Name: Il processo di Green Monster per la generazione di ceppi di lieviti trasporto gene delezioni multiple (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-15T15:03:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Scopri il metodo Green Monster per generare ceppi di lievito con delezioni multiple marcate da GFP. Impara l'accoppiamento, l'arricchimento per citometria a flusso e la conferma genotipica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal contratto US Research Projects Agency Defense N66001-12-C-4039 a YS, un finanziamento della Alfred P. Sloan Foundation per RSL, e US National Institutes of concede Salute HG003224 R01 e R21 CA130266 a FPRFPR era supportato anche da una borsa di studio presso l&#39;Istituto canadese per la ricerca avanzata e per l&#39;eccellenza di ricerca del Canada programma di sedie.

1. Generazione di ProMonsters <ol><li> Preparare la cassetta universale sostituzione GFP, amplificando un tetO 2-GFP marcatore e il marcatore URA3 dal plasmide pYOGM012 (resistenza all&#39;ampicillina) utilizzando primer con le sequenze: GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG e GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (regioni in grassetto fornire omologia con le regioni a fianco della cassetta KanMX4 permettendo la sostituzione mirata). La reazione PCR deve essere effettuata con Phusion polimerasi, tampone HF, e il 3% dimetilsolfossido (New England Biolabs) a partire dalla concentrazione di stampo di DNA di 0,5 ng / pl. Il programma PCR è di 98 ° C per 30 sec e 35 cicli di 98 ° C per 10 sec, 49 ° C per 30 sec e 72 ° C per 1,5 min. Il volume di reazione deve essere&gt; 50 pl per fornire abbastanza DNA per ciascun esperimento di trasformazione. Abbiamo purificareil prodotto utilizzando un QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) con ~ 50 pl della reazione PCR trasformati per colonna, ma saltando la fase di purificazione può aumentare la resa dei trasformanti. In alternativa, rilasciare un frammento contenente il tetO 2-GFP e marcatori URA3, nonché regioni omologhe per KanMX4 targeting, digerendo il plasmide pYOGM057 (resistenza all&#39;ampicillina) utilizzando l&#39;enzima di restrizione EcoRI (New England Biolabs). La concentrazione di DNA in questa reazione dovrebbe essere ~ 30 ng / mL. Il volume di reazione deve essere&gt; 34 microlitri. Per integrare la cassetta GFP in una regione diversa KanMX4, regolare la regione omologia dei primer PCR sopra per le opportune sequenze omologhe. </li><li> Trasformare un un ceppo aploide della collezione KanMX4 eliminazione diretta lievito 12 con la cassetta universale eliminazione GFP. In seguito il protocollo da Woods e Gietz 13 0,34 microlitri dellaCampione di DNA (prodotto di PCR purificato o non purificato digestione di restrizione) deve essere usato per ogni esperimento trasformazione. Piastra un quinto trasformazione della miscela su un CAA-Ura piastra (0,67% base azotata di lievito, 2% di glucosio, 0,6% di acido Casamino, 0,0025% emisolfato adenina, 0,005% triptofano, e 2% agar). </li><li> Streak i trasformanti su un nuovo CAA-Ura piastra per ottenere colonie isolate. </li><li> Trasferire le cellule da una colonia su un piatto YPDA contenente 200 ug / ml di G418 per confermare l&#39;assenza di crescita. Per confermare il successo dell&#39;integrazione GFP, seguire la procedura (1.5) - (1.9) per eseguire colonia PCR. </li><li> Aggiungere cellule prelevate da una colonia in 2 ml di tampone di lisi (0,1 M fosfato di sodio, pH 7,4, 1 zymolyase unità da ZymoResearch) in una provetta da 0,2 ml PCR o un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Mescolare pipettando la soluzione in e fuori di una punta di pipetta. </li><li> Overlay con una goccia (circa 20 pl) di olio minerale con un Pipetman P200 (Gilson). </li><li> Incubare la miscela a 37 °C per 20 minuti e poi a 95 ° C per 10 min. </li><li> Diluire il lisato con 50 microlitri di acqua. Mescolare pipettando la soluzione in e fuori dieci volte. </li><li> Analizzare 1 ml del lisato utilizzando 10 ul reazioni di PCR con (A) un primer forward che ricombina con la regione fiancheggiante monte accoppiato con un primer del CCTGAGAAAGCAACCTGACC sequenza (285 bp dall&#39;inizio della cassetta), (B) un inverso primer che si ricombina con la regione a valle accoppiato con un primer del GCATTGGGTCAACAGTATAG sequenza (375 bp dall&#39;estremità), (C) due primer che annealing a KanMX4 con le sequenze CGTACTCCTGATGATGCATG e GACGAAATACGCGATCGCTG (181 bp), e (D) due primer che ricottura alla sequenza wild-type del gene mirato (Figura 4). (D) è importante perché circa l&#39;8% dei ceppi appartenenti alle collezioni di eliminazione sono noti per contenere aneuploidia 14. Un trasformante corretta dovrebbe essere positivo (A) e (B), e negativa con (C) e (D). </li><li> Per introdurre unGMToolkit nel trasformante, aggiungere circa 250.000 cellule dal ceppo trasformato e 250.000 cellule di entrambi RY0146 (contenente GMToolkit-a) o RY0148 (contenente GMToolkit-α) in una provetta da 1,6 ml Eppendorf. Vortex. I genotipi di RY0146 e RY0148 sono MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-a [CMVpr-rtTA KanMX4 STE2pr-Sp-his5] e MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-α [CMVpr-rtTA NatMX4 STE3pr- LEU2], rispettivamente. pr denota promotore. Numero di cellulare deve essere definita sulla base della densità ottica della cultura precedente. </li><li> Centrifugare a 800 xg per 2 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante. </li><li> Per consentire il ricambio dell&#39;aria, un foro sul coperchio utilizzando una puntina trattato con etanolo al 70%. </li><li> Aggiungere 50 ml di YPDA media (1% estratto di lievito, 2% peptone, 2% di glucosio, e 0,003% hemisulfat adeninae). Vortex. </li><li> Centrifugare a 800 xg per 5 min. </li><li> Porre il tubo in una scatola umida. Questo può essere realizzato con una scatola vuota punta, uno stand piccolo suggerimento, e un tovagliolo di carta bagnato. </li><li> Incubare la casella notte a 30 ° C. </li><li> Selezionare diploidi accoppiati dalla prima strisciando le celle di un CAA-Ura piastra. Incubare la piastra a 30 ° C per un giorno. </li><li> Prendendo cellule dal bulk zona, striscia fuori per rendere colonie isolate su piastre YPDA (1% estratto di lievito, 2% peptone, glucosio 2%, 0,003% emisolfato adenina, e 2% agar) contenenti 200 pg / ml di G418 per selezionare diploidi contenente GMToolkit-a o 100 pg / ml nourseothricin (Nat) 15 per la selezione diploidi contenenti GMToolkit-α. </li><li> Incubare la piastra a 30 ° C per 3 giorni. </li><li> Partendo da una colonia isolata, trasferire la maggior parte delle cellule a 500 pl di mezzo GNA senza agar (estratto di lievito 1%, 3% brodo nutriente Difco, e il 5% di glucosio, glucosio autoclave e il resto della tha componenti separatamente come 2 × soluzioni per evitare caramellizzazione) in un 5 ml provetta con il coperchio allentato. </li><li> Ruotare il tubo orizzontalmente per cinque ore a 30 ° C. L&#39;asse di rotazione deve essere parallela all&#39;asse longitudinale del tubo. </li><li> Verificare che le colonie utilizzati in (1.21) sono Ura + strisciando fuori su un CAA-Ura piastra. </li><li> Centrifugare la provetta a 800 xg per 2 minuti. Eliminare il surnatante. </li><li> Aggiungere 500 pl di mezzo di sporulazione minima (1% acetato di potassio, acetato di zinco 0,005%; filtro-sterilizzare). Vortex. </li><li> Centrifugare la provetta a 800 xg per 2 minuti. Eliminare il surnatante. </li><li> Repeat (1.25) - (1.26) due volte. </li><li> Aggiungere 1 ml di mezzo di sporulazione minima supplementato con 7,5 ug / ml lisina, 7,5 ug / ml leucina, 5 pg / ml istidina, 5 pg / ml di metionina, e 1,25 mg / ml uracile (per aumentare il tasso di sporulazione dei ceppi auxotrophic) . Vortex. </li><li> Ruotare il tubo a temperatura ambiente per un giorno. </li><li> Ruotare il tubo a 30 ° C per 2 giorni. </li><li> Centrifugare 125 pl di questa miscela in una provetta da 1,6 ml Eppendorf a 800 xg per 2 min. Eliminare il surnatante. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione zymolyase (100 mM tampone fosfato di sodio, pH 7,4, 1 M sorbitolo, e due unità da zymolyase ZymoResearch). Mescolare pipettando la soluzione in e fuori di una punta di pipetta. </li><li> Incubare a 30 ° C per 1 ora. </li><li> Aggiungere 50 ml di 0,02% NP-40. Mescolare pipettando la soluzione in e fuori di una punta di pipetta. </li><li> Lasciare il tubo a temperatura ambiente per cinque minuti. </li><li> Aggiungere 500 ml di acqua. </li><li> Mettere la provetta in ghiaccio. </li><li> Sonicare questa miscela due volte l&#39;impostazione di uscita 1 (impostazione più debole) per 15 secondi con un 3,2 mm microtip con Sonifier 450 (Branson). Tra i due cicli di sonicazione, mettere il tubo in ghiaccio per riportare la temperatura a ~ 0 ° C. </li><li> Centrifugare le provette a 800 xg per 5 min. Eliminare il surnatante. </li><li> Aggiungere 200 ml di SC-Ura-His(A) o SC-Ura-Leu (α) medio, a seconda che la croce è per incorporare GMToolkit-a o GMToolkit-α. Per preparare i mezzi di comunicazione, rendono SC-Ura-His-Leu medio (0,67% base di azoto di lievito, 2% di glucosio, 0,01% arginina, acido aspartico 0,01%, 0,01% di acido glutammico, isoleucina 0,01%, 0,01% di lisina, metionina 0,01% , 0,01% fenilalanina, serina 0,08%, 0,04% treonina, tirosina 0,002%, 0,03% valina, 0.0025% adenina, triptofano 0,005%, 0,003% adenina e triptofano 0,005%) e integrare con istidina sterile o leucina prima dell&#39;uso al concentrazione finale di 0,01%. </li><li> Praticare un foro sul coperchio utilizzando una puntina trattato con etanolo al 70%. </li><li> Ruotare il tubo orizzontalmente a 30 ° C per 2 giorni. L&#39;asse di rotazione deve essere parallela all&#39;asse longitudinale del tubo. </li><li> Streak le celle di un SC-Ura-His o SC-Ura-Leu piastra di agar (gli stessi ingredienti di cui sopra più 2% di agar, acido aspartico e treonina deve essere aggiunto dopo unutoclaving, aggiungere o istidina leucina prima di versare) per rendere colonie isolate per i ceppi ProMonster. </li></ol> 2. Ciclismo sessuale <ol><li> Ruotare una coltura di un ceppo di GFP stabilito delezione in 100 pl di SC-His (a) o SC-Leu (α) secondo il tipo di accoppiamento a 30 ° C per una notte con un 1,6 ml provetta Eppendorf. Per il ricambio dell&#39;aria, fare un foro con una puntina da disegno trattato con etanolo al 70%. Ruotare il tubo orizzontalmente. L&#39;asse di rotazione deve essere parallela all&#39;asse longitudinale del tubo. È possibile attraversare ceppi multipli tramite accoppiamento in massa. Quando un campione viene ordinato direttamente utilizzato per questo scopo, coltivare le cellule in 200 pl a 30 ° C per 2 giorni. Per preparare il mezzo, aggiungere uracile (concentrazione finale: 0,0025%) e istidina (0,01%) o leucina (0,01%) per SC-Ura-His-Leu medie. </li><li> Mescolare 250.000 a-cellule aploidi e 250.000 α-cellule aploidi di ceppi di delezione GFP in un 1,6 ml Eppendorf tubo. Vortex. </li><li> Mate queste cellule seguendo i passaggi da (1.11) - (1.17). </li><li> Trasferire 10 microlitri della miscela di accoppiamento per mezzo GNA 500 microlitri contenente 200 ug / ml di G418 e 100 pg / ml Nat in 5 ml di una provetta di coltura con un coperchio allentato. La partenza OD 600 è circa 0,1. </li><li> Ruotare la coltura a 30 ° C per 24 ore. Questo permette la selezione di diploidi perché solo diploidi contenente sia KanMX4 in GMToolkit-a e NatMX4 in GMToolkit-α può crescere in presenza di G418 e Nat (Figura 3). </li><li> Trasferire 20 microlitri della cultura di un giorno a 500 ml di fresca GNA contenente G418 e Nat. La partenza OD 600 è circa 0,2. </li><li> Ruotare il tubo a 30 ° C per 5 ore per portare le cellule alla fase log (OD 600 di ~ 1). </li><li> Seguire i passi (1.24) - (1.38) per le sporulare diploidi e isolare spore. </li><li> Suddividere la sospensione di cellule in due sporigeni 300-plparti e mettere ciascuno in un separato da 1,5 ml provetta Eppendorf. </li><li> Centrifugare le provette a 800 xg per 5 min. Eliminare il surnatante. </li><li> Per il pellet di un tubo, aggiungere 100 ml di SC-Il suo mezzo per selezionare una-aploidi. Al pellet di altro tubo, aggiungere 100 microlitri di SC-Leu medie per selezionare α-aploidi. </li><li> Ruotare le provette a 30 ° C per una notte. Il finale OD 600 deve essere inferiore a 0,5. Se OD 600 tende ad essere troppo alto, prova a coltura a temperatura ambiente. </li><li> Per indurre GFP, aggiungere 100 microlitri di fresco SC-His (a) o SC-Leu (α) contenente 20 mg / ml di doxiciclina. La concentrazione finale di doxiciclina è di 10 mcg / ml. Vortex. </li><li> Ruotare le provette a 30 ° C per 2 giorni. </li></ol> 3. Citometria a Flusso <ol><li> Aggiungere 900 pl di prefiltrata tampone TE (pH 7,5) contenente 10 ug / ml di doxiciclina al 5 ml provetta di polipropilene (BD Falcon # 352.063) con il tappo scambiato con un cellularetappo filtro da 5 ml in polistirene (BD Falcon # 352235). Tubi in polipropilene sono adatti per citometria a flusso. Il tappo filtro è desiderato per rimuovere le particelle più grandi. </li><li> Posizionare delicatamente 75 ml di tampone TE con doxiciclina sulla cellula-filtro cap. </li><li> Aggiungere 25 ml di cellule indotte alla soluzione sul tappo. </li><li> Mentre si preme la punta della Pipetman contro la maglia, spara tutta la soluzione combinata attraverso il filtro. </li><li> Premere verso il basso il coperchio filtro e il tubo di vortice. </li><li> Preparare le provette di raccolta (1,6 ml provette Eppendorf) riempiti con 200 ml di SC-His o SC-Leu. </li><li> Avviare il cell sorter e regolare le impostazioni in base al manuale del produttore. </li><li> Vortex sia il tubo di raccolta (per rivestire la parete con il mezzo) e la provetta contenente le cellule prima di caricarle sul cell sorter. </li><li> Acquisire dati citometria a flusso del campione. Un ceppo non contenenti GFP può essere un controllo negativo. </li><li> Disegna cancelli per l&#39;ordinamento. (A)Per evitare di aggregati di cellule, che potrebbero presentano alta intensità GFP, eliminare valori anomali con larghezza di impulso sproporzionatamente grande per forward scatter (FSC) con un terreno di larghezza di impulso e l&#39;altezza di impulso per MoFlo sorter o sproporzionatamente piccola altezza FSC usando un diagramma di altezza FSC e FSC area per FACSAria sorter (Figura 5, in alto a sinistra del pannello). (B) dal grande FSC (area) è previsto per aggregati di cellule, soltanto in cellule inferiore al 20% in FSC, evitando regioni con il minor dispersione FSC e laterale (SSC) valori dove detriti cellulari è spesso trovato (figura 5, in alto a destra del pannello). (C) SSC (area) e GFP segnale (area) sono spesso correlati positivamente. Perché semplicemente tenendo brillanti cellule indicate le porte sopra avrebbe anche arricchito di cellule con un alto valore SSC, disegnare un cancello lungo la periferia della popolazione usando un diagramma dell&#39;intensità GFP e SSC a prendere una percentuale simile di brillanti cellule da ciascun punto dell&#39;asse SSC (Figura 5, bottom-sinistra lo schema). La popolazione selezionata in (C) dovrebbe essere 0,1-1% della popolazione selezionata in (B). </li><li> Ordina 200 cellule nel tubo di raccolta tenuto conto dei criteri di cui (3.10). Per un processo in massa o per altri progetti richiedono una popolazione più complesso, ordinare altre cellule come necessario. </li><li> Vortex il tubo di raccolta per coprire le celle filtrate con terreno. </li><li> Piastra un sottogruppo di cellule (per esempio, 50 celle) su una piastra YPDA per la genotipizzazione. </li><li> Incubare la piastra a 30 ° C per 2 giorni. </li><li> Fai un lisato per ~ 12 colonie seguendo la procedura (1.5) - (1.8). </li><li> Trasferire le cellule residue sulla punta utilizzata in (1.5) in un posto su un piatto contenente YPDA G418 e Nat toccando delicatamente la piastra con la punta. Aploidi selezionati non dovrebbero crescere su questa piastra. Diploidi può avere copie GFP più e possono quindi essere più luminoso. Questo test può mostrare l&#39;efficienza della selezione aploide. </li><li> Per la genotipizzazione, analisi 1 ml del lisato con 10 microlitri PCR reaction con un primer forward che si appaia alla regione fiancheggiante monte di ogni gene soppresso accoppiato con un primer del CCTGAGAAAGCAACCTGACC sequenza. Multiplex PCR reazioni, se possibile (condizioni può essere determinata utilizzando lisati di singoli mutanti). PCR può essere fatto in un 96 - o 384 pozzetti. Quest&#39;ultimo formato è adatto per il volume di reazione di soli 5 microlitri. Formare gli array di PCR Master Mix differenti in primers e aggiunta di lisati cellulari di queste miscele possono essere effettuati utilizzando pipetta multicanale o un robot di manipolazione dei liquidi. Suggerimento cambiamenti sono facoltativi quando si aggiunge il lisato stesso a diverse miscele di PCR. </li><li> Analizzare prodotti di PCR. Il Gel XL sistema Ultra V-2 elettroforesi (Labnet) è compatibile con il caricamento del campione utilizzando pipette multicanale. </li><li> Sulla base di informazioni da (3.16) e (3.18), identificare aploidi probabile che hanno voluto genotipi. </li><li> Stabilire questi ceppi su un piatto fresco (YPDA, CAA-Ura, o SC-Ura-His/Leu). Inoltre, li congelare in25% glicerolo a -80 ° C. Test aggiuntivi come conferma l&#39;assenza di sequenze wild-type per geni eliminati e pulsed-field gel elettroforesi sono raccomandati. </li><li> Ripetere ciclismo sessuale da (2.1) con ceppi utili. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Come abbiamo sviluppato l&#39;approccio verde mostro, eravamo preoccupati con la possibilità di ricombinazione tra i diversi cassetti di ricambio GFP, con conseguente riarrangiamento del genoma. Attenuare contro questa possibilità è la selezione per le cellule che hanno superato con successo a vari cicli di accoppiamento e meiosi. Cellule recanti genomi riarrangiati dovrebbero essere meno misura dopo l&#39;accoppiamento di cellule senza un riarrangiamento identica. In effetti, non abbiamo osservato alcuna instabilità de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente o strumento </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1720 </td><td> Sciogliere in acqua e filtro-sterilizzare (0,2 micron filtro). Image concentrazione: 200 mg / ml. Conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> ClonNAT (nourseothricin) </td><td> WERNER BioAgents </td><td> 5001000 </td><td> Sciogliere in acqua e filtro-sterilizzare (0,2 micron filtro). Image concentrazione: 100 mg / ml. Conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9891 </td><td> Sciogliere in etanolo al 50% e filtro-sterilizzare (0,2 micron filtro). Foto di concentrazione: 10 mg / ml. Fai fresco ogni quattro settimane. Scudo da luce utilizzando un foglio di alluminio e conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Zymolyase </td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Difco lievito di azoto di base w / o aminoacidi </td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td> Revolver (rotatore per tubi) </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td> Enduro XL Gel elettroforesi unità </td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td> Microtip per Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria cella sorter </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MoFlo cella sorter </td><td> Beckman-Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX o robot equivalente </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Facoltativo. Per la realizzazione di PCR di genotipizzazione. </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

il processo di green monster per la generazione di ceppi di lieviti trasporto gene delezioni multiple

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Fenotipi di una delezione del gene sono spesso rivelati solo quando la mutazione viene testato in un contesto particolare genetica o 1,2 condizione ambientale. Ci sono esempi in cui molti geni devono essere eliminati per smascherare le funzioni del gene nascoste 3,4. Nonostante il potenziale di scoperte importanti, interazioni genetiche che coinvolgono tre o più geni sono in gran parte inesplorate. Ricerche esaustive di multi-mutanti interazioni sarebbe impraticabile a causa del gran numero di possibili combinazioni di delezioni. Tuttavia, studi di insiemi di geni selezionati, quali giochi di paraloghi con una maggiore possibilità di scambio priori una funzione comune, sarebbe informativo. Nel lievito Saccharomyces cerevisiae, knockout gene è realizzato sostituendo un gene con un marcatore selezionabile tramite ricombinazione omologa. Poiché il numero di marcatori è limitata, sono stati sviluppati metodi per rimuovere e riutilizzare il sam<html> 5,6,7,8,9,10 e marcatore. Tuttavia, sequenzialmente mutazioni ingegneria multipli utilizzando questi metodi richiede tempo perché il tempo richiesto scale linearmente con il numero di delezioni da generare. Qui si descrive il metodo Verde Monster per routine ingegnerizzazione molteplici delezioni nel lievito 11. In questo metodo, una proteina verde fluorescente (GFP) reporter integrato in delezioni viene utilizzato per quantitativamente ceppi etichette secondo il numero delle delezioni contenuti in ogni ceppo (Figura 1). Cicli ripetuti di assortimento di GFP-segnate delezioni tramite accoppiamento lievito e meiosi accoppiato con citometria a flusso arricchimento di ceppi che trasportano più di queste delezioni portare all&#39;accumulo di delezioni in ceppi (Figura 2). Esecuzione di più processi in parallelo, con ogni processo che incorpora uno o più delezioni per round, riduce il tempo richiesto per la costruzione ceppo. contenuto &quot;&gt; Il primo passo è quello di preparare aploidi singolo mutanti chiamato &#39;ProMonsters,&#39; ciascuno dei quali porta un reporter GFP in un luogo cancellato e uno dei &#39;toolkit&#39; loci-sia-una GMToolkit verde Monster o GMToolkit-α al . can1Δ locus (Figura 3) utilizzando ceppi della collezione delezione lievito 12, GFP-marcate delezioni possono essere convenientemente generato sostituendo il comune KanMX4 cassetta esistente in questi ceppi con un universale GFP - URA3 frammento Ogni GMToolkit contiene:. sia l&#39;una - o α-accoppiamento di tipo-specifico marcatore di selezione aploide 1 ed esattamente uno dei due marcatori che, quando entrambi sono presenti GMToolkits, collettivamente permettere una selezione di diploidi. Il secondo passo è quello di effettuare il ciclismo sessuale attraverso cui loci cancellare possono essere combinate in una singola cellula dal assortimento casuale e / o recomb meioticaminazione che accompagna ogni ciclo di accoppiamento e la sporulazione.

Quando un ceppo aploide portare quattro eliminazioni GFP segnalati (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) è stata incrociata con un α-ceppo aploide portare quattro eliminazioni (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), con due eliminazioni (ycl033cΔ yer042wΔ) condiviso da due ceppi, da un rappresentante risultato è stato ottenuto. La miscela di accoppiamento è stato coltivato in terreno contenente YPDA G418 e Nat per selezionare diploidi. Le diploidi risultanti sono state coltivat...

Il metodo Green Monster consente l&#39;assemblaggio rapido di delezioni multiple contrassegnati con un reporter gene codificante proteina fluorescente verde. Questo metodo si basa sulla guida ceppi di lievito attraverso cicli ripetuti di assortimento sessuale di delezioni e basato sulla fluorescenza arricchimento di cellule che trasportano più eliminazioni.

Il processo di Green Monster per la generazione di ceppi di lieviti trasporto gene delezioni multiple

I fenotipi derivanti dalla delezione di un gene vengono spesso rivelati solo quando la mutazione viene testata in un particolare background genetico o in una specifica condizione ambientale1,2. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare ceppi di lievito portatori di multiple delezioni marcate con un gene reporter che codifica per una proteina fluorescente verde. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando dei mutanti aploidi singoli denominati pro monster, ognuno dei quali contiene un cassette di delezione GFP al posto di uno dei geni bersaglio. Il secondo passaggio consiste nell'associare le delezioni attraverso l'accoppiamento e la sporulazione di ceppi di lievito, utilizzando due set di marcatori per la selezione diploide e aploide denominati rispettivamente GM toolkit A e GM toolkit alpha, che sono presenti anche nei ceppi pro monster.Successivamente, cellule altamente fluorescenti vengono selezionate dalla popolazione mitotica mediante citometria a flusso per arricchire i ceppi portatori di due delezioni. L'ultimo passaggio consiste nella conferma dei genotipi dei ceppi ordinati. Infine, ripetuti cicli di accoppiamento e arricchimento citometrico a flusso, avviati dai ceppi ottenuti, portano alla generazione di ceppi multi-delezione con un numero maggiore di delezioni.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il met

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GFP-fusion proteine ​​sono ampiamente utilizzati per visualizzare organelli mediante microscopia confocale. Tuttavia, lo screening per le mutazioni che influenzano la morfologia degli organelli generalmente richiede mutagenesi individuale e richiede molto tempo. Qui, dimostriamo un metodo per integrare simultaneamente organello-GFP marcatori in quasi 5.000 non essenziali geni nel lievito.

Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

Presentato qui è una descrizione unificata di tecniche che possono essere utilizzati per sviluppare, trasformare, amministrare e verificare l'espressione della proteina eterologa dei probiotici lievito Saccharomyces boulardii.

Trasformazione di lievito probiotico e il loro recupero da gastrointestinali immunitario tessuti dopo sonda gastrica nei topi

Presentiamo un protocollo dettagliato per costruire e selezionare librerie mutanti per campagne di evoluzione diretta in Saccharomyces cerevisiae.

Diretto Evolution Metodo<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creazione e screening

Riportiamo qui i metodi sulla manipolazione genetica molecolare del ceppo Po1g di Yarrowia lipolytica per migliorare l'efficienza della delezione genica. I ceppi ingegnerizzati di Y. lipolytica risultanti hanno potenziali applicazioni nella produzione di biocarburanti e biochimici.

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La manipolazione genetica del patogeno per le piante<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Per studiare Fungal Biology and Plant Microbo Interazioni

Mutanti di delezione genica generati attraverso la ricombinazione omologa sono il gold standard per gli studi di funzione genica. Viene descritto il metodo OSCAR (costruzione di una fase di Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) per una rapida generazione di costrutti di delezione. La trasformazione fungina mediata da Agrobacterium segue. Infine, viene presentato un metodo di conferma basato su PCR delle delezioni geniche nei trasformanti fungini.

Produzione rapida del taglio nei funghi via<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Trasformazione mediata di componenti di eliminazione OSCAR

Viene presentata una strategia per generare mutazioni nei geni istonici nella loro posizione endogena in Saccharomyces cerevisiae.

Mirata<em&gt; In Situ</em&gt; mutagenesi dell&#39;istone geni in germogliamento lievito

Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per mutagenesi casuale di un determinato gene in lievito di fissione. Ad esempio, noi target rpt4 +, che codifica per una subunità del proteasoma 19S e schermo per le mutazioni che destabilizzare eterocromatina.

Gene targeting mutagenesi casuale per selezionare eterocromatina-destabilizzare Proteasome mutanti in lievito di fissione

L'emizigozia reciprocata tramite sequenziamento (RH-seq) è un nuovo potente metodo per mappare la base genetica di una differenza tra le specie. I pool di emizigotes sono generati dalla mutagenesi trasposonista e la loro forma fisica è monitorata attraverso la crescita competitiva utilizzando il sequenziamento ad alto tutto. L'analisi dei dati risultanti individua i geni alla base del tratto.

Mappatura genetica delle differenze di termotolleranza tra le specie di Saccamici Yeast tramite l'analisi dell'emizigosità reciproca genomica

L'obiettivo di questo protocollo è fornire una guida dettagliata e dettagliata per assemblare costrutti multi-genico utilizzando il sistema di clonazione modulare basato sulla clonazione di Golden Gate. Fornisce anche raccomandazioni sui passaggi critici per garantire un assemblaggio ottimale in base alle nostre esperienze.

Assemblaggio rapido di costrutti multi-gene utilizzando la clonazione modulare del Golden Gate

Scopri il metodo Green Monster per generare ceppi di lievito con delezioni multiple marcate da GFP. Impara l'accoppiamento, l'arricchimento per citometria a flusso e la conferma genotipica.

Il processo di Green Monster per la generazione di ceppi di lieviti trasporto gene delezioni multiple

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