Name: Nano-Fem: la localizzazione delle proteine Usando Photo-attivato Microscopia Localizzazione e microscopia elettronica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Scopri la localizzazione delle proteine in micrografie elettroniche usando la microscopia a localizzazione fotoattivata e la microscopia elettronica a scansione. Questo metodo nano-FEM utilizza proteine fluorescenti codificate geneticamente in nematodi transgenici.

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Ringraziamo Harald Hess e Eric Betzig per l&#39;accesso al microscopio PALM per prova di principio esperimenti, Richard Fetter per la condivisione di protocolli di fissaggio, reagenti e incoraggiamento. Ringraziamo Michael Davidson, Geraldine Seydoux, Stefan Eimer, Rudolf Leube, Keith Nehrke, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema e Marc Hammarlund per costrutti di DNA. Ringraziamo anche Carl Zeiss Inc. per fornire l&#39;accesso alla Zeiss PAL-M, una versione beta del microscopio Zeiss ELYRA P.1 PALM.

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<li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+background-free%2C+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+%28SOFI%29%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li>
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<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
</ol>

Produzione e l&#39;accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Carl Zeiss, Inc.

Qui si descrive come conservare proteine ​​fluorescenti in plastica, localizzare le proteine ​​fluorescenti nelle sezioni, e l&#39;immagine della ultrastruttura usando la microscopia elettronica. Le proteine ​​sono state localizzate al di sotto del limite di diffrazione con il microscopio a PALM a risoluzione nanometrica. Per adattare questo protocollo ad esemplari particolari, i seguenti parametri devono essere considerati: fluoroforo, quantificazione, e l&#39;allineamento. La scelta della proteina fluorescente o fluoroforo organico dipende dall&#39;applicazione e il sistema modello. Abbiamo testato una varietà di proteine ​​fluorescenti, tra cui EGFP, YFP, Citrino, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA-mCherry e Dendra 12. La conservazione di fluorescenza da ciascun fluoroforo era simile, suggerendo che tutte le proteine ​​fluorescenti possono essere conservate con il metodo descritto. Abbiamo scelto tdEos perché esprime bene in C. elegans, proteine ​​è rimasto funzionale quando fusa tdEos, e perché la suafoto-attivazione caratteristiche erano ottimali per microscopia PALM. Tuttavia, l&#39;espressione non di aggregazione o tdEos è stata occasionalmente osservata 12. A seconda dell&#39;applicazione, un fluoroforo diverso può essere più adatto. In molti casi, non è necessario utilizzare una foto-activated proteina fluorescente. Semplice microscopia elettronica correlativa fluorescenza non richiede foto-activated proteina fluorescente. GFP o coloranti organici possono essere utilizzati per fluorescenza immagine da proteine ​​marcate in sezioni sopra il limite di diffrazione. Ad esempio, uno può immagine assone in un neuropilo utilizzando microscopia a fluorescenza e correlare il segnale di fluorescenza con un assone particolare in una micrografia elettronica da imaging la fluorescenza su un microscopio a fluorescenza. Altri super-risoluzione di tecniche, come la microscopia emissione stimolata esaurimento (STED) 12, stato di microscopia terra esaurimento seguita dal ritorno singola molecola (GSDIM) 13, emicroscopia illuminazione strutturata (SIM) 14, non necessitano di proteine ​​fluorescenti foto-attivati. Inoltre, super-risoluzione di tecniche di imaging che utilizzano coloranti organici 9,15,16 o la proprietà intrinseca di sonde fluorescenti 17 sono facilmente applicabili. In PALM, il numero di molecole può essere quantificata per fluorescenza di ogni molecola è separata spazialmente e temporalmente. Tuttavia, la quantificazione può essere fuorviante per quattro ragioni: ossidazione, sottostima, overcounting e sovraespressione. Primo, una frazione delle proteine ​​fluorescenti possono essere denaturato o ossidato durante l&#39;elaborazione del campione 5,12. Sebbene ~ 90% del segnale di fluorescenza è stata conservata attraverso fissazione e nell&#39;inclusione nel nostro protocollo, l&#39;ossidazione della proteina fluorescente può verificarsi dopo che il campione è stato sezionato e la superficie esposta all&#39;ossigeno. Secondo, l&#39;attivazione di foto-attivabili proteine ​​è stocastico, e quindi molecole multiple possono essereattivato in un luogo determinato diffrazione limitata 8. Fluorescenza dalle molecole multiple apparirà come un punto, e quindi il numero totale di proteine ​​verrà sottostimato. In terzo luogo, un problema simile può portare a overcounting. In PALM, ogni proteina fluorescente è localizzato e poi &quot;cancellato&quot; da sbiancamento. Tuttavia, le proteine ​​fluorescenti può tornare dallo stato buio senza essere sbiancato in modo permanente 18. Tali molecole saranno quindi contati più volte. Quarto, proteine ​​marcate sono espressi come transgeni e sono spesso presenti in più copie, che può portare a sovraespressione. Pertanto, quantificazione da PALM può essere usato per stimare ma non precisamente determinare il numero di molecole in una data posizione. L&#39;allineamento di un&#39;immagine PALM con un microscopio elettronico può essere difficile a causa della differenza risoluzione in microscopia ottica ed elettronica e la distorsione causata dal fascio di elettroni. Particelle d&#39;oro servono come strettamente localized marcatori di riferimento nel microscopio elettronico. Tuttavia, fluoresecence da particelle d&#39;oro non è foto-attivato, e si presenta come un grande diffrazione limitata spot. Pertanto, il posizionamento di una immagine di fluorescenza su un microscopio elettronico è una stima. Le distorsioni possono anche derivare da interazioni degli elettroni con la sezione di plastica. Resine acriliche GMA sono meno stabili sotto il fascio di elettroni, e le dimensioni della plastica può essere alterato. In queste circostanze, allineando la fluorescenza con ultrastruttura può richiedere trasformazione non lineare dei marker fiduciali.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente o attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Alta pressione freezer </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> EMPact e HPM 100 da Leica o HPF-01 da Wohlwend può anche essere usato. </td></tr><tr><td> Automatizzato congelamento unità sostituzione </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 può anche essere usato. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon e Vutara vendono anche microscopi PALM commerciali. </td></tr><tr><td> Microscopio elettronico a scansione </td><td> FEI </td><td> Nova nano </td><td> Altre alta risoluzione microscopi SEM può essere utilizzato. </td></tr><tr><td> Acetone </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459.844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osmio tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> Permanganato di potassio </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina da siero bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Acetato di uranile </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> pH di acetato di uranile da questa società è leggermente superiore. </td></tr><tr><td> Glicole metacrilato (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> Acido basso, grado TEM. </td></tr><tr><td> N, N-dimetil-p-toluidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo fiale </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Fiale di vetro </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar pellicola </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM capsula </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Polipropilene </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DISC pugni </td><td> Ted Pella </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> Nanoparticelle d&#39;oro </td><td> microsfere-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> Richiedi 2x soluzione concentrata </td></tr></tbody></table>

nano-fem: la localizzazione delle proteine ​​usando photo-attivato microscopia localizzazione e microscopia elettronica

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mappatura della distribuzione delle proteine ​​è essenziale per la comprensione della funzione delle proteine ​​in una cellula. Microscopia a fluorescenza è ampiamente utilizzato per la localizzazione delle proteine, ma il contesto subcellulare è spesso assente nelle immagini di fluorescenza. Immuno-microscopia elettronica, invece, può localizzare le proteine, ma la tecnica è limitata dalla mancanza di anticorpi compatibili, cattiva conservazione della morfologia e perché la maggior parte degli antigeni non sono esposti alla superficie del campione. Approcci correlativi in ​​grado di acquisire l&#39;immagine di fluorescenza da una cella tutta la prima, sia da immuno-fluorescenza o proteine ​​geneticamente marcate. Il campione viene poi fissate e incorporato per microscopia elettronica, e le immagini sono correlati 1-3. Tuttavia, l&#39;immagine a bassa risoluzione fluorescenza e la mancanza di marker fiduciali preclude la localizzazione precisa di proteine. In alternativa, l&#39;imaging di fluorescenza può essere fatta dopo preservare il campione in plastica. Inquesto approccio, il blocco viene sezionato, e immagini di fluorescenza e micrografie elettroniche della stessa sezione sono correlati 4-7. Tuttavia, il limite di diffrazione della luce dell&#39;immagine correlata oscura le posizioni delle singole molecole, e la fluorescenza estende spesso oltre il confine della cella. Nano-risoluzione fluorescenza microscopia elettronica (nano-FEM) è stato progettato per localizzare proteine ​​al nano-scala di imaging le stesse sezioni con foto-attivato microscopia localizzazione (PALM) e microscopia elettronica. PALM supera il limite di diffrazione di immagini singole proteine ​​fluorescenti e, successivamente, la mappatura del baricentro di ogni 8-10 spot fluorescente. Si delineano il nano-FEM tecnica in cinque fasi. Primo, il campione è fisso e incorporato utilizzando condizioni che preservano la fluorescenza di proteine ​​marcate. Secondo, i blocchi di resina sono sezionate in segmenti ultrasottili (70-80 nm) che sono montatisu un vetro di copertura. In terzo luogo, la fluorescenza è ripreso in queste sezioni utilizzando il microscopio PALM Zeiss. Quarto, elettroni strutture dense vengono esposte in queste sezioni stesse utilizzando un microscopio elettronico a scansione. In quinto luogo, le micrografie fluorescenza ed elettronica sono allineati con particelle d&#39;oro come marker fiduciali. In sintesi, la localizzazione subcellulare di proteine ​​fluorescenti con etichetta può essere determinato a risoluzione nanometrica in circa una settimana.

Descriviamo un metodo per localizzare fluorescente proteine ​​marcate nel microscopio elettronico. Fluorescenza viene prima localizzato con foto-attivato microscopia localizzazione su sezioni ultrasottili. Queste immagini vengono quindi allineati al microscopio elettronico della stessa sezione.

Nano-Fem: la localizzazione delle proteine ​​Usando Photo-attivato Microscopia Localizzazione e microscopia elettronica

Mappare la distribuzione delle proteine è essenziale per comprenderne la funzione all'interno di una cellula. La microscopia a fluorescenza è ampiamente utilizzata per...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è localizzare proteine e micrografie elettroniche mediante microscopia correlativa a fluorescenza e microscopia elettronica. Questo metodo, noto come nano FEM, viene utilizzato per localizzare proteine in C. elegans. In primo luogo, un verme transgenico che esprime l'istone TD eos viene incluso in plastica e sezionato.Ogni sezione viene analizzata sia mediante microscopia a localizzazione mediante attivazione fotochimica (PALM) che mediante microscopia elettronica a scansione. Le due microfotografie di ogni sezione vengono allineate utilizzando marcatori fiduciali tramite Photoshop. L'immagine correlative mostra la localizzazione delle molecole di istone nel nucleo.Il vantaggio principale della tecnica che descriveremo oggi consiste nell'utilizzo di fluorofori codificati geneticamente invece dell'immuno-EM, in modo che ogni proteina sia associata a una proteina fluorescente. Nell'immuno-EM, molti anticorpi non sono compatibili con le plastiche e, anche quando lo sono, non riescono a penetrare in profondità nella sezione dove si trovano gli antigeni.Utilizzando proteine fluorescenti, ogni proteina viene marcata con un fluorocromo. Oggi Shige WBI illustrerà questa tecnica. La seguente procedura verrà dimostrata impiegando nematodi transgenici che esprimono istoni marcati con la proteina fluorescente TDE os.Per questa dimostrazione, utilizzeremo batteri come crioprotettante, ma è possibile utilizzare anche BSA al 20% per la congelazione di sea elegance. Un'ora prima della sostituzione criogenica, riempire il dispositivo automatico per la sostituzione criogenica o un dispositivo FS con azoto liquido. Inoltre, in anticipo, preparare i fissativi necessari seguendo le istruzioni riportate nel documento allegato, conservare i fissativi in aliquote da un millilitro in provette criogeniche e collocarle in azoto liquido fino al momento dell'uso.Utilizzare un pennello per raccogliere gli animali da un prato batterico e trasferirli al fine di riempire un portacampioni da 100 micron. Riempire leggermente oltre il bordo per assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria. Una volta pronto, posizionare il portacampioni nell'apparato di un congelatore ad alta pressione per congelarlo. Successivamente, trasferire immediatamente il campione in un bagno di azoto liquido accanto alla camera di congelamento.Successivamente, utilizzando un'astina e una pinzetta, trasferire il campione in una provetta criogenica contenente fissativi. Assicurarsi che il campione rimanga sempre immerso nell'azoto liquido. Ripetere questa procedura per ogni campione, quindi trasferire tutte le provette criogeniche in un'unità FS.Dopo aver posizionato tutte le provette criogeniche nell'unità FS, avviare il programma. Il protocollo di congelamento ed elaborazione è mostrato in questo diagramma. Durante l'incubazione iniziale a meno 90 gradi Celsius, il ghiaccio vetreo viene sostituito con il fissativo in acetone.Successivamente, quando la temperatura del campione aumenta, il fissativo nell'acetone liquido crea legami incrociati con il campione per preservarne la struttura. Quando la temperatura in un'unità FS raggiunge i meno 60 gradi Celsius, posizionare nei vial per scintillazione contenenti 20 millilitri di acetone al 95% all'interno dell'unità FS per raffreddarli. Poi, quando la temperatura raggiunge i meno 50 gradi Celsius, utilizzare una pipetta Pasteur con una punta P200 per rimuovere il fissativo e aggiungere circa un millilitro di acetone al 95% pre-raffreddato a ciascun campione.Bile.Ripetere questo processo ogni 20 minuti per due ore. Inoltre, durante l'incubazione a meno 50 gradi Celsius, collocare un vial di scintillazione contenente 20 millilitri di acetato urinario 0,1% in acetone al 95% all'interno di una camera FS per preraffreddarlo a meno 50 gradi Celsius. Successivamente, dopo l'ultimo lavaggio con acetone, aggiungere circa un millilitro di soluzione di acetato urinario in ogni vial per colorare il campione ed evidenziare il contrasto della membrana.Se il programma è stato interrotto, riavviarlo. Quando la temperatura raggiunge meno 40 gradi Celsius, posizionare vial per scintillazione contenenti etanolo al 95% nella camera FS. Quando la temperatura raggiunge meno 30 gradi Celsius, utilizzare una pipetta di Pasteur per sostituire l'acetato di uranile con etanolo al 95% ogni 20 minuti per due ore.È importante utilizzare etanolo in questo passaggio poiché la resina non polimerizza in presenza di acetone. Nella parte successiva del protocollo, i campioni vengono inclusi in plastica mentre si trovano a meno 30 gradi Celsius. In un FS, sostituire l'etanolo al 95% con resina pre-raffreddata al 30% di glicol metacrilato o GMA in etanolo al 95%; dopo tre-cinque ore, sostituire la GMA al 30% con GMA al 70%; dopo quattro-sei ore, rimuovere la GMA al 70% e incubare i campioni in GMA al 97% durante la notte.L'aumento progressivo della concentrazione di GMA permette la penetrazione del mezzo nei tessuti. Si noti che, poiché viene aggiunto il 3% di acqua alla resina GMA, il GMA al 97% non viene diluito. Il giorno successivo con etanolo, trasferire i campioni in uno stampo per inclusione nell'A FS utilizzando una pipetta di Pasteur; posizionare i campioni nello stampo per inclusione, quindi sostituire il GMA al 97% con GMA appena preparato per tre volte nell'arco di sei ore a meno 30 gradi Celsius.Dopo il terzo scambio, battere leggermente sulla matrice batterica per separare il campione dal crioprotettore. Aggiungere l'iniziatore nn dimetil udina al 97% GMA in una provetta ventilata. La quantità di iniziatore aggiunta è di 1,5 microlitri per ogni millilitro di GMA; aggiungere immediatamente la soluzione di GMA in ciascuno stampo per inclusione e posizionare gli animali nello stampo in modo che siano equidistanti tra loro.Riavviare il programma in modo che la temperatura aumenti a meno 20 gradi Celsius. Sebbene la resina polimerizzi rapidamente entro un'ora, lasciare indurire la plastica tutta la notte a meno 20 gradi Celsius, per assicurarsi che la polimerizzazione sia completa.Dopo che la plastica si è polimerizzata, conservare il campione in un sacchetto sottovuoto riempito con gas azoto a meno 20 gradi Celsius. Il taglio dei campioni inclusi in GMA deve quindi essere eseguito come descritto nel documento allegato per la microscopia di localizzazione attivata da luce o l’imaging palm. Il sistema microscopico deve essere configurato con la camera E-M-C-C-D impostata a meno 70 gradi Celsius o inferiore.Utilizzando una pipetta, applicare circa 50 microlitri di particelle d'oro da 100 nanometri a una concentrazione di 1 × 10¹⁰ particelle per millilitro in soluzione sul campione da analizzare. Posizionare una custodia nera sopra i campioni e lasciare riposare la soluzione per 30 secondi sul vetrino. Per rimuovere la soluzione d'oro, spingerla verso il bordo del vetrino e assorbirla con un fazzoletto di carta assorbente.Quindi applicare grasso da vuoto su un portaoggetti circolare e inserire il coprioggetto. Applicare olio di immersione sulla superficie inferiore del coprioggetto. Posizionarlo direttamente al di sotto del campione.Inserire il portacampioni nella fessura della piastra del microscopio e regolarlo in modo che sia ben stretto e centri le sezioni sopra l'obiettivo. Prestare particolare attenzione a non toccare gli obiettivi. Successivamente, utilizzando l'illuminazione in campo chiaro, localizzare le sezioni mediante un obiettivo da 10 x.Quindi passare all'obiettivo con ingrandimento 100x e mettere a fuoco il campione. Se necessario, passare all'illuminazione in fluorescenza utilizzando il laser a 488 nanometri con l'intensità impostata al 10%. Attendere cinque minuti affinché la temperatura del campione raggiunga l'equilibrio. Successivamente, identificare le regioni con la fluorescenza più intensa e portarle a fuoco.Passare ai laser a 561 nanometri e aumentare l'intensità al 100%. Per eliminare la fluorescenza di fondo, sottoporre il campione a fotobleaching per circa due minuti. Se durante il fotobleaching cambia il fuoco, attendere cinque minuti prima di regolare il fuoco e acquisire le immagini. Al termine del fotobleaching, attivare il laser a 405 nanometri e impostarlo all'intensità più bassa.Iniziare ad acquisire le immagini a 20 fotogrammi al secondo. Acquisire un numero sufficiente di fotogrammi per raggiungere l'obiettivo dell'esperimento. Vengono acquisiti da 5.000 a 6.000 fotogrammi per determinare la localizzazione di 584 proteine istoniche all'interno di un nucleo.Dopo aver raccolto 5.000 fotogrammi, tutte le molecole vengono identificate e mappate dal software di imaging. L'immagine finale di fluorescenza, o cosiddetta immagine some turf, è un composito di tutta la fluorescenza rilevata dalla telecamera. Al contrario, l'immagine palm mappa l'OID di ogni punto fluorescente e indica soltanto la posizione di ciascuna proteina.Prima dell'analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM), colorare i preparati con acetato di uranile al 2,5% in acqua per quattro minuti. Rimuovere accuratamente l'acetato di uranile con acqua Milli-Q filtrata. Dopo l'essiccazione dei preparati, rivestire il vetrino con uno strato di carbonio mediante sputtering, fino a quando non diventa sufficientemente scuro.Applicare un nastro conduttivo al carbonio sul bordo del vetrino coprioggetto a un'estremità e sul supporto metallico all'altra estremità, in modo che gli elettroni che si accumulano sulla superficie del vetrino coprioggetto vengano messi a terra. Montare il vetrino coprioggetto nella camera del microscopio elettronico a scansione (SEM) e individuare il campione al microscopio. Acquisire un'immagine a basso ingrandimento del campione, quindi ingrandire l'area di interesse ed ottenere immagini ad alto ingrandimento.Ripetere questo processo con una nuova sezione fino a quando tutte le sezioni sono state acquisite. Successivamente, è necessario allineare le immagini palmari e al microscopio elettronico. Per fare ciò, aprire innanzitutto le immagini SEM acquisite in Photoshop.Crea una nuova finestra con dimensioni di 5.000 per 5.000 pixel e una risoluzione di 300 pixel per pollice. Copia l'immagine SEM ad alto ingrandimento nella nuova finestra. Utilizza il comando di trasformazione libera presente nel menu modifica per ridimensionare l'immagine in modo che riempia l'intera finestra.Quindi copiare le immagini SEM ad alta magnificazione e ridimensionarle e trasformarle secondo necessità. Selezionare la rotazione dell'immagine dalla barra del menu a discesa dell'immagine e capovolgere orizzontalmente l'immagine somma del manto erboso. Copiare e incollare l'immagine somma del manto erboso in un nuovo livello.Utilizzare il comando di trasformazione libera presente nel menu modifica per ridimensionare l'immagine in modo che sia approssimativamente delle stesse dimensioni del micrografo elettronico a bassa magnificazione. Ruotare quindi l'immagine secondo necessità per allineare la fluorescenza delle particelle d'oro con le corrispondenti strutture visualizzate al SEM. Successivamente, copiare l'immagine del palmo in un nuovo livello ed applicare la stessa trasformazione per estrarre un'immagine ad alta magnificazione.Effettuare lo zoom sulla regione di interesse e copiare l'immagine del palmo da tale regione. Incollare l'immagine in un'immagine SEM ad alta risoluzione per la presentazione. Deve essere applicata una trasparenza a gradiente all'immagine del palmo in modo che diventi trasparente solo lo sfondo nero, mentre i segnali del palmo rimangono visibili.Copiare l'immagine del palmo trasformata in un nuovo livello. Selezionare i segnali del palmo ma non lo sfondo utilizzando l'opzione "Intervallo colore" nel menu a discesa "Seleziona". Quindi selezionare un pixel dello sfondo come riferimento e attivare l'opzione di inversione.Tagliare i segnali della palma desiderati e incollarli in un nuovo livello. Applicare la trasparenza al livello di sfondo e impostarla al 10%. Questo consente la visualizzazione dei segnali della palma rendendo trasparente lo sfondo senza comprometterne l'intensità. Proteina istonica.Il TD eos marcato con il tag 11 è stato espresso stabilmente nel nematode C. elegans e gli animali transgenici sono stati processati e analizzati mediante il protocollo descritto in questo video. Micrografie ottenute con microscopio a fluorescenza e microscopio elettronico sono state acquisite dalla stessa sezione. Le nanoparticelle d'oro, visibili sia nelle micrografie a fluorescenza che in quelle elettroniche, sono state quindi utilizzate per allineare le due immagini.Qui eseguiamo uno zoom su una regione vicina all'estremità superiore della microfotografia. Come si può vedere, dettagli subcellulari come un nucleo.È possibile osservare un nucleo, pori nucleari e reticolo endoplasmatico. Tuttavia, le molecole di istone marcate sono localizzate esclusivamente nel nucleo, ma non nel nucleo. Come previsto, la microscopia palm correlativa ed elettronica consente quindi la localizzazione delle proteine con la massima risoluzione. Dopo aver eseguito questa procedura, è possibile prendere queste sezioni con la distribuzione delle proteine e sovrapporle mediante tomografia ad array, in modo da generare una struttura tridimensionale che mostra la distribuzione delle proteine all'interno della cellula.Ricordare che, quando si utilizza l'osmio tetrossido, si tratta di un prodotto chimico molto pericoloso e si devono sempre indossare guanti.

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Questo video descrive BiFC-PALM - una combinazione di microscopia di localizzazione fotoattivata e complementazione a fluorescenza bimolecolare - per valutare le interazioni proteina-proteina. La BiFC prevede la fusione di due frammenti proteici fluorescenti con due proteine di interesse interagenti. Quando le due proteine interagiscono, i frammenti vengono portati in prossimità, il che consente alle due parti di unirsi e ricostituire una proteina fluorescente funzionale. La fluorescenza di un...

Microscopia di localizzazione fotoattivata accoppiata a complementazione a fluorescenza bimolecolare

Dimostriamo l'uso della microscopia di localizzazione per fotoattivazione a fluorescenza (FPALM) per visualizzare simultaneamente più tipi di molecole marcate in fluorescenza all'interno delle cellule. Le tecniche descritte producono la localizzazione di migliaia o centinaia di migliaia di singole proteine marcate con fluorescenza, con una precisione di decine di nanometri all'interno di singole cellule.

Imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza

Fotoattivati ​​microscopia localizzazione (PALM) in combinazione con inseguimento singola molecola permette l'osservazione diretta e la quantificazione delle interazioni proteina-DNA in cellule di Escherichia coli vive.

Visualizzare le interazioni proteina-DNA in cellule vive batteriche Uso fotoattivati ​​singola molecola di monitoraggio

Fluorofori singoli possono essere localizzati con precisione nanometrica utilizzando FIONA. Ecco un riassunto della tecnica FIONA è segnalato, e come condurre esperimenti Fiona è descritto.

Imaging di fluorescenza con One nanometri Precisione (FIONA)

Le interazioni proteina-proteina vengono visualizzate in cellule con risoluzione spaziale nanometrica combinando la complementazione a fluorescenza bimolecolare (BiFC) con la microscopia a localizzazione fotoattivata (PALM). Qui viene descritto l'uso di BiFC-PALM per l'imaging delle interazioni Ras-Raf nelle cellule U2OS per visualizzare il clustering e la diffusione su scala nanometrica di singoli complessi Ras-Raf.

Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

Qui illustriamo come microscopia di localizzazione foto-attivata di singola molecola può essere effettuata sul terminale del nervo motore di un live Drosophila melanogaster terzo instar larva.

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

Descriviamo come tecniche di micro - e photomanipulation come FRAP e fotoattivazione permettono la determinazione dei parametri di motilità e la dinamica spazio-temporale delle proteine all'interno di migrazione delle cellule. Letture sperimentali includono subcellulare dinamiche e fatturato dei regolatori della motilità o del citoscheletro di actina sottostante.

Tecniche di micromanipolazione che consente analisi delle dinamiche morfogenetiche e fatturato dei regolatori del citoscheletro

Qui, presentiamo un protocollo per la localizzazione di multi-colore delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule vive. Per allegare fluorofori, proteine self-etichettatura sono usate. Proteine, trova in scomparti di diverse membrane dell'organello stesso, possono essere localizzati con una precisione di ~ 18 nm.

Microscopia di multi-colore localizzazione delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule di mammiferi dal vivo

Questo protocollo descrive il metodo cryoAPEX, in cui una proteina della membrana marcata APEX2 può essere localizzata mediante microscopia elettronica di trasmissione all'interno di ultrastruttura cellulare conservata in modo ottimale.

Il metodo CryoAPEX per l'analisi della microscopia elettronica della localizzazione delle proteine membrana all'interno delle cellule ultrastrutturalizzate

Il presente protocollo descrive una tecnologia di marcatura al microscopio elettronico clonabile per rilevare proteine marcate con metallotioneina nelle cellule utilizzando una nuova tecnica di sintesi di nanoparticelle d'oro basata sul meccanismo di soppressione dell'autonucleazione.

Sintesi diretta di nanoparticelle d'oro EM-visibili nelle cellule per l'analisi della localizzazione delle proteine con ultrastruttura ben conservata

Scopri la localizzazione delle proteine in micrografie elettroniche usando la microscopia a localizzazione fotoattivata e la microscopia elettronica a scansione. Questo metodo nano-FEM utilizza proteine fluorescenti codificate geneticamente in nematodi transgenici.

Nano-Fem: la localizzazione delle proteine ​​Usando Photo-attivato Microscopia Localizzazione e microscopia elettronica

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