Il processo di Green Monster per la generazione di ceppi di lieviti trasporto gene delezioni multiple

L'obiettivo generale di questa procedura è generare ceppi di lievito portatori di multiple delezioni marcate con un gene reporter che codifica per una proteina fluorescente verde. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando dei mutanti aploidi singoli denominati pro monster, ognuno dei quali contiene un cassette di delezione GFP al posto di uno dei geni bersaglio. Il secondo passaggio consiste nell'associare le delezioni attraverso l'accoppiamento e la sporulazione di ceppi di lievito, utilizzando due set di marcatori per la selezione diploide e aploide denominati rispettivamente GM toolkit A e GM toolkit alpha, che sono presenti anche nei ceppi pro monster.

Successivamente, cellule altamente fluorescenti vengono selezionate dalla popolazione mitotica mediante citometria a flusso per arricchire i ceppi portatori di due delezioni. L'ultimo passaggio consiste nella conferma dei genotipi dei ceppi ordinati. Infine, ripetuti cicli di accoppiamento e arricchimento citometrico a flusso, avviati dai ceppi ottenuti, portano alla generazione di ceppi multi-delezione con un numero maggiore di delezioni.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il metodo G per il riutilizzo dei marcatori e la delezione sequenziale dei geni, è che possono essere ottenute più delezioni per ciclo, consentendo un assemblaggio più rapido di ceppi multi-mutanti. Dopo la generazione dei pro-monster, come descritto nel protocollo scritto allegato a questo video, si inizia il ciclo sessuale preparando colture dei ceppi di pro-monster con delezione GFP in un tubo Eppendorf da 1,6 millilitri per lo scambio d'aria. Preparare il ceppo con delezione del tipo di accoppiamento A in 100 microlitri di mezzo sintetico completo privo di istidina, indicato come mezzo -his. Preparare inoltre il ceppo con delezione del tipo di accoppiamento alfa in 100 microlitri di mezzo sintetico completo privo di leucina, o mezzo -leu, in un tubo Eppendorf da 1,6 millilitri per lo scambio d'aria.

Praticare dei fori nei tappi delle provette utilizzando un ago da puntina trattato con etanolo al 70%. Ruotare orizzontalmente le provette a 30 gradi Celsius durante la notte. L'asse della rotazione deve essere parallelo all'asse longitudinale della provetta.

Stimando dalla densità ottica, mescolare circa 250.000 cellule a aploidi e 250.000 cellule alfa aploidi di ceppi con delezione GFP in un tubo Eppendorf da 1,6 millilitri. Questo numero di cellule corrisponde solitamente a sette microlitri di ciascuna coltura notturna vorticata. Centrifugare quindi le cellule a 800 ×g per due minuti.

Dopo aver rimosso il supinato, praticare un foro sul coperchio utilizzando un ago da puntina trattato con etanolo al 70%. Per consentire lo scambio d'aria, aggiungere 50 microlitri di mezzo YPDA e dopo un'energica agitazione, centrifugare il campione a 800 ×g per cinque minuti. Quindi posizionare il tubo in una scatola umida realizzata con una scatola vuota per puntali, un piccolo supporto per puntali e un tovagliolo di carta bagnato.

Incubare la piastra durante la notte a 30 gradi Celsius. Trasferire 10 microlitri della miscela di accoppiamento in 500 microlitri di mezzo GNA senza agar contenente gli antibiotici G418 e nat in un tubo di coltura da cinque millilitri con coperchio allentato; la densità ottica iniziale a 600 nanometri è approssimativamente 0,1. Ruotare la coltura a 30 gradi Celsius per 24 ore.

Questo permette la selezione di diploidi poiché solo i diploidi che contengono sia MX quattro nel kit GM A sia nat MX quattro possono crescere in presenza di G quattro 18 e Nat. Trasferire 20 microlitri di coltura di un giorno in 500 microlitri di mezzo GN fresco contenente G quattro 18 e nat. La densità ottica iniziale a 600 nanometri è approssimativamente 0,2.

Ruotare il tubo a 30 gradi Celsius per cinque ore per portare le cellule alla fase logaritmica. Successivamente, correlare i diploidi e isolare le spore. Seguire la procedura descritta nel protocollo scritto.

Procedere dividendo la sospensione di cellule correlate a SPO in due parti da 300 microlitri e posizionare ciascuna in una provetta eppendorf da 1,5 millilitro separata. Centrifugare le provette a 800 ×g per cinque minuti. Dopo la rimozione del supernatante S, praticare un foro nel coperchio di ciascuna provetta.

Utilizzando un ago da puntina, aggiungere 100 microlitri di mezzo meno his al pellet di un tubo. Per selezionare gli aploidi PT dell'altro tubo, aggiungere 100 microlitri di mezzo meno loo. Per selezionare gli aploidi alfa.

Ruotare le provette a 30 gradi Celsius durante la notte. La densità ottica finale a 600 nanometri dovrebbe essere inferiore a 0,5. Se la densità ottica a 600 nanometri tende ad essere troppo elevata, provare a temperatura ambiente.

Per indurre la GFP, aggiungere 100 microlitri di mezzo fresco senza hiss o senza LU contenente 20 microgrammi per millilitro di doxiciclina alle diverse ceppi. La concentrazione finale di doxiciclina è di 10 microgrammi per millilitro. Vortexare il tubo e incubare a 30 gradi Celsius per due giorni.

Per iniziare la citometria a flusso, aggiungere 900 microlitri di tampone TE prefiltrato in un tubo in polipropilene da cinque millilitri, sostituendo il tappo con un tappo filtrante proveniente da un tubo in polistirene da cinque millilitri. I tubi in polipropilene sono adatti per la citometria a flusso. Il tappo filtrante è consigliato per rimuovere le particelle di grandi dimensioni.

Posizionare delicatamente 75 microlitri del buffer sul cappuccio del filtro cellulare. Aggiungere 25 microlitri delle cellule indotte alla soluzione presente sul cappuccio, premendo la punta della pipetta contro la maglia. Espellere tutta la soluzione combinata attraverso il filtro.

Premere il coperchio del filtro e vorticare il tubo. Preparare i tubi di raccolta, tubi fendor da 1,6 millilitri riempiti con 200 microlitri di mezzo meno hiss o meno lubrificante. Avviare il citofluorimetro e regolare le impostazioni secondo il manuale del produttore.

Vortexare le provette di raccolta per ricoprire la parete con il mezzo. Vortexare anche la provetta contenente le cellule prima di caricarle nel citofluorimetro. Acquisire i dati di citometria a flusso del campione.

Un ceppo privo di GFP può fungere da controllo negativo. Tracciare le porte per l'ordinamento al fine di evitare aggregati cellulari, che potrebbero mostrare un'intensità elevata di GFP. Scartare gli outlier con larghezza d'impulso o area eccessivamente grandi rispetto allo scatter in avanti, abbreviato FSC, utilizzando un grafico di larghezza d'impulso e altezza d'impulso, oppure un grafico di area FSC e altezza FSC.

Dato che un alto FSC è previsto solo per gli aggregati cellulari, selezionare le cellule appartenenti al 20% inferiore di FSC. Evitare le regioni con i valori più bassi di FSC e di scattering laterale o SSC, dove si trovano spesso detriti cellulari. Il segnale di SSC e quello di GFP sono spesso positivamente correlati.

Per evitare l'arricchimento delle cellule con un valore SSC più elevato, tracciare una finestra lungo il perimetro della popolazione utilizzando un grafico dell'intensità di GFP e SSC per selezionare una percentuale simile delle cellule più brillanti da ciascun punto lungo l'asse SSC complessivamente. Lo 0,1-1% della sottopopolazione selezionata mediante le finestre di FSC e SSC prima di questo passaggio deve essere contrassegnato per il sorting; eseguire il sorting di 200 cellule nel tubo di raccolta. Vortexare il tubo di raccolta per ricoprire le cellule ordinate con il mezzo della piastra.

Un sottoinsieme di cellule sulla piastra A-Y-P-D-A per il genotipaggio. Incubare la piastra a 30 gradi Celsius per due giorni dopo l'incubazione. Preparare un lisato da circa 12 colonie.

Seguire i passaggi descritti nel protocollo scritto per il genotipaggio. Analizzare un microlitro di un lisato diluito utilizzando una reazione PCR da 10 microlitri con un primer diretto. Questo primer si lega alla regione a monte di ciascun gene eliminato, abbinato a un primer comune che si lega a tutti i loci di delezione.

La PCR può essere eseguita in un formato a 96 o 3 84 pozzetti dopo l'amplificazione. Analizzare i prodotti della PCR mediante elettroforesi.

Identificare gli aploidi probabili di avere i genotipi desiderati. Stabilire questi ceppi su una piastra fresca. Inoltre, congelarli in glicerolo al 25% a meno 80 gradi Celsius.

Sono consigliati test aggiuntivi, come la conferma dell'assenza di sequenze di tipo selvatico per geni eliminati e l'elettroforesi su gel post-campo. Ripetere il ciclo sessuale con ceppi utili. Alla progenie aploide derivata dall'incrocio di due ceppi è stato indotto l'espressione di GFP.

Ogni delezione genica aveva un cassette GFP analizzata mediante porte in un citometro a flusso, selezionando una popolazione delle cellule risultanti. È improbabile che questa popolazione contenga detriti o aggregati cellulari. L'1% delle cellule più brillanti è stato ordinato e trattenuto mediante selezione delle cellule in base all'area dello scatter anteriore e all'altezza dello scatter anteriore.

Aggregati cellulari, che tendono ad avere un'area di scattering in avanti sproporzionatamente elevata, sono stati esclusi mediante selezione cellulare basata sullo scattering in avanti e sullo scattering laterale; sono state accettate le cellule nel 20% inferiore per scattering in avanti, escludendo al contempo i detriti giornalieri con i valori più bassi di scattering in avanti e scattering laterale. La selezione cellulare è stata effettuata in base allo scattering laterale e al segnale GFP: tra le cellule comprese in un determinato intervallo di scattering laterale, sono state prese quelle più fluorescenti, al fine di consentire il confronto tra il mix miotico e il campione di controllo negativo che non esprime GFP. Un GA identico a quello utilizzato per selezionare la popolazione P tre è mostrato nel diagramma. Per le cellule selezionate in modo analogo del controllo negativo, in un diverso ciclo aploide, sono state analizzate mediante PCR dopo essere state indotte all'espressione di GFP e separate in base alla fluorescenza. Il numero previsto di delezioni in una cellula non ordinata risultante da segregazione casuale era 7,5.

In questo esperimento specifico, le cellule ordinate avevano un numero medio di delezioni di 8,8 più o meno 0,3, inclusa una popolazione di cinque cellule contenenti 10 delezioni. Genotipo DO. Il PCL dei ceppi ordinati è stato eseguito utilizzando un primer inverso.

Quel 10 si lega alla regione a valle abbinata a un primer diretto. Quel 10 si lega all'estremità del cassetto. La presenza di una banda indica la presenza del cassetto GFP.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il metodo verde Monster per realizzare delezioni nel lievito.