Name: Iniezione intraduttale di LPS come un modello murino di mastite: Segnalazione Visualizzato tramite un NF-kB Reporter transgenico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Scopri un modello murino di mastite mediante iniezione intraduttale di LPS e imaging bioluminescente per visualizzare l'attività NF-κB. Questa tecnica consente di studiare l'infiammazione della ghiandola mammaria in vivo.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione del NIH CA113734 assegnato a F Yull e il Department of Veterans Affairs (TS Blackwell).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Animal Care Vanderbilt University e del Comitato Istituzionale uso. 1. Preparazione di topi transgenici <ol><li> Topi femmina, positivo per la (N F-kB-G FP-L uciferase) giornalista transgene NGL (descritto in precedenza 1) vengono utilizzati per questa procedura. Quando le femmine sono almeno 6 settimane di età, li accoppiarsi con un maschio FVB tipo selvatico. Harem di allevamento possono essere utilizzati (fino a 4 femmine in una gabbia con 1 maschio). (Nota: topi FVB ceppo sono stati utilizzati per lo studio attuale topi ceppo scuri come C57Bl6 possono anche essere utilizzati, ma questi topi deve essere rasata prima imaging.). </li><li> A partire da 15 giorni dopo l&#39;accoppiamento, le femmine controllare regolarmente per i segni di gravidanza (grande circonferenza sporgente). Ogni femmina deve essere separato una volta in stato di gravidanza e il maschio tolto dalla gabbia di allevamento una volta che l&#39;ultima femmina rimane incinta. </li><li> Guarda le femmine separate di und notare la data di nascita, quando una cucciolata compare. Un disordine di almeno 6 cuccioli è necessario per l&#39;allattamento adeguato. Otto giorni dopo la nascita della cucciolata, procedere con il protocollo (vedere la Figura 1 per uno schema temporale). </li></ol> 2. Preparazione per iniezione <ol><li> Sciogliere la E. coli LPS in PBS ad una concentrazione finale di 0,1 mg / mL. 50 pl di questa soluzione, o un totale di 5 pg, verrà iniettato nella ghiandola mammaria. Preparare un secondo tubo di PBS solo da utilizzare per il controllo dell&#39;iniezione. </li><li> Set-up di un ambito dissezione e apparecchiature per l&#39;anestesia isoflurano. Un naso-cono apparecchio deve essere fissato alla fase della portata dissezione cui il mouse viene posizionato. Una sorgente di luce buona, se dallo stesso campo di applicazione o da faretti supplementari dovrebbe anche essere preparato. </li><li> Una volta che il set-up, avviare la macchina isoflurano e il flusso d&#39;aria. </li></ol> 3. Iniezione intraduttale di LPS <ol><li> Caricare la siringa corta dell&#39;ago con 50 microlitri della soluzione di LPS. Impostare questa parte. </li><li> Anestetizzare il mouse per essere iniettato in primo luogo mettendo la femmina in una scatola piena di isoflurano e poi una volta che la respirazione è rallentata, il suo muoversi sul palco e mettere il naso all&#39;interno del naso-cono. Utilizzare un pizzico punta a confermare il mouse è completamente anestetizzato. Monitorare il respiro del mouse durante tutta la procedura e regolare il livello isoflurano di conseguenza. La gabbia che contiene la cucciolata di cuccioli che la femmina è stata presa dal deve essere attentamente da parte fino alla diga può essere restituito dopo la procedura. </li><li> Utilizzare una piccola goccia di etanolo al 70% per rendere il pelo distesi e per aiutare a visualizzare il capezzolo attaccato a destra # 4 ghiandola mammaria inguinale sul basso ventre del mouse. </li><li> Mettere a fuoco la portata dissezione per una visione ottimale del capezzolo. Usare con attenzione una serie di una pinza sottile per disegnare ulteriormente il capezzolo dalla pelle, ma non forare o danneggiare il capezzolo in alcun modo. Ilpinza non deve mai essere fissata solidamente insieme quando la manipolazione del tessuto, ma utilizzato con una presa luce che richiede la minima quantità di stress sul capezzolo. </li><li> Utilizzare la pinza nella mano sinistra per tenere delicatamente il capezzolo in posizione. Portare lentamente la siringa precaricata nel campo visivo con la mano destra. La siringa deve essere mantenuta in modo che nessun riposizionamento deve avvenire in modo da iniettare il contenuto. </li><li> Una volta che la siringa è in vista, mirano attentamente la piccola apertura duttale nel centro del capezzolo, e inserire la siringa. </li><li> Senza riposizionare la mano, iniettare il contenuto della siringa e rimuovere l&#39;ago dal capezzolo. </li><li> Caricare una seconda siringa con 50 pl di PBS per il controllo dell&#39;iniezione. Riposizionare il mouse sul palco e per la vista migliore della sinistra # 4 capezzolo inguinale ghiandola mammaria al di là del basso addome del mouse. Ripetere i passaggi 3,4-3,7 con il PBS-caricato siringa. </li><li> Una volta che entrambe le iniezioni sono complete, interrompere l&#39;anestesia e spostare il mouse in una gabbia di recupero. Monitorare la femmina per assicurarsi che lei diventa mobile entro 5 minuti. Permettono il mouse per rimanere nella gabbia di recupero per 1 ora. Dopo 1 ora di recupero, disporre di nuovo la femmina nella gabbia con la sua cucciolata di cuccioli. I topi devono essere controllati periodicamente per 6 ore dopo l&#39;iniezione, prima di procedere con l&#39;imaging. Nella nostra esperienza, senza conseguenze negative sono state rilevate sia nel femminile o dei cuccioli nel periodo compreso tra l&#39;iniezione e di imaging. Tuttavia, se i segni di sofferenza si osservano nella femmina (es. postura ingobbita, mordere o guardia del sito di iniezione, letargia generale) o di cuccioli (nessun movimento, il colore bluastro della pelle), l&#39;esperimento deve essere interrotto. </li></ol> 4. Bioluminescent Imaging Per visualizzare NF-kB Attività <ol><li> Una volta che i topi sono stati trasportati alla struttura di imaging, avviare la procedura di imaging aprendo il software e l&#39;inizializzazione della macchina. Accendere il èmacchina oflurane e flusso d&#39;aria, assicurando che l&#39;anestesia fluisce sia la scatola e la camera di imaging. </li><li> Posizionare il mouse in anestesia isoflurano nella casella anestesia chiaro. Una volta che ha rallentato la respirazione, utilizzare un pizzico punta a confermare il mouse è completamente anestetizzato. Poi, iniettare 100 ml di substrato luciferina nel mouse da retro-orbitale iniezione 5 utilizzando una siringa sterile. </li><li> Trasferire immediatamente il mouse per la camera di imaging e mettere il naso sotto il naso isoflurano cono si trova lì. Il mouse deve essere supino. Fissare ogni piede sul palco con nastro adesivo. </li><li> Ingresso le impostazioni corrette al software IVIS di prendere sia un immagine in bianco luce fotografica e un&#39;immagine dell&#39;attività bioluminescenti. Il tempo di esposizione deve essere di 10 secondi. Acquisire l&#39;immagine. </li><li> Una volta che le immagini sono state acquisite, consentono il mouse per recuperare e quindi inserire la schiena nella gabbia con i suoi cuccioli e monitorare periodicamente. </li><li> La fotografico e luminescenteimmagini vengono automaticamente sovrapposti e visualizzati sullo schermo, come in Figura 2. Analizzare le immagini acquisite ponendo regione di interesse o &quot;ROI&quot; cerchi di grandezza uguale su ciascun lato del basso addome del mouse (uno sopra la ghiandola PBS-iniettata e uno sopra l&#39;LPS-iniettato ghiandola). Impostare la lettura ai fotoni. Un numero deve essere visualizzato indica la luminescenza rilevata all&#39;interno di ogni ROI (vedere la Figura 2B). Utilizzare questo numero nell&#39;analisi statistica. </li><li> Per visualizzare l&#39;immagine ottimale, regolare ulteriormente la soglia del segnale visualizzato. Questo non modificherà la luminescenza totale lettura, ma vi permetterà di rimuovere segnale di fondo e visualizzare le differenze tra il controllo e la LPS-trattati ghiandola. Ridurre la quantità di luminescenza mostrato fino alla ghiandola PBS-iniettato è privo di segnale di fondo. Questo dovrebbe lasciare il segnale aumentato nella ghiandola LPS-trattata ancora visibili nell&#39;immagine, come visto nella Figura 2. </li><li> AdditionaL analisi, comprese proteine ​​e analisi dell&#39;RNA, può essere completato con tessuto mammario raccolti dalla femmina post-mortem 6. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Per ottenere risultati interpretabili da questi metodi, LPS (o PBS) deve essere infuso solo nei dotti mammari, lasciando il tessuto adiacente indisturbati. Iniezione nel tessuto sottocutaneo circonda il capezzolo comporterà infiammazione a causa di un danno più che l&#39;infezione simulata. Iniezione di trypan blu colorante diluito in PBS è utile quando si impara la tecnica. Figura 3A mostra una ghiandola successo iniettato infuso con 100 ml di tripan blu in PBS. Come mostrato, solo l&#39;albero duttale deve essere riempito con la soluzione iniettata, e non dovrebbe essere bolo al sito di iniezione. Un &quot;bolo&quot; in questo contesto è un accumulo di liquido iniettato il capezzolo o nel tessuto che circonda il capezzolo senza infusione nell&#39;albero duttale. Questo è shproprio in Figura 3B. Si noti che le iniezioni pratica illustrate nella Figura 3 sono stati completati in una femmina al giorno 21 di lattazione. Durante l&#39;altezza di lattazione (giorni 8-10, la fase in cui viene iniettato LPS utilizzando il protocollo corrente), il latte è abbondante ed è difficile visualizzare i dotti e determinare se l&#39;iniezione è stata completata correttamente. Pertanto, i punti più tardi di orario di allattamento sono migliori per le iniezioni di pratica. Iniezione di LPS successo nei risultati mammarie condotti in un aumento di NF-kB attività all&#39;interno della ghiandola. Questo dovrebbe essere evidente nel topo giornalista upon IVIS imaging, e la ghiandola LPS-iniettato dovrebbe avere sostanzialmente più alta attività di luciferasi (misurata mediante conteggio di fotoni) rispetto al PBS-iniettato ghiandola, come mostrato nella Figura 2 (in media, la ghiandola LPS legge 200% del segnale di controllo PBS). Un aumento statisticamente significativo di luminescenza nelle ghiandole LPS-trattati come compAred al controllo controlaterale è stato raggiunto con la realizzazione di un gruppo di 4 topi 4. Un ulteriore studio ha inoltre utilizzato intraduttale iniezione mammaria di una E. coli o LPS in NF-kB giornalista transgenici. Simile al nostro lavoro, questi autori ha visto un aumento significativo dell&#39;attività giornalista 6 ore dopo E. coli iniezione 2. Si prega di notare, a causa costitutiva di NF-kB attività del cervello e di altri organi addominali, le teste e addomi dei nostri topi reporter dimostrano costantemente un segnale quando ripreso, anche al basale prima di qualsiasi manipolazione. Così, questo segnale deve essere ignorato per quanto riguarda questo esperimento. Un segnale evidente dovrebbe rimanere entro il LPS-iniettato ghiandola mammaria dopo la lettura dell&#39;immagine viene regolato per ridurre al minimo luminescenza di fondo nella ghiandola PBS. Figura 2 mostra le immagini con lo sfondo ridotto. Iniezione riuscita della ghiandola volontàpiù probabile risultato danni al capezzolo. Questo farà sì rilevato, a livello di infiammazione della pelle che sarà evidente upon imaging. Questo tipo di segnale ferimento sarà molto forte e limitato alla zona del capezzolo dove il danno, non emana tutta la ghiandola, come visto dopo una iniezione di successo LPS nei condotti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di procedura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig2.jpg" /> Figura 2. Risultati rappresentativi IVIS bioluminescente imaging. (A) immagine acquisita con sfondo ridotta, rivelando aumento dell&#39;attività luciferasica nel LPS-iniettato ghiandola. (B) Immagine da A con regione di quantificazioni di interesse aggiunto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4030/4030fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4030/4030fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3 iniezione pratica:.. Ghiandola mammaria iniettato colorante mediante iniezione intraduttale Per verificare la precisione della consegna attraverso il capezzolo, un topo al giorno 21 di lattazione è stato iniettato con 100 ml di colorante blu tripano diluito in PBS. Seguendo sacrificio, la ghiandola è stato esposto per la visualizzazione. (A) iniezione di successo e (B) bolo di colorante al capezzolo.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui ci avvaliamo di un transgenico NF-kB topo giornalista e una tecnica di iniezione ottimizzata per mastite modello, infiammazione del tessuto mammario più comunemente causata da un&#39;infezione batterica. La fase più critica in questa procedura è la stessa iniezione intraduttale. In pratica, di solito è evidente se l&#39;iniezione intraduttale ha avuto successo. L&#39;iniezione di agenti (LPS o PBS) dovrebbe sentire fluido e ci dovrebbe essere poca o nessuna resistenza come la siringa vie...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Lipopolisaccaride da Escherichia coli (LPS) </td><td> Sigma </td><td> L 2880 </td><td> sierotipo 055: B5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> 31 gauge siringa da insulina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 328438 </td><td> Ago corto </td></tr><tr><td> Forcipe </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 15908 </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione portata </td><td> Leica </td><td> M3Z </td><td></td></tr><tr><td> Terrell isoflurano, USP </td><td> MINRAD INC per Rx Elite </td><td> NDC 66794-011-25 </td><td></td></tr><tr><td> IVIS 200 sistema di imaging &lt;/ Td&gt; <td> Pinza (ex Xenogen) </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Siringa per iniezione luciferina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309597 </td><td> 1cc; 26G5 / 8 </td></tr><tr><td> D-Luciferin Firefly, sale di sodio monoidrato (Substrato Luciferin) </td><td> Biosynth Chimica e Biologia </td><td> L-8240 </td><td> Diluire a 10 mg / ml </td></tr></tbody></table>

iniezione intraduttale di lps come un modello murino di mastite: segnalazione visualizzato tramite un nf-kb reporter transgenico

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

Modelli animali di malattie umane sono necessarie per studiare rigorosamente fasi della progressione della malattia e meccanismi associati, e infine, come modelli pre-clinici per testare interventi. In questi metodi, si descrive una tecnica in cui il lipopolisaccaride (LPS) è iniettato nel topo ghiandola mammaria in allattamento tramite il beccuccio, efficace modellazione mastite, o infiammazione, della ghiandola. Ciò si traduce in una maggiore infezione simulati fattore nucleare kappa B (NF-kB) di segnalazione, come visualizzato attraverso l&#39;imaging bioluminescente di NF-kB topo reporter luciferasi 1. Il nostro obiettivo finale nello sviluppo di questi metodi era quello di studiare l&#39;infiammazione associata con mastite nella ghiandola in allattamento, che spesso include arrossamento, gonfiore, e infiltrazione di cellule immunitarie 2,3. Pertanto, eravamo consapevoli che incisione o qualsiasi tipo di ferite della pelle, il capezzolo, o la ghiandola per introdurre i LPS possono fermarsinon essere utilizzati nei metodi poiché l&#39;approccio sarebbe probabilmente confondere il read-out di infiammazione. Abbiamo anche voluto uno straight-forward metodo che non ha richiesto appositamente realizzati disegnati a mano pipette o l&#39;uso di micromanipolatori di detenere tali strumenti specializzati in atto. Così, abbiamo deciso di utilizzare una siringa da insulina disponibile in commercio e per iniettare l&#39;agente nel condotto mammaria di un capezzolo intatta. Questo metodo ha avuto successo e ci ha consentito di studiare l&#39;infiammazione associata con iniezione di LPS assenza di effetti addizionali sovrappone il processo di iniezione. Inoltre, questo metodo anche utilizzato un NF-kB reporter di luciferasi di topo transgenico e bioluminescente tecnologia di imaging per mostrare visivamente e quantitativamente maggiore NF-KB di segnalazione all&#39;interno della ghiandola iniettato LPS-4. Questi metodi sono di interesse per i ricercatori di molte discipline che desiderano malattia modello all&#39;interno della ghiandola mammaria durante l&#39;allattamento, in quanto in ultima analisi, la tecnicaqui descritto potrebbe essere utilizzato per l&#39;iniezione di un certo numero di sostanze, e non è limitato a solo LPS.

Qui descritto è una tecnica in cui viene iniettato lipopolisaccaride nella ghiandola mammaria topo lattazione tramite il beccuccio per simulare mastite, una condizione comunemente causata da infezione batterica. Risultati lipopolisaccaride iniezione in una maggiore fattore nucleare kappa B (NF-kB) di segnalazione, visualizzato attraverso l&#39;imaging bioluminescente di NF-kB topo reporter della luciferasi.

Iniezione intraduttale di LPS come un modello murino di mastite: Segnalazione Visualizzato tramite un NF-kB Reporter transgenico

I modelli animali di malattie umane sono necessari per studiare rigorosamente le fasi della progressione della malattia e i meccanismi associati e, in ultima analisi, come...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la mastite o l'infiammazione della ghiandola mammaria, e più specificamente visualizzare e quantificare l'attività di NF Kary all'interno di una ghiandola lattante infiammata. Questo viene ottenuto innanzitutto incrociando una femmina transgenica reporter di NF Kappa b con un maschio di tipo selvaggio. Otto giorni dopo la nascita della prole, il lipopolisaccaride viene introdotto nella ghiandola lattante della femmina mediante una tecnica di iniezione introduttiva, che non danneggia completamente il sito di iniezione sei ore dopo l'iniezione.Il topo viene sottoposto a imaging bioluminescente per rilevare l'attività della luciferasi nella ghiandola mammaria. In definitiva, i risultati possono mostrare una significativa attività di NF κB nelle ghiandole trattate con LPS mediante l'utilizzo del metodo di iniezione intraduttale, seguito da imaging bioluminescente. Il principale vantaggio del nostro approccio rispetto ad altri metodi di iniezione intraduttale è che il sito di iniezione non subisce alcun danno.Questo è assolutamente fondamentale se si prevede di studiare l'infiammazione associata all'iniezione di LPS, poiché qualsiasi d

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Fonte: Radulovic, K., et al. Iniezioni di lipopolisaccaridi nei topi per imitare l'ingresso di prodotti derivati da microbi dopo la rottura della barriera intestinale. J. Vis. Esp. (2018)Questo video mostra una procedura passo dopo passo per iniettare lipopolisaccaridi (LPS) nei topi intraperitonealmente per indurre infiammazione sistemica.

Iniezione intraperitoneale di lipopolisaccaride batterico nei topi per studiare le risposte immunitarie sistemiche

Un protocollo per la consegna intraduttale non invasiva di reagenti acquosi alla ghiandola mammaria topo è descritto. Il metodo si avvale di iniezione localizzato nei capezzoli delle ghiandole mammarie destinati dotti mammari in particolare. Questa tecnica è adattabile per una varietà di composti compresi siRNA, agenti chemioterapici e piccole molecole.

Iniezione intraduttale per Localizzato Drug Delivery per il mouse ghiandola mammaria

Il protocollo immunofluorescenza indiretta descritto in questo articolo consente il rilevamento e la localizzazione delle proteine ​​nella ghiandola mammaria del mouse. Un metodo completo è dato per la preparazione di campioni della ghiandola mammaria, per eseguire immunoistochimica, per l'immagine delle sezioni di tessuto al microscopio a fluorescenza, e di ricostruire le immagini.

Immunofluorescenza indiretta su sezioni congelate di mouse ghiandola mammaria

Questo protocollo attuale impiega reporter fluorescenti, marcatura in vivo e tecniche di imaging intravitale per consentire il monitoraggio del processo dinamico di priming dei neutrofili negli animali viventi.

Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

Il metodo descritto qui consente la visualizzazione dell'attivazione dell'infiammazione dipendente dal promotore IL-8 nei polmoni dei topi attraverso la bioluminescenza non invasiva (BLI). Lo stesso animale può essere sottoposto a più volte BLI per un massimo di due mesi a partire dal momento della consegna del costruttore di reporter luciferasi.

Un modello di topo transgenizzato IL-8 per il<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio a lungo termine delle risposte infiammatorie

Qui è presentato un protocollo per simulare l'ingresso di composti derivati batterici dopo la violazione della barriera intestinale. Una bassa dose subletale di lipopolisaccaride è stata iniettata sistemica in topi, che sono stati monitorati per 24 h post-iniezione. L'espressione delle citochine pro-infiammatorie è stata determinata a parecchi punti di tempo nella milza, nel fegato e del colon.

Iniezioni di Lipopolysaccharide in topi per simulare l'ingresso di prodotti microbici derivati dopo la violazione della barriera intestinale

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere un nuovo approccio di modellazione del cancro al seno basato sull'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime Cre nelle ghiandole mammarie dei topi. Questo approccio consente la manipolazione sia di tipo cellulare che di un organo degli eventi oncogeni in modo controllato temporaneamente.

Modellare il cancro al seno tramite un'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime la creminazione nella ghiandola mammaria del topo

Qui, descriviamo un semplice metodo di imaging confocale per visualizzare la localizzazione in situ delle cellule che secernono la gamma di interferone citochina negli organi linfoidi secondari murini. Questo protocollo può essere esteso per la visualizzazione di altre citochine in tessuti diversi.

Imaging di In Situ Interferon Gamma Production nella Spleen del topo dopo l'infezione da Listeria monocytogenes

Descriviamo un'iniezione intracisternache che impiega un ago piegato sulla punta che può essere stabilizzato al cranio, eliminando così il rischio di danni al parenchyma sottostante. L'approccio può essere utilizzato per la mappatura genetica del destino e manipolazioni delle cellule leptomeningeee e per il monitoraggio del movimento del fluido cerebrospinale.

Induzione di cellule leptomeningeali Modifica tramite iniezione intracisternale

Viene descritto un metodo di iniezione intraduttale di reagenti per una soluzione ablativa a base di etanolo all'albero duttale mammario di topo per l'imaging in vivo e la prevenzione del cancro al seno. L'iniezione direttamente nell'apertura del capezzolo consente di colpire le cellule epiteliali mammarie con un danno tissutale collaterale minimo.

Somministrazione intraduttale e visualizzazione a raggi X della soluzione ablativa a base di etanolo per la prevenzione e il trattamento locale del cancro al seno in modelli murini

Il presente protocollo descrive l'iniezione intraduttale di vettori virali attraverso la tettarella per fornire geni di interesse nelle cellule epiteliali mammarie.

In vivo Consegna genica nelle cellule epiteliali mammarie di topo attraverso l'iniezione intraduttale mammaria

Scopri un modello murino di mastite mediante iniezione intraduttale di LPS e imaging bioluminescente per visualizzare l'attività NF-κB. Questa tecnica consente di studiare l'infiammazione della ghiandola mammaria in vivo.

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Iniezione intraduttale di LPS come un modello murino di mastite: Segnalazione Visualizzato tramite un NF-kB Reporter transgenico

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