/files/ftp_upload/3973/3973fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagramma di flusso A. intravitale prestazioni epifluorescenza in ischemia-riperfusione del muscolo cremastere di ratto. Dopo i preparativi necessari per l&#39;anestesia e il monitoraggio, il muscolo cremastere di ratto è esposto per l&#39;imaging. Record di attivazione dei leucociti sono prese prima e dopo l&#39;ischemia del tessuto. Successiva analisi video è meglio eseguito offline. B. Figura schematica della configurazione proposta intravitale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3973/3973fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3973/3973fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. IRI del muscolo cremastere ha alcun effetto sulla pressione arteriosa media (MAP), la frequenza cardiaca e il pH del sangue. Pressione arteriosa media (A) e frequenza cardiaca (B) sono stati monitorati ogni 30 minuti durante l&#39;esperimento con trasduttore di pressione dopo canulation del diritto carotide. Misurazione del sangue arterioso pH-(C) è stata eseguita dopo 0, 60, e 120 minuti. I valori sono media ± SEM di 6 ratti diverse e andavano sui livelli fisiologici senza significative differenze tra gruppi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3973/3973fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3973/3973fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. IRI aumenta leucociti-Endotelio nella circolazione cremasterico. Dopo etichettatura dei leucociti con rodamina 6G (0,4 mg / kg di peso corporeo) intravitale epifluorescenza è stato utilizzato per determinare leucociti-endotelio in riperfusione tramite un protocollo di 120 minuti dopo 30 minuti di ischemia tessuto. Records sono state prese con un ingrandimento di circa × 800. A. IRI aumenta significativamente il numero di leucociti di laminazione in venule postcapillari del muscolo cremastere da 120 minuti di riperfusione, mentre al rotolamento dei leucociti rimane stabile durante l&#39;esperimento nel tessuto cremasterico che non hanno subito ischemia. I valori sono media ± SEM di 6 topi osservati. # P &lt;0,05 utilizzando il test t spaiato. B. Il numero di leucociti aderenti è significativamente aumentata in uno scelto casualmente sezione 200μm nave postcapillari dopo 30 minuti di ischemia cremasterico e dei successivi 60 minuti di riperfusione tessuto. Risultati da ottenere anche moè pronunciata dopo un periodo di riperfusione due ore. I valori sono media ± SEM di 6 topi osservati. # P &lt;0.05 utilizzando il test t spaiato. Foto C. rappresentativi di una venula postcapillari prima di ischemia (a sinistra) e 120 minuti dopo l&#39;IRI (a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3973/3973fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

<ol><li>Cetin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+fucoidin+%28a+neutrophil+rolling+inhibitor%29+on+ischemia+reperfusion+injury%3A+experimental+study+in+rat+epigastric+island+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plast.+Surg%22%5BJournal%5D)">Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps.</a> Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).</li>
<li>Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+xanthine+oxidase+and+granulocytes+in+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury.</a> Am. J. Physiol. 255, H1269-H1275 (1988).</li>
<li>Lazarus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mast+cells+in+ischaemia-reperfusion+injury+in+murine+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The role of mast cells in ischaemia-reperfusion injury in murine skeletal muscle.</a> J Pathol. 191, 443-448 (2000).</li>
<li>van den Heuvel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Ischaemia-reperfusion+injury+in+flap+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plast.+Reconstr.+Aesthet.+Surg%22%5BJournal%5D)">Review: Ischaemia-reperfusion injury in flap surgery.</a> J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 62, 721-726 (2009).</li>
<li>Rosen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+lectins+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface lectins in the immune system.</a> Semin. Immunol. 5, 237-247 (1993).</li>
<li>van der Flier, A., Sonnenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+interactions+of+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Function and interactions of integrins.</a> Cell Tissue Res. 305, 285-298 (2001).</li>
<li>Panes, J., Perry, M., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+adhesion%3A+avenues+for+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell adhesion: avenues for therapeutic intervention.</a> Br. J. Pharmacol. 126, 537-550 (1999).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+of+the+renal+microvascular+endothelium+alters+barrier+function+after+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Injury of the renal microvascular endothelium alters barrier function after ischemia.</a> Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 285, 191-198 (2003).</li>
<li>Serracino-Inglott, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+nitric+oxide+synthase+expression+during+hepatic+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Differential nitric oxide synthase expression during hepatic ischemia-reperfusion.</a> Am. J. Surg. 185, 589-595 (2003).</li>
<li>Eppinger, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+of+ischemia-reperfusion+injury+of+rat+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mediators of ischemia-reperfusion injury of rat lung.</a> Am J Pathol. 150, 1773-1784 (1997).</li>
<li>Dumont, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+apoptotic+cell-membrane+changes+at+the+single-cell+level+in+the+beating+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of apoptotic cell-membrane changes at the single-cell level in the beating murine heart.</a> Nat Med. 7, 1352-1355 (2001).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Woeste, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octreotide+attenuates+impaired+microcirculation+in+postischemic+pancreatitis+when+administered+before+induction+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Octreotide attenuates impaired microcirculation in postischemic pancreatitis when administered before induction of ischemia.</a> Transplantation. 86, 961-967 (2008).</li>
<li>Schultz, J. E., Hsu, A. K., Gross, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+mimics+the+cardioprotective+effect+of+ischemic+preconditioning+via+a+glibenclamide-sensitive+mechanism+in+the+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the rat heart.</a> Circ. Res. 78, 1100-1104 (1996).</li>
<li>Dobschuetz, E. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+intravital+fluorescence+microscopy--a+novel+method+for+the+assessment+of+microvascular+permeability+in+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic intravital fluorescence microscopy--a novel method for the assessment of microvascular permeability in acute pancreatitis.</a> Microvasc Res. 67, 55-63 (2004).</li>
<li>Vutskits, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+methylene+blue+on+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of methylene blue on the central nervous system.</a> Anesthesiology. 108, 684-692 (2008).</li>
<li>Takasu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+time+with+combined+early+blood+transfusion+and+fluid+administration+in+uncontrolled+hemorrhagic+shock+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Trauma%22%5BJournal%5D)">Improved survival time with combined early blood transfusion and fluid administration in uncontrolled hemorrhagic shock in rats.</a> J. Trauma. 8, 312-316 (2010).</li>
<li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+arteriolar%2C+regional%2C+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, 34-41 (1985).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Cremaster+Muscle+Preparation+for+Intravital+Imaging+of+the+Microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2874(2011).</li>
<li>Kanwar, S., Hickey, M. J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postischemic+inflammation%3A+a+role+for+mast+cells+in+intestine+but+not+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Postischemic inflammation: a role for mast cells in intestine but not in skeletal muscle.</a> Am. J. Physiol. 275, 212-218 (1998).</li>
<li>Leoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflamed+phenotype+of+the+mesenteric+microcirculation+of+melanocortin+type+3+receptor-null+mice+after+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Inflamed phenotype of the mesenteric microcirculation of melanocortin type 3 receptor-null mice after ischemia-reperfusion.</a> FASEB J. 22, 4228-4238 (2008).</li>
<li>Simoncini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+oestrogen+receptor+with+the+regulatory+subunit+of+phosphatidylinositol-3-OH+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OH kinase.</a> Nature. 407, 538-541 (2000).</li>
<li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).</li>
<li>Mori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+induced+microvascular+responses+in+LDL-receptor+-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice.</a> Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Molecular+Changes+Induced+by+Ischemia%2FReperfusion+in+Human+Free+Muscle+Flap+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plast.+Surg%22%5BJournal%5D)">Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples.</a> Ann. Plast. Surg. , (2011).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+activation-specific+human+anti-%7Balpha%7DM%7Bbeta%7D2+single-chain+antibodies+as+potential+diagnostic+tools+and+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents.</a> Blood. 109, 3521-3528 (2007).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+pentameric+to+monomeric+C-reactive+protein+on+activated+platelets+localizes+inflammation+to+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques.</a> Circ Res. 105, 128-137 (2009).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-reactive+protein%3A+how+conformational+changes+influence+inflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties.</a> Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).</li>
<li>Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGranger%2C+DN+%22Physiology+and+pathophysiology+of+leukocyte+adhesion%22">Physiology and pathophysiology of leukocyte adhesion</a>. , Oxford University Press. New York. 520(1995).</li>
<li>Baatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+white+blood+cell+staining+by+intravascular+administration+of+rhodamine+6G%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Microcirc.+Clin.+Exp%22%5BJournal%5D)">Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G.</a> Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).</li>
<li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
<li>Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fluorescent+dyes+on+selectin+and+integrin-mediated+stages+of+adhesion+and+migration+of+flowing+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes.</a> J. Immunol. Methods. 239, 109-119 (2000).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Leucociti-endotelio, la produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno e l&#39;attivazione del sistema del complemento sono le caratteristiche principali di IRI indotta disfunzione tessuto. 26 La microcircolazione del tessuto colpito è considerato come il sito integrale per l&#39;insorgenza infiammatoria. A parte gli esperimenti ex vivo come test camera di flusso 27, 28, è obbligatorio fornire consolidati modelli di imaging intravitale di valutare ulteriormente la rilevanza in vivo.</...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del prodotto: </td><td> Società: </td><td> N. di catalogo: </td><td> Commenti: </td></tr><tr><td> Forene 100% (V / V) </td><td> Abate </td><td> B506 </td><td> API isoflurane </td></tr><tr><td> Terylene sutura </td><td> Serag Weissner </td><td> OC108000 </td><td></td></tr><tr><td> Portex Belle Bore tubi in polietilene </td><td> Smiths Medical </td><td> 800/100/100 </td><td> 0,28 mm diametro interno </td></tr><tr><td> 0,9% soluzione salina </td><td> Fresinus Kabi </td><td> 808771 </td><td></td></tr><tr><td> Change-A-tip deluxe kit cautery </td><td> Bovie Medical </td><td> Del1 </td><td></td></tr><tr><td> Abbocath-T 14G </td><td> Venisystems </td><td> G713- A01 </td><td> utilizzato come tubo lente </td></tr><tr><td> Servo Ventilatore 900C </td><td> Maquet </td><td></td><td> utilizzati come ventialtor animale </td></tr><tr><td> Trasduttore di pressione Logical </td><td> Smiths Medical </td><td> MX1960 </td><td></td></tr><tr><td> Sirecust 404 Monitor </td><td> Siemens </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ABL 700 da banco Analyzer </td><td> Radiometro </td><td></td><td> per la misurazione del gas sangue </td></tr><tr><td> Riscaldamento pad </td><td> Effenberger </td><td> 8319 </td><td></td></tr><tr><td> Alluminio stage </td><td> ALFUN </td><td> AW7022 </td><td></td></tr><tr><td> Chirurgica microscopio OPMI 6-SDFC </td><td> Carl Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microchirurgica strumenti di laboratorio set </td><td> S &amp; T </td><td> 767 </td><td></td></tr><tr><td> Biemer nave Clip </td><td> Diener </td><td> 64,562 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;applicazione di forcipe </td><td> Diener </td><td> 64,568 </td><td> per clip nave Biemer </td></tr><tr><td> Rodamina 6G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R4127 </td><td></td></tr><tr><td> Vaselina bianca DAB </td><td> Winthrop </td><td> 2726853 </td><td></td></tr><tr><td> Coprire gli occhiali </td><td></td><td></td><td> 32x32 millimetri </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Installazione intravitale </td></tr><tr><td> Zeis Axio Scope A-1 MAT </td><td> Carl Zeis </td><td> 490036 </td><td> microscopio a epifluorescenza </td></tr><tr><td> 470 nm LED </td><td> Carl Zeis </td><td> 423052 </td><td> fluorescenza sorgente luminosa </td></tr><tr><td> Colibri 2 Sistema </td><td> Carl Zeis </td><td> 423052 </td><td></td></tr><tr><td> W Plan-Apochromat 20x / 1,0 DIC </td><td> Carl Zeis </td><td> 421452 </td><td> immersione in acqua obiettivo </td></tr><tr><td> AxioCam MRm Rev. 3 FireWire </td><td> Carl Zeis </td><td> 426509 </td><td> fotocamera digitale ad alta risoluzione </td></tr><tr><td> Axio LE vision software </td><td> Carl Zeis </td><td> 410130 </td><td> utilizzare per l&#39;analisi offline </td></tr></tbody></table>

in tempo reale imaging digitale di leucociti-endotelio in ischemia-riperfusione (iri) del muscolo cremaster rat

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

L&#39;ischemia-riperfusione (IRI) è stata implicata in una vasta gamma di condizioni patologiche come ictus cerebrale, infarto del miocardio, ischemia intestinale così come a seguito di trapianto e chirurgia cardiovascolare. 1 riperfusione di tessuto precedentemente ischemico, mentre essenziale per la prevenzione di irreversibile lesione dei tessuti, provoca infiammazione eccessiva del tessuto colpito. Adiacente alla produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno, l&#39;attivazione del sistema del complemento e aumento della permeabilità microvascolare, l&#39;attivazione di leucociti è uno degli attori principali nella cascata patologica del danno tissutale infiammatorio durante la riperfusione. 2, 3 attivazione dei leucociti è un processo multifasico che consiste di laminazione, adesione e la ferma ed è mediata da una complessa interazione tra molecole di adesione in risposta a fattori chemiotattici quali fattori del complemento, chemochine, o fattore attivante le piastrine 4. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Mentre rolling leucociti in venule postcapillari è mediato principalmente dall&#39;interazione di selectine 5 con loro ligandi contatore, ferma adesione dei leucociti all&#39;endotelio selectina è controllato tramite legame a molecole di adesione intercellulare (ICAM) e vascolare cellulari molecole di adesione (VCAM) 6, 7. Gold standard per l&#39;osservazione in vivo di leucociti-endotelio è la tecnica della microscopia intravitale, descritta per la prima nel 1968 8. Benché vari modelli di IRI (ischemia-riperfusione) sono stati descritti per vari organi, 9-12 solo pochi sono adatti per la visualizzazione diretta del reclutamento di leucociti nel microcircolo a un alto livello di qualità dell&#39;immagine. 8 Abbiamo qui promuovere la microscopia digitale intravitale epifluorescenza del venule postcapillari del microcircolo cremastericodel ratto 13 come un metodo conveniente per analizzare qualitativamente e quantitativamente il reclutamento dei leucociti per la ricerca IRI-nel tessuto muscolare striato e fornire un manuale dettagliato per realizzare la tecnica. Abbiamo inoltre illustrare le insidie ​​più comuni e fornire consigli utili che dovrebbe consentire al lettore di apprezzare veramente, e sicuro di eseguire il metodo. In un passo dal protocollo passo che raffigurano come iniziare con l&#39;anestesia respirazione controllata sotto il controllo sufficiente a mantenere l&#39;animale saldamente anestetizzato per lunghi periodi di tempo. Abbiamo poi descrivere la preparazione cremasterico come un sottile foglio appartamento in eccellente risoluzione ottica e fornisce un protocollo per l&#39;imaging dei leucociti in IRI che è stato ben stabilito nei nostri laboratori.

Digital microscopia intravitale epifluorescenza delle venule postcapillari nella microcircolazione cremasterico è un metodo comodo per acquisire conoscenze in leucociti-endotelio<em&gt; In vivo</em&gt; In ischemia-riperfusione (IRI) del tessuto muscolare striato. Noi qui forniamo un protocollo dettagliato per eseguire in sicurezza la tecnica e discutere le sue applicazioni e limitazioni.

In tempo reale Imaging digitale di leucociti-endotelio in ischemia-riperfusione (IRI) del muscolo Cremaster Rat

Il danno da ischemia-riperfusione (IRI) è stato implicato in un'ampia gamma di condizioni patologiche, quali l'ictus cerebrale, l'infarto del miocardio, ...

La microscopia intravitale della microcircolazione del tessuto CRE è un metodo pratico per ottenere informazioni sull'ischemia e sul danno da riperfusione nel tessuto muscolare striato. In un protocollo passo dopo passo, illustriamo come iniziare con un'anestesia controllata mediante respirazione, sotto un adeguato monitoraggio tramite cannullatura arteriosa, per mantenere l'animale strettamente anestetizzato per lunghi periodi di tempo. Spieghiamo come cannullare la vena giugulare e successivamente descriviamo il preparato del tessuto CRE come una sottile lamina piana, ideale per un'elevata risoluzione ottica.Forniamo un protocollo per l'imaging dei leucociti in lesioni da ischemia-reperfusione che è stato ben consolidato nei nostri laboratori. Questo modello può essere utilizzato per analizzare l'attivazione dei leucociti in condizioni di ischemia. Ricerca sulla lesione da riperfusione.Il danno da fusione ischemica è implicato in un'ampia gamma di condizioni patologiche, come l'infarto miocardico, l'ischemia intestinale e anche dopo trapianto e interventi cardiochirurgici. L'iperperfusione del tessuto precedentemente ischemico, sebbene essenziale per prevenire lesioni tissutali irreversibili, provoca un'eccessiva infiammazione del tessuto interessato, associata alla produzione di specie reattive dell'ossigeno, all'attivazione del sistema del complemento e all'aumento della permeabilità microvascolare. L'attivazione dei leucociti rappresenta uno dei principali fattori coinvolti nella cascata patologica del danno tissutale infiammatorio durante la riperfusione.Promuoviamo qui la microscopia intravitale del capillare post-manuale come metodo pratico per analizzare l'attivazione dei leucociti nel danno da ischemia-riperfusione. Illustreremo inoltre gli errori più comuni e forniremo suggerimenti utili che permetteranno al lettore di comprendere appieno e di eseguire in sicurezza tale metodo. Dopo aver ottenuto l'approvazione del comitato etico, anestetizzare ratti maschi con un peso corporeo compreso tra 120 e 180 grammi, posizionare il ratto all'interno di una scatola in plexiglass ed erogare dal due al tre percento in volume di isoflurano tramite vaporizzatore di isoflurano.Non appena si raggiunge il livello appropriato di anestesia, si pesa il ratto e si raschia la zona cervicale ventrale. Posizionare l'animale in posizione supina su un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius ed applicare isoflurano al due percento in volume utilizzando una maschera al silicone. Le seguenti preparazioni vanno eseguite preferibilmente utilizzando un microscopio chirurgico.Eseguire un'incisione cutanea orizzontale di due centimetri nella regione della fossetta sternale delle arterie sovraclaveari (SRA). Mobilizzare lateralmente le ghiandole salivari. A questo punto si incontrano i muscoli ventrali del collo.Separarli con attenzione lungo la linea mediana e individuare la trachea. Esponi uno o due centimetri di trachea e posiziona una pinzetta microchirurgica al di sotto per sollevarla. Ora, inserisci per circa metà strada attraverso la parte ventrale della trachea un tubo di calibro 14 come cannula tracheale nella parte inferiore della trachea, che in precedenza è stato collegato a un ventilatore per animali.La respirazione può quindi essere controllata in volume con una frequenza di 35 a 45 atti respiratori al minuto. Un volume corrente di 4,5 a cinque M e una concentrazione di fluoruro ISO compresa tra l'1,5 e il 2 percento in volume per la cannullazione carotidea. Il muscolo ioideo sternale destro viene separato mediante dissezione ottusa.Per individuare un'arteria carotide, separare con attenzione il nervo vago dall'arteria carotide e posizionare l'arteria su pinzette microforza Anki per bloccare il flusso sanguigno dal cuore, passando due lacci sotto l'arteria carotide in riferimento al cuore: il laccio più distale viene legato strettamente, mentre quello prossimale viene legato in modo lento attorno all'arteria carotide. L'applicazione di un secondo laccio prossimale previene l'emorragia dopo aver rimosso le pinzette microforza utilizzando forbici microchirurgiche, effettuando un piccolo taglio nell'arteria carotide tra i due legami. Inserire un catetere in polietilene riempito con soluzione salina fisiologica, collegato a un trasduttore di pressione.Rimuovere la pinzetta microforza e inserire ulteriormente il catetere nell'arteria. Eseguire analisi intermittente del gas sanguigno arterioso mediante un analizzatore di gas del sangue e mantenere il pH del sangue entro i limiti fisiologici per l'applicazione endovenosa di coloranti fluorescenti o altri farmaci di interesse. Concentrarsi sull'area della vena giugulare sinistra utilizzando il microscopio operatorio con una pinzetta in ciascuna mano, quindi lacerare la sottile fascia per esporre la vena giugulare.Posizionare la vena su una pinzetta microchirurgica inclinata per arrestare il flusso sanguigno. Utilizzando la pinzetta, passare in modo identico a quanto fatto per la cannullazione della carotide due pezzi di sutura di uguale lunghezza sotto la vena giugulare, praticare un piccolo taglio nella vena giugulare ed inserire un catetere in polietilene che sia stato precedentemente lavato con soluzione della linea cellulare. Introdurre il catetere in direzione del cuore e stringere il legaccio più vicino al cuore.Attorno alla vena e al catetere, utilizziamo un imaging cremasterico di grado quattro in alluminio che raggiunge rapidamente la temperatura desiderata del cuscinetto riscaldante. L'incisione iniziale viene praticata sulla cute e sul fascio spermatico esterno al di sopra dello scroto, nell'estremità più distale, seguita da una cauta dilatazione dello spazio sottocutaneo mediante forbici fini. Non appena il tessuto viene esposto, viene inumidito con una soluzione salina preriscaldata.Il tessuto connettivo tra la fascia spermatica esterna e il muscolo CRE master viene accuratamente rimosso per liberare i muscoli del trimestre dai tessuti circostanti. La superfusione continua durante la dissezione idrata il tessuto, facilitando la visibilità e la rimozione, ad esempio dell'estremità distale del CRE master S, per bloccare e leggermente estendere l'estremità del S all'interno dell'estremità distale della sacca sulla faccia ventrale ed elongare l'incisione in direzione prossimale. Utilizzando forbici microchirurgiche, identificare con cura i vasi sanguinanti lungo le linee di incisione.Utilizzando una termica di Cory, il muscolo cremasterico aperto giace piatto sulla dose del piedistallo in alluminio, ancora collegato tramite sottili legamenti agli EPI al di sotto del testicolo, inclusa una piccola arteria e una vena. Usare l'ery per sigillare i vasi e per recidere i legamenti connettivi tra il tessuto discali e quello cremasterico. Spingere delicatamente il testicolo isolato all'interno del canale inguinale.Oltre alla prima fissazione, che comprende quattro punti di sutura del tessuto, fissare con cautela i fili in modo da distendere radialmente il tessuto cremasterico sulla piastra di alluminio. Posizionare le due estremità di un catetere in polietilene vicino al tessuto cremasterico per predisporre il sistema di superfusione. Tracciare una linea di vaselina intorno al muscolo cremasterico utilizzando una siringa, al fine di creare una camera liquida.Posizionare un coprioggetto quadrato sul tessuto crico e fissarne saldamente i bordi alla linea di vaselina. Il tessuto cremasterico è ora pronto per l'acquisizione microscopica di immagini. L'allestimento di base per l'analisi intra vitale può variare.Utilizziamo un microscopio intra vitale a epifluorescenza dotato di una sorgente luminosa LED da 470 nanometri per la laminazione EP. Con un obiettivo a immersione in acqua, otteniamo un ingrandimento di circa 800 x e registriamo le osservazioni mediante una telecamera digitale ad alta risoluzione. Per l'acquisizione di immagini a epifluorescenza, l'esperimento deve essere eseguito in una stanza buia.Per l'etichettatura dei leucociti, iniettare rumina sei J per via endovenosa tramite il catetere giugulare a una concentrazione di 0,4 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo. Scegliere un venule postcapillare per l'osservazione. Il diametro del vaso deve essere compreso tra 20 e 60 micrometri e il flusso sanguigno deve essere sufficiente.Prima che si verifichi l'ischemia, lasciare stabilizzare il tessuto per 30 minuti. Successivamente, effettuare una registrazione di 30 secondi per stabilire i valori basali del rotolamento e dell'adesione dei leucociti. Posizionare delicatamente una clip vascolare bemer all'estremità prossimale del tessuto cremasterico esposto, utilizzando pinze applicatrici.Rimuovere la pinza sul vaso dopo 30 minuti di isch. Successive registrazioni possono essere effettuate per tutto il periodo di riperfusione. Per la quantificazione del rotolamento dei leucociti, definire una linea virtuale che intersechi verticalmente il vaso, mantenendola costante in tutti i tracciati.Contare manualmente il numero di leucociti rotolanti che attraversano la linea entro 30 secondi. Per la quantificazione dei leucociti aderenti, definire una sezione vascolare di 200 micrometri costante in tutti i registri.Contare il numero di leucociti chiaramente visibili che rimangono statici per 30 secondi. I risultati rappresentativi sono forniti all'interno del protocollo scritto. Sebbene il danno da ischemia-riperfusione sia stato implicato in vari sistemi organici, qui descriviamo un metodo per analizzare l'interazione tra leucociti e endotelio nel danno da ripertusione del tessuto muscolare striato.Pertanto, particolarmente rilevante per la chirurgia dei lembi liberi, poiché si ritiene che il danno tissutale post-ischemico di altri organi coinvolga gli stessi meccanismi infiammatori. Il metodo descritto può essere utilizzato per ottenere informazioni fondamentali sui meccanismi patologici della lesione da ischemia-riperfusione. L'induzione di ischemia nel muscolo cremasterico può essere facilmente eseguita e riflette perfettamente condizioni clinicamente rilevanti, come la chirurgia dei lembi liberi.Inoltre, modifiche come ischemia fredda o ischemia calda o la superfusione cromica con sostanze che influenzano l'infiammazione possono essere facilmente applicate. L'iniezione intraorale può essere il metodo di scelta quando è necessario un trattamento, ore o giorni prima della registrazione.

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Qui riportiamo una tecnica sperimentale di fluorescenza microscopia intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi nei topi vivi. Questa tecnologia microscopica sarà prezioso per studiare il meccanismo molecolare della malattia vascolare e per testare agenti farmacologici in condizioni fisiopatologiche.

In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull&#39;endotelio Attivato durante l&#39;infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Microscopia intravitale del microcircolo cremastere topo M. offre un unico e ben standardizzato-modello in vivo per l'analisi del midollo osseo migrazione di cellule staminali periferiche.

Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per l&#39;analisi di migrazione delle cellule staminali periferiche

Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Questo studio dimostra la preparazione chirurgica del muscolo cremastere di ratto per la visualizzazione dello strato libero da cellule in vivo. In questo studio vengono discussi fattori considerevoli che influenzano l'accuratezza della misurazione della larghezza dello strato libero da celle.

Visualizzazione e la quantificazione dello strato acellulare nelle arteriole del muscolo Cremaster Rat

Questo protocollo descrive l'induzione di un modello di ischemia-riperfusione (IR) sulla pelle orecchio mouse utilizzando magnete di bloccaggio. Utilizzando un modello di imaging intravitale custom-built, studiamo in vivo risposte infiammatorie post-riperfusione. La logica alla base dello sviluppo di questa tecnica è quello di estendere la comprensione di come leucociti rispondono al danno IR pelle.

Inducendo ischemia-riperfusione lesioni in Ear pelle mouse per intravitale Multiphoton Imaging delle risposte immunitarie

Qui, mostriamo come eseguire la microscopia intravitale sulle venule post-capillari del muscolo cremaster del topo. Comunemente applicati a diversi modelli di infiammazione e sepsi, in particolare quelli indotti da chemiochine e citochine, sottolineiamo la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che coinvolgono infiltrazioni muscolari esagerate.

Infiltrazione leucocita del muscolo Cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale

La lesione da ischemia-riperfusione renale è associata ad alta morbilità e mortalità nei pazienti ospedalizzati. Qui, presentiamo un modello murino semplice ed efficace di danno unilaterale da ischemia-riperfusione renale e forniamo una panoramica sequenziale dei cambiamenti patologici rappresentativi osservati nel rene.

Un modello murino efficace di danno unilaterale da ischemia-riperfusione renale

Il reclutamento di leucociti e piastrine costituisce una componente essenziale necessaria per l'efficace crescita delle arterie collaterali durante l'arteriogenesi. La microscopia multifotonica è uno strumento efficiente per tracciare la dinamica cellulare con alta risoluzione spazio-temporale in vivo e meno fototossicità per studiare il reclutamento e lo stravaso dei leucociti durante l'arteriogenesi.

Multiphoton Intravital Imaging per il monitoraggio del reclutamento dei leucociti durante l'arteriogenesi in un modello murino di arti posteriori

Il presente protocollo descrive un modello unico e clinicamente rilevante di arteriopatia periferica che combina l'elettrocoagulazione dell'arteria femorale e venosa con la somministrazione di un inibitore dell'ossido nitrico sintasi per indurre la cancrena degli arti posteriori nei topi FVB. La perfusione intracardiaca di DiI viene quindi utilizzata per l'imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad.

Imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad in un modello di cancrena posteriore murina

Questo protocollo presenta un metodo per indurre il danno da ischemia-riperfusione mesenterica e visualizzare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) nelle venule mesenteriche utilizzando la microscopia intravitale. Il flusso sanguigno nell'arteria mesenterica superiore è stato limitato per 1 ora, seguito da riperfusione, consentendo la quantificazione diretta dell'adesione leucocitaria e della NETosi.

Visualizzazione delle trappole extracellulari dei neutrofili nelle venule mesenteriche dopo danno da ischemia-riperfusione mesenterica tramite microscopia intravitale

Un sistema laser di contrasto speckle è stato utilizzato per monitorare le variazioni del flusso sanguigno microvascolare renale durante la ischemia-reperfusione unilaterale renale dopo la resezione del rene destro nei topi.

Perfusione microvascolare monitorata tramite imaging laser a contrasto speckle durante lesioni da ischemia-reperfusione renale nei topi

Impara la microscopia intravitale digitale per studiare le interazioni leucocito-endotelio durante l'ischemia-riperfusione nel muscolo cremasterico del ratto. Questo protocollo dettagliato permette l'osservazione in tempo reale dei meccanismi infiammatori.

In tempo reale Imaging digitale di leucociti-endotelio in ischemia-riperfusione (IRI) del muscolo Cremaster Rat

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