Nano-Fem: la localizzazione delle proteine ​​Usando Photo-attivato Microscopia Localizzazione e microscopia elettronica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è localizzare proteine e micrografie elettroniche mediante microscopia correlativa a fluorescenza e microscopia elettronica. Questo metodo, noto come nano FEM, viene utilizzato per localizzare proteine in C. elegans. In primo luogo, un verme transgenico che esprime l'istone TD eos viene incluso in plastica e sezionato.

Ogni sezione viene analizzata sia mediante microscopia a localizzazione mediante attivazione fotochimica (PALM) che mediante microscopia elettronica a scansione. Le due microfotografie di ogni sezione vengono allineate utilizzando marcatori fiduciali tramite Photoshop. L'immagine correlative mostra la localizzazione delle molecole di istone nel nucleo.

Il vantaggio principale della tecnica che descriveremo oggi consiste nell'utilizzo di fluorofori codificati geneticamente invece dell'immuno-EM, in modo che ogni proteina sia associata a una proteina fluorescente. Nell'immuno-EM, molti anticorpi non sono compatibili con le plastiche e, anche quando lo sono, non riescono a penetrare in profondità nella sezione dove si trovano gli antigeni.

Utilizzando proteine fluorescenti, ogni proteina viene marcata con un fluorocromo. Oggi Shige WBI illustrerà questa tecnica. La seguente procedura verrà dimostrata impiegando nematodi transgenici che esprimono istoni marcati con la proteina fluorescente TDE os.

Per questa dimostrazione, utilizzeremo batteri come crioprotettante, ma è possibile utilizzare anche BSA al 20% per la congelazione di sea elegance. Un'ora prima della sostituzione criogenica, riempire il dispositivo automatico per la sostituzione criogenica o un dispositivo FS con azoto liquido. Inoltre, in anticipo, preparare i fissativi necessari seguendo le istruzioni riportate nel documento allegato, conservare i fissativi in aliquote da un millilitro in provette criogeniche e collocarle in azoto liquido fino al momento dell'uso.

Utilizzare un pennello per raccogliere gli animali da un prato batterico e trasferirli al fine di riempire un portacampioni da 100 micron. Riempire leggermente oltre il bordo per assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria. Una volta pronto, posizionare il portacampioni nell'apparato di un congelatore ad alta pressione per congelarlo. Successivamente, trasferire immediatamente il campione in un bagno di azoto liquido accanto alla camera di congelamento.

Successivamente, utilizzando un'astina e una pinzetta, trasferire il campione in una provetta criogenica contenente fissativi. Assicurarsi che il campione rimanga sempre immerso nell'azoto liquido. Ripetere questa procedura per ogni campione, quindi trasferire tutte le provette criogeniche in un'unità FS.

Dopo aver posizionato tutte le provette criogeniche nell'unità FS, avviare il programma. Il protocollo di congelamento ed elaborazione è mostrato in questo diagramma. Durante l'incubazione iniziale a meno 90 gradi Celsius, il ghiaccio vetreo viene sostituito con il fissativo in acetone.

Successivamente, quando la temperatura del campione aumenta, il fissativo nell'acetone liquido crea legami incrociati con il campione per preservarne la struttura. Quando la temperatura in un'unità FS raggiunge i meno 60 gradi Celsius, posizionare nei vial per scintillazione contenenti 20 millilitri di acetone al 95% all'interno dell'unità FS per raffreddarli. Poi, quando la temperatura raggiunge i meno 50 gradi Celsius, utilizzare una pipetta Pasteur con una punta P200 per rimuovere il fissativo e aggiungere circa un millilitro di acetone al 95% pre-raffreddato a ciascun campione.Bile.

Ripetere questo processo ogni 20 minuti per due ore. Inoltre, durante l'incubazione a meno 50 gradi Celsius, collocare un vial di scintillazione contenente 20 millilitri di acetato urinario 0,1% in acetone al 95% all'interno di una camera FS per preraffreddarlo a meno 50 gradi Celsius. Successivamente, dopo l'ultimo lavaggio con acetone, aggiungere circa un millilitro di soluzione di acetato urinario in ogni vial per colorare il campione ed evidenziare il contrasto della membrana.

Se il programma è stato interrotto, riavviarlo. Quando la temperatura raggiunge meno 40 gradi Celsius, posizionare vial per scintillazione contenenti etanolo al 95% nella camera FS. Quando la temperatura raggiunge meno 30 gradi Celsius, utilizzare una pipetta di Pasteur per sostituire l'acetato di uranile con etanolo al 95% ogni 20 minuti per due ore.

È importante utilizzare etanolo in questo passaggio poiché la resina non polimerizza in presenza di acetone. Nella parte successiva del protocollo, i campioni vengono inclusi in plastica mentre si trovano a meno 30 gradi Celsius. In un FS, sostituire l'etanolo al 95% con resina pre-raffreddata al 30% di glicol metacrilato o GMA in etanolo al 95%; dopo tre-cinque ore, sostituire la GMA al 30% con GMA al 70%; dopo quattro-sei ore, rimuovere la GMA al 70% e incubare i campioni in GMA al 97% durante la notte.

L'aumento progressivo della concentrazione di GMA permette la penetrazione del mezzo nei tessuti. Si noti che, poiché viene aggiunto il 3% di acqua alla resina GMA, il GMA al 97% non viene diluito. Il giorno successivo con etanolo, trasferire i campioni in uno stampo per inclusione nell'A FS utilizzando una pipetta di Pasteur; posizionare i campioni nello stampo per inclusione, quindi sostituire il GMA al 97% con GMA appena preparato per tre volte nell'arco di sei ore a meno 30 gradi Celsius.

Dopo il terzo scambio, battere leggermente sulla matrice batterica per separare il campione dal crioprotettore. Aggiungere l'iniziatore nn dimetil udina al 97% GMA in una provetta ventilata. La quantità di iniziatore aggiunta è di 1,5 microlitri per ogni millilitro di GMA; aggiungere immediatamente la soluzione di GMA in ciascuno stampo per inclusione e posizionare gli animali nello stampo in modo che siano equidistanti tra loro.

Riavviare il programma in modo che la temperatura aumenti a meno 20 gradi Celsius. Sebbene la resina polimerizzi rapidamente entro un'ora, lasciare indurire la plastica tutta la notte a meno 20 gradi Celsius, per assicurarsi che la polimerizzazione sia completa.

Dopo che la plastica si è polimerizzata, conservare il campione in un sacchetto sottovuoto riempito con gas azoto a meno 20 gradi Celsius. Il taglio dei campioni inclusi in GMA deve quindi essere eseguito come descritto nel documento allegato per la microscopia di localizzazione attivata da luce o l’imaging palm. Il sistema microscopico deve essere configurato con la camera E-M-C-C-D impostata a meno 70 gradi Celsius o inferiore.

Utilizzando una pipetta, applicare circa 50 microlitri di particelle d'oro da 100 nanometri a una concentrazione di 1 × 10¹⁰ particelle per millilitro in soluzione sul campione da analizzare. Posizionare una custodia nera sopra i campioni e lasciare riposare la soluzione per 30 secondi sul vetrino. Per rimuovere la soluzione d'oro, spingerla verso il bordo del vetrino e assorbirla con un fazzoletto di carta assorbente.

Quindi applicare grasso da vuoto su un portaoggetti circolare e inserire il coprioggetto. Applicare olio di immersione sulla superficie inferiore del coprioggetto. Posizionarlo direttamente al di sotto del campione.

Inserire il portacampioni nella fessura della piastra del microscopio e regolarlo in modo che sia ben stretto e centri le sezioni sopra l'obiettivo. Prestare particolare attenzione a non toccare gli obiettivi. Successivamente, utilizzando l'illuminazione in campo chiaro, localizzare le sezioni mediante un obiettivo da 10 x.

Quindi passare all'obiettivo con ingrandimento 100x e mettere a fuoco il campione. Se necessario, passare all'illuminazione in fluorescenza utilizzando il laser a 488 nanometri con l'intensità impostata al 10%. Attendere cinque minuti affinché la temperatura del campione raggiunga l'equilibrio. Successivamente, identificare le regioni con la fluorescenza più intensa e portarle a fuoco.

Passare ai laser a 561 nanometri e aumentare l'intensità al 100%. Per eliminare la fluorescenza di fondo, sottoporre il campione a fotobleaching per circa due minuti. Se durante il fotobleaching cambia il fuoco, attendere cinque minuti prima di regolare il fuoco e acquisire le immagini. Al termine del fotobleaching, attivare il laser a 405 nanometri e impostarlo all'intensità più bassa.

Iniziare ad acquisire le immagini a 20 fotogrammi al secondo. Acquisire un numero sufficiente di fotogrammi per raggiungere l'obiettivo dell'esperimento. Vengono acquisiti da 5.000 a 6.000 fotogrammi per determinare la localizzazione di 584 proteine istoniche all'interno di un nucleo.

Dopo aver raccolto 5.000 fotogrammi, tutte le molecole vengono identificate e mappate dal software di imaging. L'immagine finale di fluorescenza, o cosiddetta immagine some turf, è un composito di tutta la fluorescenza rilevata dalla telecamera. Al contrario, l'immagine palm mappa l'OID di ogni punto fluorescente e indica soltanto la posizione di ciascuna proteina.

Prima dell'analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM), colorare i preparati con acetato di uranile al 2,5% in acqua per quattro minuti. Rimuovere accuratamente l'acetato di uranile con acqua Milli-Q filtrata. Dopo l'essiccazione dei preparati, rivestire il vetrino con uno strato di carbonio mediante sputtering, fino a quando non diventa sufficientemente scuro.

Applicare un nastro conduttivo al carbonio sul bordo del vetrino coprioggetto a un'estremità e sul supporto metallico all'altra estremità, in modo che gli elettroni che si accumulano sulla superficie del vetrino coprioggetto vengano messi a terra. Montare il vetrino coprioggetto nella camera del microscopio elettronico a scansione (SEM) e individuare il campione al microscopio. Acquisire un'immagine a basso ingrandimento del campione, quindi ingrandire l'area di interesse ed ottenere immagini ad alto ingrandimento.

Ripetere questo processo con una nuova sezione fino a quando tutte le sezioni sono state acquisite. Successivamente, è necessario allineare le immagini palmari e al microscopio elettronico. Per fare ciò, aprire innanzitutto le immagini SEM acquisite in Photoshop.

Crea una nuova finestra con dimensioni di 5.000 per 5.000 pixel e una risoluzione di 300 pixel per pollice. Copia l'immagine SEM ad alto ingrandimento nella nuova finestra. Utilizza il comando di trasformazione libera presente nel menu modifica per ridimensionare l'immagine in modo che riempia l'intera finestra.

Quindi copiare le immagini SEM ad alta magnificazione e ridimensionarle e trasformarle secondo necessità. Selezionare la rotazione dell'immagine dalla barra del menu a discesa dell'immagine e capovolgere orizzontalmente l'immagine somma del manto erboso. Copiare e incollare l'immagine somma del manto erboso in un nuovo livello.

Utilizzare il comando di trasformazione libera presente nel menu modifica per ridimensionare l'immagine in modo che sia approssimativamente delle stesse dimensioni del micrografo elettronico a bassa magnificazione. Ruotare quindi l'immagine secondo necessità per allineare la fluorescenza delle particelle d'oro con le corrispondenti strutture visualizzate al SEM. Successivamente, copiare l'immagine del palmo in un nuovo livello ed applicare la stessa trasformazione per estrarre un'immagine ad alta magnificazione.

Effettuare lo zoom sulla regione di interesse e copiare l'immagine del palmo da tale regione. Incollare l'immagine in un'immagine SEM ad alta risoluzione per la presentazione. Deve essere applicata una trasparenza a gradiente all'immagine del palmo in modo che diventi trasparente solo lo sfondo nero, mentre i segnali del palmo rimangono visibili.

Copiare l'immagine del palmo trasformata in un nuovo livello. Selezionare i segnali del palmo ma non lo sfondo utilizzando l'opzione "Intervallo colore" nel menu a discesa "Seleziona". Quindi selezionare un pixel dello sfondo come riferimento e attivare l'opzione di inversione.

Tagliare i segnali della palma desiderati e incollarli in un nuovo livello. Applicare la trasparenza al livello di sfondo e impostarla al 10%. Questo consente la visualizzazione dei segnali della palma rendendo trasparente lo sfondo senza comprometterne l'intensità. Proteina istonica.

Il TD eos marcato con il tag 11 è stato espresso stabilmente nel nematode C. elegans e gli animali transgenici sono stati processati e analizzati mediante il protocollo descritto in questo video. Micrografie ottenute con microscopio a fluorescenza e microscopio elettronico sono state acquisite dalla stessa sezione. Le nanoparticelle d'oro, visibili sia nelle micrografie a fluorescenza che in quelle elettroniche, sono state quindi utilizzate per allineare le due immagini.

Qui eseguiamo uno zoom su una regione vicina all'estremità superiore della microfotografia. Come si può vedere, dettagli subcellulari come un nucleo.

È possibile osservare un nucleo, pori nucleari e reticolo endoplasmatico. Tuttavia, le molecole di istone marcate sono localizzate esclusivamente nel nucleo, ma non nel nucleo. Come previsto, la microscopia palm correlativa ed elettronica consente quindi la localizzazione delle proteine con la massima risoluzione. Dopo aver eseguito questa procedura, è possibile prendere queste sezioni con la distribuzione delle proteine e sovrapporle mediante tomografia ad array, in modo da generare una struttura tridimensionale che mostra la distribuzione delle proteine all'interno della cellula.

Ricordare che, quando si utilizza l'osmio tetrossido, si tratta di un prodotto chimico molto pericoloso e si devono sempre indossare guanti.