Name: Generazione di topi derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Scopri come generare topi adulti da cellule staminali pluripotenti indotte mediante complementazione di embrioni tetraploidi. Questo metodo valida la piena pluripotenzialità delle linee iPSC per la biologia dello sviluppo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Sostegno alla KKB, MJB, JLH e KLN sono state fornite dal California Institute per la medicina rigenerativa, la Pew Charitable Trusts Programma biomedica studiosi, il Esther B. O&#39;Keeffe Family Foundation e la Fondazione Famiglia Shapiro. KKB è un E. Donald e Delia B. Baxter Foundation Facoltà Scholar.

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in Boland et al. Nature. 461, 91-96 (2009). 1 1. Preparazione di Lentivirus Questo protocollo impiega doxiciclina inducibili vettori shuttle lentivirali che codificano per Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc sotto il controllo di un elemento di risposta tetO. Transgeni vengono attivati ​​dal inverso tetraciclina trans-proteina attivante, rtTAM2.2 16, che induce l&#39;espressione fattore riprogrammazione in presenza di doxiciclina. Questo sistema permette strettamente controllata, alta espressione di fattori di riprogrammazione. I vettori lentivirali qui utilizzati sono auto-inattivanti e quindi non può replicare seguente integrazione genomica. Tuttavia, è necessaria cautela quando si lavora con lentivirus e devono essere eseguite in laboratori conformi con BSL2 (USA) e S2 (Europa) standard. <ol><li> Scongelare HEK293T cellule e il passaggio almeno una volta prima tradinsfection. Cellule deve essere mantenuta a densità media subconfluente in HEK a 37 ° C, 5% di CO 2 in un ambiente umidificato. Di routine delle cellule di passaggio ogni 2 giorni con un rapporto di divisione di 1:06-01:10. </li><li> Seed ~ 8 x 10 6 HEK293T cells/T150 con 25 ml di terreno HEK. Utilizzare una T150 per ciascun preparato lentivirus. </li><li> Il giorno dopo HEK293T cellule trasfezione di precipitazione di fosfato di calcio. (Nota: nelle nostre mani precipitazione di fosfato di calcio provoca abitualmente in efficienza di trasfezione 80-90%, tuttavia, lipidi cationici reagenti di trasfezione come Lipofectamine 2000 può anche essere utilizzato). Preparare due provette da 15 ml coniche per ogni virus di essere preparati. Etichettare le provette &quot;A&quot; e &quot;B&quot;. Un tubo, 10 ug di ciascuno di: i lentivirali navetta fattori vettore codificante riprogrammazione (o rtTAM2.2), i vettori virali confezionamento, e plasmide codificante la proteina di rivestimento virale, VSVG. Aggiungere 186 microlitri 2 M CaCl 2 al tubo A, e portare il volume a 1,5 ml sterile con H 2 O. Tubo B: 1,5 ml 2x HBS (pre-riscaldato a temperatura ambiente). </li><li> Pipettare la miscela nella provetta A finché è una soluzione omogenea. Aggiungere la soluzione A alla soluzione B goccia a goccia e lasciare riposare a temperatura ambiente per 2-3 minuti. </li><li> Aspirare il terreno di crescita delle cellule HEK293T e sostituire con 22 ml di pre-riscaldato a medio HEK senza penicillina e streptomicina. </li><li> Pipettare combinato soluzioni AB (fosfato di calcio precipitato) direttamente HEK293T cellule e distribuire in modo uniforme da dolce dondolio. </li><li> 24 ore dopo la trasfezione di cellule HEK-293T con lentivirus, rimuovere mezzo di crescita e sostituirla con 25 ml di fresco, pre-riscaldata medio HEK. Ritorno Heks transfettate per l&#39;incubatrice. </li><li> 48 ore dopo la trasfezione di cellule HEK-293T con lentivirus, raccogliere mezzi di crescita contenenti particelle lentivirali dalle Heks transfettate. Rimuovere residui di particolato dalla soluzione virale raccolte mediante centrifugazione a 3000 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Concentrato virus mediante ultracentrifugazione through un cuscino di saccarosio al 20% (2 ml sucrose/25 surnatante virale ml) per 2 ore a 112.000 xg a 4 ° C. Sospendere virale pellet in 0,4 ml di mezzo MEF a 4 ° C per 15-30 min con il dolce dondolio. Conservare particelle virali in varie porzioni monouso (ad esempio 50 ml) a -80 ° C. </li></ol> 2. Preparazione del mouse fibroblasti embrionali (MEF) per la riprogrammazione Nota: il protocollo descritto qui riguarda la derivazione di iPSCs da E 13,5 fibroblasti embrionali di topo per l&#39;uso in test TEC. Mentre altri gruppi hanno generato tutto IPSC topi da fonti adulti cellula donatrice, non abbiamo testato questo metodo su altri tipi di cellule e non può essere certo che tipo di cellula del donatore non è un fattore. <ol><li> Impostazione del mouse accoppiamenti a tempo. Il giorno embrionale 13.5 (E13.5), l&#39;eutanasia la femmina incinta e sezionare gli embrioni dalle corna uterine. Luogo e conservare embrioni in 1x PBS (pre-refrigerato a 4 ° C) su ghiaccio. </li><li> Rimuovere i tessuti extraembrionali (vale a direcorion, amnios e placenta). Decapitare l&#39;embrione e togliere la coda (opzionale - se necessario per la genotipizzazione) e degli arti. Scoop fuori gli organi interni, pinze utilizzando o una spatola a forma di cucchiaio e tritare la carcassa rimanente con la lama di un bisturi o taglienti forbici. </li><li> Lavare la carcassa tritata in 5 ml di pre-refrigerata 1x PBS. Centrifugare a 200 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante. Sospendere pellet in 5 ml 0,25% tripsina-EDTA e incubare a 37 ° C con agitazione vigorosa per 20-30 min. </li><li> Aggiungere 5 ml di MEF medie (pre-riscaldato a 37 ° C), mescolare e centrifugare a 200 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere pellet in pre-riscaldato media MEF. </li><li> Piastra MEFs dissociato in 2-3 pozzetti di una piastra da 6 pozzetti pre-rivestiti con 0,1% di gelatina. Questo è considerato passaggio 1. </li><li> MEFs passaggio ad una diluizione di 1:04-01:05 ogni 48 ore. MEF al passaggio 3 sono pronti per la trasduzione lentivirali. </li></ol> 3. Derivazione di linee IPSC <ol><li> Il giorno prima trasduzione lentivirale; seme ~ 3 x 10 5 MEFs primario in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti pre-rivestiti con 0,1% di gelatina. </li><li> 1 ° giorno: MEF primaria dovrebbe essere 80-90% confluenti per la trasduzione lentivirali. Aggiungi particelle lentivirali direttamente al MEF media e incubare con una notte a 37 MEF ° C, 5% di CO 2 in un ambiente umidificato. </li><li> Il giorno successivo (giorno 2) aspirare il terreno e lavare due volte con 3 ml di PBS 1x per rimuovere particelle virali. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di pre-riscaldato 0,25% tripsina-EDTA alle cellule e incubare a 37 ° C per 3-5 min con dondolo occasionale. </li><li> Triturate per ottenere una cella singola sospensione. Osservare le cellule al microscopio ottico per garantire una sospensione singola cella. </li><li> Trasferimento MEF in una provetta da 15 ml conica contenente 5 ml supporti MEF. Centrifugare a 200 xg per 5 min. Aspirare le cellule surnatante e risospendere delicatamente in mezzo MEF. </li><li> Uniformemente dividere la sospensione cellulare tra due pozzetti di un 6 e pritardo pre-rivestito con 0,1% di gelatina. </li><li> Oscillare la piastra avanti e indietro, lato a lato, e una volta in un movimento circolare per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule in tutto il pozzetto. Incubare per una notte a 37 ° C, 5% di CO 2 in un ambiente umidificato. </li><li> Giorno 3: ripetere i passaggi 4-9, tranne dividere le celle in modo uniforme da un pozzetto a 3 pozzetti di una piastra ben 6 pre-rivestite con 0,1% di gelatina. Questo produrrà 6 pozzi di trasdotte fibroblasti primari. </li><li> Giorno 4: Add doxiciclina (DOX) ad una concentrazione di 10 ug / ml a 5/6 pozzetti. Un pozzetto deve rimanere non trattato per servire come controllo. </li><li> Aggiungere VPA a 1,9 mM a 3 dei 5 pozzi trattati con DOX. VPA riduce il tasso di proliferazione delle MEF. Culture dense di MEF tollerare l&#39;esposizione prolungata a VPA mentre subconfluenti culture tendono a senesce entro 2-5 giorni. Pertanto, MEF dovrebbe essere 100% confluenti VPA quando viene aggiunto. Nota: Usiamo VPA nei nostri esperimenti di riprogrammazione perché è un modificatore epigenetica noto, ed è stato shproprio per aumentare l&#39;efficienza di generazione iPSC 17 anche se gli effetti e meccanismi di azione VPA rispetto alle generatrici IPSC completamente pluripotenti non sono noti. </li><li> 5 ° giorno: Aspirare il mezzo, lavare e Tripsinizzare le celle come prima. Passaggio delle cellule trattate con DOX / VPA a un centimetro 15 2 piatto di coltura di tessuti pre-rivestito con 0,1% di gelatina e ciascuna delle altre condizioni di pre-rivestite 10 cm 2 piatti in mezzo ES cellule integrati con DOX fresca e VPA. </li><li> Rifornire cellule ogni giorno con media ESC integrato con fresca DOX e VPA. ESC-come colonie dovrebbe iniziare a comparire dopo ~ 7 giorni nel DOX / VPA trattamento e dopo ~ 10 giorni nel trattamento sola DOX. Non ci sono colonie dovrebbe apparire in assenza di trattamento DOX. </li><li> Una volta che le colonie in possesso di una rifrazione luminosa, confine ben definito e contengono 30-50 cellule, manualmente isolare le colonie con una pipetta gel carico e trasferimento ad un fondo a U 96 pozzetti contenente 20 pl di 00,25% tripsina-EDTA. Tripsinizzare di singole cellule e trasferimento alimentatori in un appartamento inferiore piastra a 96 pozzetti in 150 microlitri medio ESC contenente dox / VPA o DOX solo. </li><li> Continuare a espandere clonale delle linee isolate IPSC sulla alimentatori in mezzo ESC. Rimuovere dox e VPA il giorno 19 dopo l&#39;aggiunta (post-trasduzione del giorno 23). Eliminare le linee IPSC che non mantengono auto-rinnovamento o tassi di proliferazione simile a controlli ESC. </li></ol> Può essere utile per caratterizzare le linee IPSC in relazione al CES prima di tentare di eseguire TEC. Abbiamo caratterizzato le nostre linee da 1) l&#39;espressione di marcatori di pluripotenza endogeni (SSE-1, Oct4, Sox2, Nanog) mediante immunocitochimica, 2) analisi del cariotipo mediante conteggio cromosoma e 3) la formazione del corpo embryoid. Si può anche eseguire lentivirali specifico RT-qPCR per confermare che i transgeni provirali non sono espressi nei iPSCs. Tuttavia, abbiamo identificato iPSCs completamente pluripotenti utilizzando solo la morfologia, immunostaining e karyotyping. Nei nostri esperimenti, la selezione di linee IPSC basato su ESC-come morfologia e caratteristiche di crescita dei risultati nella maggior parte delle linee che esprimono marcatori di pluripotenza, mentre noi si identificano diverse linee con cariotipo potenzialmente anomali. 4. Preparazione di iPSCs iniettabile blastocisti Passaggio numero di una linea PSC ha mostrato di influenzare i suoi 18 pluripotenza anche se questo può essere la linea dipendente 19. Abbiamo usato iPSCs di passaggi da 8-14 per la produzione di adulto all-IPSC topi. <ol><li> IPSCs Scongelare e piastra su linee in mezzo ESC. Passaggio delle cellule almeno una volta su alimentatori prima dell&#39;uso per l&#39;iniezione. </li><li> Un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti contenente 70-80% iPSCs confluenti fornirà più di un numero sufficiente di cellule per l&#39;iniezione. Aspirare mezzo di crescita e lavare le cellule con ~ 3 ml di PBS 1x (senza Ca 2 + / Mg 2 +). </li><li> Aggiungere 0,5 ml di pre-riscaldato 0,05% tripsina-EDTA perle cellule e incubare a 37 ° C per 10 min con dondolo occasionale. </li><li> Triturate per ottenere una cella singola sospensione. Osservare le cellule al microscopio ottico per garantire una sospensione singola cella. Le iPSCs devono essere in sospensione singola cella come colonie / aggregati cellulari saranno intasare la pipetta di iniezione. </li><li> Dopo una sospensione singola cella è ben realizzato, aggiungere 1,0 ml ESC supporto al pozzo e restituire la piastra al 37 ° C incubatore. Incubare per ~ 15 minuti o fino a quando la maggior parte degli alimentatori hanno iniziato ad aderire. </li><li> Rimuovere delicatamente il supporto contenente i iPSCs facendo attenzione a non rimuovere gli alimentatori debolmente aderenti. </li><li> Mettere le iPSCs in un tubo da 15 ml conica contenente 5 ml di mezzo di ESC. Centrifugare a 200 xg per 5 min. Aspirare il supernatante e rimuovere il resto del mezzo ES cella con una micropipetta. Toccare il tubo per rimuovere il pellet e le cellule Risospendere delicatamente in 0,2-0,5 ml di pre-refrigerata medio FHM. Conservare le cellule in ghiaccio fino e durante l&#39;iniezione in tetraploide blastocysts. </li></ol> 5. Generazione di blastocisti tetraploidi Procedure eseguite in questa sezione sono stati descritti in dettaglio altrove 5,6,20. Qui delineare la nostra tecnica, ottimizzato per il cellulare Electro Manipolatore BTX ECM 2001. <ol><li> Impostare topi donatori di embrioni da innesco 23-28 giorni topi vecchi femminili (C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1) con PMS e HCG. Somministrare 5 UI di PMS a 14:00 e 5 UI di HCG 47 ore più tardi. Dopo l&#39;iniezione di HCG, istituito topi di sesso femminile con C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ stalloni F1. Controllare il giorno seguente per tappi vaginali. </li><li> Eutanasia collegato topi femmina e raccogliere ovidotti. Raccogliere 1-cellule embrioni ponendo ovidotti in FHM con ialuronidasi e delicatamente strappare la ampulae. Lasciare le masse cumuliformi a sedere in FHM / ialuronidasi per 5-7 min. </li><li> Raccogli 1 cellule embrioni utilizzando una pipetta a bocca e lavare con gocce di mezzi FHM prima di introdurla nel KSOMCultura-AA. Coltura a 37 ° C, 5% di CO 2 sotto olio minerale durante la notte e selezionare 2 cellule embrioni il giorno di elettrofusione, scarta tutti gli embrioni altri. </li><li> Inserire un MicroSlide BTX in una capsula di Petri cm 10. Versare abbastanza spazio multimediale elettrosaldabili di temperatura per immergere il vetrino nella soluzione, ma non così tanto che i poli dell&#39;elettrodo sono completamente sommerse. </li><li> Accendere ECM 2001 e BTX Enhancer 400. Collegare i cavi del ECM per elettrodo del MicroSlide e fissare i cavi al lato della scatola di Petri per evitare il movimento accidentale della slitta. </li><li> Eseguire un impulso manuale per ottenere una lettura sul potenziatore BTX e rispettare la tensione degli AC / DC correnti oggetto di applicazione. AC corrente controllare la velocità alla quale gli embrioni saranno allineati tra gli elettrodi, corrente DC si fondono blastomeri, e tempo di impulso imposterà la lunghezza dell&#39;impulso DC. Un buon punto di partenza è 3V AC, DC 100V, e ora 0,05 msec. Il DC ottimale varia nell&#39;intervallo 90-150 volt. </li&gt; <li> Utilizzando una pipetta a bocca, prendere circa 30-40 a due cellule da embrioni KSOM-AA cultura e lavarli con qualche goccia di media elettrofusione. Disegna i media elettrosaldabili fresche dal piatto MicroSlide in pipetta a bocca e prendere gli embrioni dal lavaggio. Metterli nello spazio 1 mm tra gli elettrodi sulla MicroSlide. Fare attenzione che siano allineate nel mezzo del gap e che non sono in contatto tra loro. </li><li> Applicare corrente alternata premendo il pulsante manuale di impulsi. Gli embrioni ruoterà in campo AC, fino al piano di contatto blastomero è parallelo agli elettrodi. Se embrioni non sono allineati in pochi secondi, aumentare l&#39;impostazione AC. </li><li> Dopo gli embrioni si sono allineati, premere il pulsante manuale di impulso nuovo per applicare l&#39;impulso DC. </li><li> Con mezzo elettrofusione nella pipetta, raccogliere gli embrioni dal MicroSlide. Lavare gli embrioni attraverso alcune gocce di KSOM-AA e metterli in KSOM-AA cultura a 37 ° C, 5% di CO 2. Il blastomero fusione shoULD essere completato in meno di 30 minuti di cultura. </li><li> Ripetere i passaggi 7-11 per restante 2 cellule embrioni. Dopo i gruppi fusion successive, monitorare e selezionare embrioni con blastomeri fuse. Embrioni fuso con successo apparirà come in 1-cella stadio. Eliminare embrioni lisati e 2-cella dopo 30 minuti nella cultura. Se il tasso di fusione è inferiore all&#39;80%, aumentare la tensione e / o il tempo con incrementi di 5 V e 0,01 msec. Se lisi è superiore al 20%, ridurre tensione continua e / o il tempo di conseguenza. Le impostazioni ottimali nei nostri esperimenti sono stati 4V AC, DC 146V, e 0,07 msec. Queste impostazioni costantemente ceduto il 90% o più elevati tassi di fusione con lisi poca o nessuna. </li><li> Continua alla cultura embrioni fusi in microgocce di KSOM-AA in olio minerale a 37 ° C, 5% di CO 2. Si deve aspettare 85-95% degli embrioni fusi per formare tetraploidi (4n) blastocisti dopo 48 ore di incubazione. </li></ol> 6. Microiniezione di iPSCs in blastocisti tetraploide Usiamo una Nikon TE-2000Umicroscopio invertito dotato di ottica DIC e micromanipolatori Narishige per l&#39;iniezione blastocisti. Ogni blastocisti tetraploide viene iniettato con 10-12 iPSCs usando un protocollo standard per l&#39;iniezione ESC in blastocisti di topo che è stato dimostrato in una pubblicazione precedente JoVE 5,20,21 <ol><li> Posizionare una goccia 20 ml di FHM nel centro di un vetrino da microscopio concava e coprire con 150 pl di olio minerale. </li><li> Abbassare la pipetta tenuta e l&#39;ago microiniezione nella goccia FHM. Lasciare 2-3 minuti per entrambi gli aghi per riempire parzialmente con FHM. </li><li> Lavare 20-30 blastocisti tetraploide attraverso gocce di FHM e trasferimento al calo FHM sul vetrino da microscopio. </li><li> Pipetta miscela Bocca iPSC nella goccia. Può essere necessario diluire la miscela cellulare in una goccia di FHM anticipo se le cellule sono troppo concentrate o aggregati. </li><li> Raccogliere 100-200 cellule con l&#39;ago di iniezione. </li><li> Tenere la blastocisti con la massa cellulare interna nel pongono 09:00ione. Iniettare cellule in blastocele penetrando la zona pellucida e trofoblasto nella posizione ore 3. Iniettare cellule per 16-18 blastocisti. </li><li> Ritorno IPSC blastocisti integrati per KSOM-AA cultura. </li></ol> 7. Trasferimento di blastocisti tetraploidi completato nei Corni uterini di topi riceventi Completato blastocisti tetraploide sono chirurgicamente trasferiti alle corna uterine di topi riceventi femminili secondo le linee guida di istituto del ricercatore, con la tecnica standard di 20 che abbiamo brevemente riassumere. Selezionare femmina CD-1 in topi pro-estro palco e configurarli per l&#39;accoppiamento con i maschi vasectomized. Verificare la presenza di tappi vaginali la mattina successiva. Le femmine sono pronti per il trasferimento degli embrioni uterina due giorni dopo il tappo è stato rilevato (2,5 DPC). Un giorno prima del destinatario femmine si accoppiano con i maschi vasectomized, impostare ulteriori CD-1 femmine con i maschi vasectomizedda utilizzare come madri adottive per tutti-IPSC topi recuperati con taglio cesareo. 8. Taglio cesareo e la promozione di iPSC derivati ​​Pups Il trasferimento di embrioni TC in genere si traduce in riassorbimento più dopo l&#39;impianto, anche se l&#39;IPSC o ESC linea ha un elevato potenziale di sviluppo. Di conseguenza, ci si può aspettare non più di 4 cuccioli vitali (di solito 1-2) per beneficiario. Le cucciolate sono in genere di piccole dimensioni trascurate dai destinatari. Per aumentare il livello di assistenza neonatale e il tasso di sopravvivenza, eseguiamo C-sezioni e promuovere secondo lo standard dei protocolli 20. Per eseguire il taglio cesareo, l&#39;eutanasia topi riceventi 16 giorni dopo il trasferimento degli embrioni a 7-8PM (destinatario 18,5 DPC) e sezionare cuccioli dalle corna uterine. Foster cuccioli vitali per CD-1 madri che cucciolate consegnati lo stesso giorno.

<ol><li>Boland, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mice+generated+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult mice generated from induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 461, 91-94 (2009).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6209-6214 (2001).</li>
<li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEggan%2C+K+%22Generation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cell-derived+embryos+and+mice+by+tetraploid-embryo+complementation%22">Generation of embryonic stem (ES) cell-derived embryos and mice by tetraploid-embryo complementation</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>McLaughlin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tetraploid+embryos+by+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Production of tetraploid embryos by electrofusion.</a> Methods Enzymol. 225, 919-930 (1993).</li>
<li>Humpherys, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+instability+in+ES+cells+and+cloned+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic instability in ES cells and cloned mice.</a> Science. 293, 95-97 (2001).</li>
<li>Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z., Gao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+can+support+full-term+development+of+tetraploid+blastocyst-complemented+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos.</a> Cell Stem Cell. 5 (09), 135-138 (2009).</li>
<li>Zhao, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+produce+viable+mice+through+tetraploid+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation.</a> Nature. 461, 86-90 (2009).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+mice+produced+from+three-factor+induced+pluripotent+stem+%28iPS%29+cells+through+tetraploid+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Viable mice produced from three-factor induced pluripotent stem (iPS) cells through tetraploid complementation.</a> Cell Res. 21, 546-549 (2011).</li>
<li>Zhao, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+Fertile+Mice+Generated+from+Fully+Pluripotent+iPS+Cells+Derived+from+Adult+Somatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Viable Fertile Mice Generated from Fully Pluripotent iPS Cells Derived from Adult Somatic Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6, 390-397 (2010).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx3+improves+the+germ-line+competency+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tbx3 improves the germ-line competency of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 463, 1096-1100 (2010).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+prevents+loss+of+Dlk1-Dio3+imprinting+and+facilitates+generation+of+all-iPS+cell+mice+from+terminally+differentiated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells.</a> Nat. Genet. 44, 398-405 (2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+silencing+of+imprinted+genes+on+chromosome+12qF1+in+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 465, 175-181 (2010).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li>
<li>Go, W. Y., Ho, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+direct+comparison+of+the+dimerizer+and+reverse+tet+transcriptional+control+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization and direct comparison of the dimerizer and reverse tet transcriptional control systems.</a> The Journal of Gene Medicine. 4, 258-270 (2002).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nature. 26, 795-797 (2008).</li>
<li>Li, X. -y, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell and Tissue Research. 327, 607-614 (2007).</li>
<li>George, S. H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+adult+phenotyping+directly+from+mutant+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Developmental and adult phenotyping directly from mutant embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 4455-4460 (2007).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+A+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Kirak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transnuclear+Mice+with+Pre-defined+T+Cell+Receptor+Specificities+Against+Toxoplasma+gondii+Obtained+Via+SCNT%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT.</a> J. Vis. Exp. (43), e2168(2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Generazione di topi da linee IPSC usando saggi TEC fornisce un test rigoroso funzionale per la pluripotenza di una linea IPSC. Questo test può essere utile per valutare l&#39;efficacia relativa di diversi metodi di riprogrammazione o per identificare linee IPSC che possono essere più utili per generare certi tipi di cellule in vitro. Generata topo da iPSCs può essere usato per testare rigorosamente la stabilità a lungo termine e di tumorigenicità iPSC derivati ​​tessuti. Questo protocollo sarà utile agli investigatori che desiderano generare linee IPSC completamente pluripotenti o topi IPSC o per confrontare l&#39;utilità relativa di diversi metodi di riprogrammazione. I meccanismi che controllano la generazione e l&#39;identificazione di iPSCs completamente pluripotenti sono ancora limitate ed è possibile che alcune linee IPSC prodotte con questo metodo non superare la prova TEC. Molti fattori possono variare tra esperimenti genetici tra cui sfondi, titolo lentivirale, modelli di lentivirale insertion, i parametri del ciclo cellulare della popolazione dei donatori, tra diversi laboratori differenze nelle varie fasi della procedura TEC e propensioni variabili di iPSCs a nutrire aberrazioni genetiche o epigenetiche. Per garantire la migliore riuscita, curiamo stabilire livelli adeguati di espressione genica lentivirale in esperimenti derivazione IPSC testando diluizioni virale su MEFs controllo per garantire che ogni virus è sufficientemente concentrata per produrre rilevabile espressione genica di almeno 80% e preferibilmente il 100% del MEF. Questo ci permette di identificare le linee con più copie di lentivirus diverse limitando tossicità per il MEF e la produzione di colonie senza sovraffollamento dei pozzetti. Va notato che altri protocolli multipli hanno dimostrato di produrre iPSCs con pieno potenziale di sviluppo, con metodi e fonti di cellule donatrici che suggeriscono che più percorsi per pluripotenza pieno possono esistere 1,8-13,15. Al momento, però, non biomarcatore definitivo completamente pluripotenti iPSCè stato identificato e quindi il saggio TEC rimane il test gold standard se una linea iPSC può generare tutti linee cellulari in un organismo.

<table><tbody><tr><td>DMEM (glucosio ad alta concentrazione)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS qualificato per cellule ES</td><td>Invitrogen</td><td>104392-024</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;etanolo</td><td>Sigma</td><td>Sigma M7522</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina 0,1%</td><td>Millipore</td><td>ES006-B</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi Non Essenziali</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Invitrogen</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (LIF murino)</td><td>Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Acido Valproico</td><td>Sigma</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; gratuito</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina sierica di puledra gravida, per superovulazione, liofilizzata, 2.000 UI</td><td>Harbor-UCLA Research Institute</td><td>n/d</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina corionica umana</td><td>Sigma</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo FHM con ialuronidasi</td><td>Millipore</td><td>MR-056-F</td><td></td></tr><tr><td>mezzo KSOM-1/2 AA</td><td>Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>EMF</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>Acqua, per il trasferimento dell'embrione, embrione testato</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale, testato su embrioni</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitolo</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA), testata su embrioni</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasti embrionali di topo, non irradiati</td><td>Millipore</td><td>PMEF-CFL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;classe=p&quot;jove_contenuto&quot;&gt;&lt;forte&gt;Mezzi e tamponi utilizzati in questo protocollo&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;classe=p&quot;jove_contenuto&quot;&gt;Mezzo di crescita per HEK293T. 90% DMEM, 10% FBS, 100 U/ml di penicillina e 10 mg/ml di streptomicina. Escludere penicillina e streptomicina dal mezzo per HEK utilizzato nel giorno della trasfezione. Il mezzo per HEK può essere conservato a 4 &amp;deg;C per un massimo di 1 mese.&lt;/p&gt; &lt;classe=p&quot;jove_contenuto&quot;&gt;2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 12 mM destrosio. Regolare il pH a 7,1 ± 0,1. Il pH è fondamentale! Filtrare in condizioni sterili e conservare a 4 &amp;deg;C.&lt;/p&gt; &lt;classe=p&quot;jove_contenuto&quot;&gt;Mezzo di crescita per fibroblasti embrionali di topo (MEF) (utilizzabile anche con colture di supporto). 70% DMEM, 20% Medium 199, 10% siero fetale bovino (FBS), 100 U/ml di penicillina e 10 mg/ml di streptomicina. Conservare a 4 &amp;deg;C per un massimo di 1 mese.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_contenuto&quot;&gt;Mezzo di crescita per ESC. 85% DMEM, 15% FBS qualificato per cellule ES, Glutamax 1x, 0,1 mM amminoacidi non essenziali, 0,1 mM &amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanolo, 1.000 U/ml ESGRO, 100 U/ml penicillina e 10 mg/ml streptomicina. Il mezzo per ESC può essere conservato a 4 &amp;deg;C per un massimo di tre settimane.&lt;/p&gt; &lt;classe=p&quot;jove_contenuto&quot;&gt;Mezzo per elettrofusione. 0,3 M Mannitolo, 0,1 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 50 mM CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;e 3% di BSA in acqua per embrioni testata. Conservare a 4 &amp;deg;C per un massimo di 3 mesi.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

La produzione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) da cellule somatiche fornisce un mezzo per creare strumenti utili per la ricerca di base e può anche produrre una fonte di cellule paziente-trovati per terapie rigenerative. iPSCs possono essere generati utilizzando protocolli multipli e derivati ​​da fonti cellulari multipli. Una volta generato, iPSCs sono testati utilizzando una varietà di saggi tra cui immunocolorazione per i marcatori pluripotenza, generazione di tre strati germinali in corpi embrionali e teratomi, confronti di espressione genica con cellule staminali embrionali (ESC) e la produzione di topi chimerici con o senza linea germinale contributo 2 . È importante sottolineare che le linee IPSC che superano questi test ancora variano nella loro capacità di produrre diversi tipi di cellule differenziate 2. Ciò ha reso difficile stabilire quali protocolli di derivazione IPSC, fonti di cellule del donatore o dei metodi di selezione sono molto utili per diverse applicazioni. Il test più severise una linea di cellule staminali ha sufficiente potenziale di sviluppo per generare tutti i tessuti necessari per la sopravvivenza di un organismo (chiamato pluripotenza completo) è complementazione tetraploide embrione (TEC) 3-5. Tecnicamente, TEC comporta elettrofusione di due embrioni per generare cellule tetraploidi (4n) unicellulari embrioni che possono essere coltivate in vitro allo stadio di blastocisti 6. Diploidi (2n) cellule staminali pluripotenti (CES es o iPSCs) vengono iniettati nella cavità blastocele della blastocisti tetraploide e trasferito in una femmina ricevente di gestazione (vedere Figura 1). Il componente tetraploide dell&#39;embrione completato contribuisce quasi esclusivamente ai tessuti extraembrionali (placenta, sacco vitellino), mentre le cellule diploidi costituiscono l&#39;embrione corretta, risultando in un feto derivata interamente dalla linea di cellule staminali iniettato. Recentemente, abbiamo riportato la derivazione di linee IPSC che riproducibile generare topi adultivia TEC 1. Queste linee IPSC dar luogo a cuccioli vitali con efficienze del 5-13%, che è paragonabile al CES 3,4,7 e superiore a quello riportato per la maggior parte delle altre linee IPSC 8-12. Dalle relazioni emerge che la riprogrammazione diretta in grado di produrre iPSCs completamente pluripotenti che corrispondono CES nel loro potenziale di sviluppo e l&#39;efficienza della generazione di cuccioli nei test TEC. Allo stato attuale, non è chiaro ciò che distingue tra iPSCs completamente pluripotenti e delle linee meno potenti 13-15. Non è neppure chiaro quali metodi di riprogrammazione produrrà queste righe con la massima efficienza. Qui si descrive un metodo che produce iPSCs completamente pluripotenti e &quot;all-IPSC&quot; topi, che possono essere utili per gli investigatori che desiderano confrontare la pluripotenza delle linee IPSC o stabilire l&#39;equivalenza dei diversi metodi di riprogrammazione.

Al passaggio 3, "Derivazione di iPSC da MEF", si dovrebbe osservare un'eterogeneità morfologica e la formazione di colonie di iPSC immature a partire da 4-5 giorni dopo l'aggiunta di doxiciclina/VPA e colonie mature tra 7-10 giorni (Figura 2). La produzione di embrioni tetraploidi monocellulari al passaggio 5 è altamente efficiente (Figura 3). Osserviamo regolarmente fino al 95% degli embrioni a due cellule trattati che si fondono con successo producendo embrioni tetraploidi monocellulari. Il protocollo seguito per iniettare iPSC in blastocisti tetraploidi (Passaggio 6, Figura 4) è simile al protocollo per l'iniezione di ESC in blastocisti diploidi per generare topi chimerici, e può essere eseguito da un operatore esperto in microiniezione. Il numero di nati vivi dipende dalla linea cellulare (Tabella 1).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">Efficienza di preprogrammazione delle MEF 0,01-0,03%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">Efficienza di produzione di iPSC murine mediante TEC</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>Nome</td>
			<td>Descrizione</td>
			<td>Blastocisti iniettate</td>
			<td>Nati vivi</td>
			<td>Adulti vivi</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-21</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>867</td>
			<td>53 (6,1%)</td>
			<td>19 (2,2%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-9</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>195</td>
			<td>7 (3,6%)</td>
			<td>4 (2,1%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-11</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>338</td>
			<td>1 (0,3%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1. Risultati rappresentativi.
<img alt="Diagramma del complemento di blastocisti tetraploidi; creazione di topi iPSC da embrioni diploidi, E13." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Schema del disegno sperimentale. In alto a sinistra: produzione di blastocisti tetraploidi. Embrioni fecondati a due cellule provenienti da topi albini vengono elettrofusi per generare embrioni tetraploidi a una cellula, che vengono coltivati in vitro fino allo stadio di blastocisti. In basso a sinistra: riprogrammazione. Fibroblasti embrionali di topo vengono trasdotti con particelle lentivirali codificanti Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc e la proteina transattivante inversa della tetraciclina, rtTAM2.2. L'aggiunta di doxiciclina induce l'espressione del transgene e l'avvio della riprogrammazione verso iPSC. A destra: produzione di topi iPSC. iPSC derivate da topi pigmentati vengono iniettate nella blastocoele di blastocisti tetraploidi e successivamente impiantate chirurgicamente in topi riceventi pseudo-gravidi. I topi neonati derivati da iPSC vengono partoriti mediante taglio cesareo e allattati da femmine surrogate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig1large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.
<img alt="Processo di riprogrammazione cellulare; immagini al microscopio; trasformazione da MEF a iPSC a 10x, 20x di ingrandimento." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Cambiamenti morfologici associati alla riprogrammazione. Da sinistra a destra: Esempi dell’evoluzione morfologica da fibroblasti a colonie di iPSC durante il corso di un esperimento di riprogrammazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig2large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare l'immagine in dimensioni maggiori</a>.
<img alt="Stadi di sviluppo dell'embrione: a 2 cellule (2n), fusione dei blastomeri, a 1 cellula (4n); immagini al microscopio." src="/files/ftp_upload/4003/4003fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Produzione di embrioni tetraploidi. Embrioni diploidi a due cellule sono sottoposti a un impulso elettrico che induce la fusione dei blastomeri e la generazione di embrioni tetraploidi a una singola cellula.
<img alt="Iniezione di iPSC in un blastocisto, con conseguente nascita di topo da iPSC e topo di tre settimane; risultati dello studio cellulare." src="/files/ftp_upload/4003/4003fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Produzione di topi da iPSC. Sinistra: le iPSC vengono iniettate nel blastocele di un blastocisto tetraploide. Centro: i topi neonati derivati da iPSC si distinguono per gli occhi pigmentati. Destra: topo da iPSC a tre settimane dal parto.

Generazione indotte pluripotenti cellule staminali (IPSC) linee produce linee di diverso potenziale di sviluppo, anche quando passano i test standard per la pluripotenza. Qui si descrive un protocollo per la produzione di topi ottenute interamente da iPSCs, che definisce le linee IPSC come in possesso di pluripotenza pieno<sup&gt; 1</sup&gt;.

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

La produzione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) a partire da cellule somatiche fornisce un mezzo per creare strumenti preziosi per la ricerca di base e può inoltre...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare topi adulti da cellule staminali pluripotenti indotte, o I PSC, mediante complementazione di embrioni tetraploidi. Questo viene ottenuto innanzitutto generando I PSC da fibroblasti embrionali murini utilizzando virus lentivirali portanti OCT4, SOX2, KLF4 e c-Myc e integrando il mezzo con acido valproico o VPA.Dopo la generazione delle IPC, queste vengono caratterizzate mediante colorazione immunoistochimica, conteggio dei cromosomi e formazione di corpi embrionali. Il passo successivo consiste nella generazione di blastocisti tetraploidi riceventi mediante fusione e coltura in vitro. Successivamente, le IPSC vengono iniettate nelle blastocisti tetraploidi riceventi e le blastocisti completate vengono trapiantate in femmine riceventi per la gestazione.Nell'ultimo passaggio, gli animali a termine vengono consegnati mediante parto cesareo e affidati a madri surrogate. In questo modo, lo sviluppo postnatale può essere monitorato. Alla fine, se vengono generati animali vitali a termine.La linea cellulare IPSC sottoposta al saggio è considerata completamente pluripotente. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi di generazione di IPSC è che il nostro metodo genera in modo riproducibile linee cellulari IPS completamente pluripotenti. Le linee cellulari IPS generate con questi metodi possono essere utili ad altri ricercatori che desiderino confrontare la pluripotenza delle proprie cellule IPS o stabilire l'equivalenza di altri metodi di riprogrammazione. Questi metodi saranno utili ai ricercatori che intendono generare linee cellulari IPS completamente pluripotenti per specifiche applicazioni successive, come saggi di differenziamento in vitro.Ulteriore generazione di topi IPSC. L'uso della complementazione telomerica può rappresentare un mezzo utile per determinare la stabilità genetica ed epigenetica di diverse linee cellulari. Le micro-manipolazioni coinvolte nella complementazione di embrioni tetraploidi sono tecnicamente complesse.Potrebbero essere necessari diversi mesi affinché una persona diventi esperta nelle tecniche sviluppate da IPSC, che richiedono condizioni di coltura simili a quelle utilizzate negli esperimenti tradizionali di targeting genico in ESL. 24 ore dopo la trasfezione delle cellule HEC 2 9 3 T con lentivirus, rimuovere il mezzo di crescita e sostituirlo con 25 millilitri di mezzo fresco preriscaldato.Riportare il mezzo contenente i virus TRANSFECTED esagonale nell'incubatrice per 24 ore. Dopo 48 ore dalla trasfezione delle cellule HEC 293T con lentivirus, raccogliere il mezzo di crescita contenente le particelle lentivirali dalle cellule trasfettate. Rimuovere i detriti particellati dai mezzi contenenti il virus mediante centrifugazione a 3000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, concentrare il virus mediante ultracentrifugazione attraverso un cuscino di saccarosio al 20% per due ore a 112.000 G a quattro gradi Celsius.Versare con attenzione il liquido in un contenitore per rifiuti da decontaminare, senza disturbare il pellet virale. Risospendere il pellet virale in 0,4 millilitri di mezzo per fibroblasti embrionali di topo e sigillare il tubo. Quindi agitare delicatamente a quattro gradi Celsius per 15-30 minuti.Conservare le particelle virali e aliquote monouso a meno 80 gradi Celsius. Le linee IPSC sono derivate da fibroblasti embrionali di topo o da cellule meth. Una volta che le colonie IPSC presentano un bordo ben definito, brillante e rifrangente e contengono da 30 a 50 cellule, sono pronte per essere selezionate manualmente ed espanse come linee IPSC indipendenti.Prelevare singole colonie con la punta di una pipetta per caricamento gel e trasferire ciascuna colonia direttamente in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a U contenente 20 microlitri di tripsina EDTA al 0,25%. Incubare le colonie prelevate con la tripsina per circa otto minuti a 37 gradi Celsius o fino a quando le colonie si dissociano in singole cellule. Monitorare l'andamento della dissociazione mediante microscopia a luce. Potrebbe essere necessaria una leggera agitazione.Trasferire la sospensione cellulare dissociata in una piastra a 96 pozzetti contenente uno strato di cellule nutritrici e 150 microlitri di mezzo per cellule staminali embrionali (ESC) integrato con doxiciclina e VPA. Quando le colonie di iPSC ricompaiono in ciascun pozzetto, suddividerle in pozzetti più grandi per l'analisi e la conservazione cellulare seguendo le procedure standard di derivazione delle ESC e di coltura cellulare, per avviare la procedura di generazione dell'assistenza con blastomeri tetraploidi. Gli embrioni monocellulari raccolti da topi femmina vengono coltivati fino allo stadio di embrioni a due cellule, durante la notte, in KSOM a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica; il giorno successivo, posizionare un microvetto BTX in una piastra Petri da 10 centimetri.Versare una quantità sufficiente di mezzo elettrofusione a temperatura ambiente per immergere completamente il vetrino nella soluzione, senza però eccedere fino a coprire del tutto i poli dell'elettrodo. Accendere l'elettromanipolatore BTX ECM 2001 e l'amplificatore BTX 400. Collegare i cavi dell'ECM all'elettrodo del vetrino microscopico e fissare i cavi al lato della piastra di Petri per evitare movimenti involontari del vetrino.Eseguire un impulso manuale per ottenere una lettura sull'amplificatore BTX e annotare la tensione delle correnti continue applicate. La corrente alternata controllerà la velocità con cui gli embrioni si allineano tra gli elettrodi. La corrente continua fonderà i blastomeri e la durata dell'impulso determinerà la lunghezza dell'impulso in corrente continua.Un buon punto di partenza è CA tre volt CC 100 volt e per 0,05 millisecondi. La tensione CC ottimale varia nell'intervallo da 90 a 150 volt. Utilizzando una pipetta a bocca.Prelevare da 30 a 42 embrioni cellulari da coltura KSOM e trasferirli in una goccia di mezzo per elettrofusione. Lavare attraverso diverse gocce di mezzo per elettrofusione. Successivamente, aspirare mezzo fresco per elettrofusione dalla piastra microscopica nell'pipetta orale.Prendere gli embrioni lavati e posizionarli nella fessura di un millimetro tra gli elettrodi sul microvetrino. Prestare attenzione affinché gli embrioni siano allineati al centro della fessura e non siano a contatto l'uno con l'altro. Applicare la corrente alternata premendo il pulsante di avvio manuale.Gli embrioni ruoteranno nel campo CA finché il piano di contatto blastico non sarà parallelo agli elettrodi. Se gli embrioni non si allineano entro pochi secondi, aumentare l'impostazione CA. Dopo che gli embrioni si sono allineati, premere nuovamente il pulsante di avvio manuale per applicare l'impulso CC con il mezzo di elettrofusione nella pipetta.Raccogliere gli embrioni dalla vetrina microscopica, lavare gli embrioni attraverso diverse gocce di mezzo KSOM e quindi coltivare gli embrioni in KSOM sotto olio minerale a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. La fusione dei blastomeri dovrebbe essere completata in meno di 30 minuti. Durante la coltura, monitorare e selezionare gli embrioni con blastomeri fusi con successo.Gli embrioni fusi appariranno allo stadio monocellulare; scartare gli embrioni lisati e quelli a due cellule dopo 30 minuti di coltura. Continuare la coltura degli embrioni fusi in microgocce di KSOM sotto olio minerale a 37 °C, in atmosfera di 5% CO₂. Per preparare le IPC per l'iniezione in blastocisti, scongelare le IPC precedentemente conservate e seminare le cellule su feeder in mezzo per ESC. Effettuare almeno un passaggio delle cellule su feeder dopo lo scongelamento, prima dell'uso per l'iniezione.Un pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente IPC confluenti al 70-80% fornirà un numero di cellule più che sufficiente per l'iniezione. Aspirare il mezzo di crescita e lavare le cellule con tre millilitri di PBS privo di calcio o magnesio. Aggiungere 0,5 millilitri di tripsina-EDTA 0,05% preriscaldata alle cellule e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti, agitando occasionalmente. Aggiungere 3,0 millilitri di mezzo ESC e pipettare ripetutamente per ottenere una sospensione monocellulare. Osservare le cellule al microscopio ottico per verificare la presenza di una sospensione monocellulare: colonie o aggregati cellulari potrebbero ostruire la pipetta di iniezione. Una volta ottenuta una sospensione monocellulare, aggiungere un millilitro di mezzo ESC al pozzetto e reinserire la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius.Incubare per circa 15 minuti o fino a quando la maggior parte delle cellule della linea accessoria ha iniziato ad aderire, quindi rimuovere delicatamente il mezzo contenente le IPC. Prestare attenzione a non staccare le cellule accessorie aderenti settimanali. Posizionare le IPC in un tubo conico da 15 millilitri contenente cinque millilitri di mezzo per ESC e centrifugare a 200 G per cinque minuti.Aspirare il soprannatante ed eliminare il resto del mezzo ESC con una pipetta microlitrica. Agitare leggermente il tubo per disperdere il pellet e risospendere delicatamente le cellule in 0,2–0,5 millilitri di mezzo FHM preraffreddato. Mantenere le cellule sul ghiaccio fino al momento dell’iniezione nei blastocisti tetraploidi. Per il protocollo relativo all’iniezione nei blastocisti, fare riferimento al manoscritto allegato a questo articolo e a un articolo precedentemente pubblicato, un estratto del quale è visualizzato sullo schermo.Esempi di progressione morfologica da fibroblasti a colonie di iPSC durante il corso di un esperimento di riprogrammazione sono mostrati in queste immagini. Si dovrebbe osservare un'eterogeneità morfologica e la formazione di colonie di iPSC parzialmente riprogrammate a partire da quattro a cinque giorni dopo l'aggiunta di doxiciclina e VPA, come mostrato nei pannelli da B a EESC. Colonie simili a iPSC dovrebbero apparire tra i sette e i dieci giorni, come illustrato nel pannello F. La produzione di embrioni tetraploidi a una cellula mediante fusione elettrochimica di embrioni diploidi a due cellule è altamente efficiente.È prassi comune osservare che fino al 95% degli embrioni a due cellule trattati si fondono con successo, producendo embrioni tetraploidi a una cellula. Il protocollo utilizzato in questo esperimento per iniettare IPSC in blastocisti tetraploidi è simile al protocollo per l'iniezione di ES in blastocisti diploidi al fine di generare topi chimerici; per escludere facilmente la generazione di chimere diploidi, vengono scelti con attenzione i ceppi di topi impiegati per generare le IPSC e gli embrioni tetraploidi, quando possibile. In questo esempio, gli embrioni tetraploidi sono ottenuti da un ceppo albino e le IPSC sono generate da un ceppo pigmentato.Pertanto, i topi IPSC neonati presentano occhi pigmentati e un colore del mantello uniformemente pigmentato in et&agrave; adulta, mentre i diploidi kyras mostrerebbero una colorazione mista albina e pigmentata. Il numero di cuccioli nati vivi dipende dalla linea cellulare, come mostrato in questa tabella. Per una linea IPSC media di buona qualit&agrave;, gli sperimentatori dovrebbero aspettarsi che tra l'1% e il 10% dei blastocisti iniettati produca cuccioli nati vivi.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) completamente funzionali e di come validarne il potenziale di sviluppo. Utilizzando il saggio di complementazione tetraploide, una volta padroneggiata questa tecnica che va dall'isolamento delle MES fino alla nascita di topi derivati da cellule iPS, il processo può essere completato in due o tre mesi. Lo sviluppo e il mantenimento delle iPS richiedono un elevato livello di competenza nelle tecniche di coltura cellulare.È essenziale avere un'esperienza pregressa con la cultura ESL. Non dimenticare che lavorare con lentivirus, in particolare lentivirus concentrato, può essere estremamente pericoloso. Si dovrebbe sempre indossare l'equipaggiamento di protezione personale richiesto dall'istituzione e assicurarsi di trattare tutto ciò che è venuto a contatto con il virus con una soluzione al 10% di candeggiante per almeno 20 minuti, seguendo questa procedura.Tutti i topi IPSC e i loro tessuti possono essere analizzati per fenotipi fisiologici, patologici e comportamentali.

generation-of-mice-derived-from-induced-pluripotent-stem-cells

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video mostra la procedura per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte con lentivirus inducibile che esprimono Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4.

Generare cellule iPS dal MEF attraverso l&#39;espressione forzata di Sox-2, Oct-4, c-Myc e Klf4

Il Stemgent inducibile Dox Mouse Set TF Lentivirus possibile riprogrammare i fibroblasti embrionali di topo (MEF) per pluripotenti indotte staminali (iPS), cellule. Qui mostriamo il protocollo per DOX-inducibile espressione di fattori di trascrizione del mouse riprogrammazione Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc di generare colonie iPS che esprimono i marcatori comune MES pluripotenza.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con un fattore quattro trascrizione, Doxiciclina inducibile lentivirali sistema di trasduzione

Il protocollo seguente fornisce istruzioni per l'adattamento umano staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule di alimentazione priva di cultura con completo alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut medio (KSR-FF). Una volta adattato, istruzioni per la manutenzione costante sono anche previste.

Alimentatore-Free adattamento, la cultura e Passaging di cellule IPS utilizzando Completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut Media

Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per cryopreserving cellule umane iPS nel medio KnockOut crioconservazione SR ed il recupero di queste cellule in completo alimentatore KnockOut gratuito SR (KSR-FF), medio o alimentatore a base di medie SR KnockOut.

Cryopreserving e recupero di cellule umane iPS usando KnockOut Completa alimentatore-Free siero sostituzione Media

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) rappresentano una fonte di tessuti paziente-specifici per le applicazioni cliniche e di ricerca di base. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per riprogrammare le cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati in iPSCs-virali gratuito utilizzando non integrano plasmidi episomiale.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

Questo protocollo descrive come generare cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da cellule T periferiche umane in condizioni di feeder-free utilizzando una combinazione di vettori virali matrigel e Sendai contenenti fattori di riprogrammazione.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da umani periferici T Cellule con Sendai virus in condizioni di libera-Feeder

In questo studio, generiamo cellule staminali pluripotenti indotte da cellule di liquido amniotico di topo, utilizzando un sistema di trasposoni non virale.

La produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido Utilizzando un sistema di trasposoni

Questo articolo descrive un protocollo per derivare e cultura pluripotenti linee di cellule staminali da embrioni di topo allo stadio di blastocisti efficacemente.

Derivazione di linee di cellule staminali da embrioni di Preimplantation Mouse

Qui presentiamo un protocollo per lo sviluppo di modelli murini geneticamente modificati utilizzando cellule staminali embrionali, in particolare per il knock-in del DNA di grandi dimensioni (KI). Questo protocollo è ottimizzato utilizzando l'editing del genoma CRISPR / Cas9, con conseguente miglioramento significativo dell'efficienza KI rispetto al tradizionale metodo di targeting linearizzato del DNA mediato dalla ricombinazione omologa.

Targeting genico altamente efficiente mediato da CRISPR/Cas9 in cellule staminali embrionali per lo sviluppo di modelli murini manipolati da geni

Il presente protocollo descrive un metodo per isolare, espandere e riprogrammare cellule derivate dall'urina di primati umani e non umani in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), nonché istruzioni per il mantenimento senza alimentatore delle iPSC appena generate.

Generazione e mantenimento di cellule staminali pluripotenti indotte da primati derivate dall'urina

Scopri come generare topi adulti da cellule staminali pluripotenti indotte mediante complementazione di embrioni tetraploidi. Questo metodo valida la piena pluripotenzialità delle linee iPSC per la biologia dello sviluppo.

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

Esplora altri video

Generazione di topi derivati da cellule staminali pluripotenti indotte