Il processo di Green Monster per la generazione di ceppi di lieviti trasporto gene delezioni multiple

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare ceppi di lievito portatori di delezioni multiple contrassegnate da un gene riportato da una proteina fluorescente verde. Ciò si ottiene preparando prima singoli mutanti aplo, chiamati mostri professionali, ognuno dei quali porta una cassetta di delezione GFP al posto di uno dei geni bersaglio. Il secondo passo consiste nell'assortire le delezioni attraverso l'accoppiamento e la porzione di ceppi di lievito utilizzando due serie di marcatori di selezione diploidi e aploidi denominati GM toolkit A e GM toolkit alpha, che sono presenti anche nei ceppi pro monster.

Successivamente, le cellule altamente fluorescenti vengono selezionate dalla popolazione miotica utilizzando la citometria a flusso per arricchire i ceppi portatori di due delezioni. Il passaggio finale consiste nel confermare i genotipi dei ceppi selezionati. Alla fine, cicli ripetuti di accoppiamento e arricchimento citofluorimetrico, a partire dai ceppi risultanti, portano alla generazione di ceppi di multi delezione orum più elevati.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il metodo G per il riutilizzo dei marcatori e la delezione genica sequenziale, è che è possibile acquisire più delezioni per ciclo, con conseguente assemblaggio più rapido di multimutanti Dopo la generazione di mostri professionali, come descritto nel protocollo scritto che accompagna questo video, inizia il ciclo sessuale preparando colture dei ceppi di delezione GFP pro monster in un tubo orph da 1,6 millilitri. Preparare la delezione, ceppo di accoppiamento di tipo A in 100 microlitri di terreno completo sintetico privo di istamina indicato come meno il suo mezzo. Preparare anche il ceppo di delezione del tipo alfa di accoppiamento in 100 microlitri di terreno completo sintetico privo di leucina o meno lu in un tubo orph da 1,6 millilitri per il ricambio d'aria.

Praticare dei fori nei tappi delle provette utilizzando una puntina trattata con etanolo al 70%. Ruotare i tubi orizzontalmente a 30 gradi Celsius durante la notte. L'asse di rotazione deve essere parallelo all'asse longitudinale del tubo.

La stima della densità ottica ha mescolato circa 250.000 cellule aplo-aplo-cellulari e 250.000 cellule alfa-aplo-cellulari di ceppi di delezione GFP in una provetta einor da 1,6 millilitri. Questo numero di cellule corrisponde solitamente a sette microlitri di ogni vortice di coltura notturna. Le cellule procedono alla produzione di queste celle centrifugando prima a 800 G per due minuti.

Dopo aver rimosso il supinato, praticare un foro sul coperchio utilizzando una puntina trattata con etanolo al 70%. Per consentire il ricambio d'aria, aggiungere 50 microlitri di terreno YPDA dopo una centrifuga a vortice veloce e ottenere un guadagno di 800 G per cinque minuti. Quindi posizionare il tubo in una scatola umida creata con una scatola di puntali vuota, un piccolo supporto per puntali e un tovagliolo di carta bagnato.

Incubare la scatola per una notte a 30 gradi Celsius. Trasferire 10 microlitri della miscela di accoppiamento in un terreno GNA da 500 microlitri senza agar contenente antibiotici G 4 1 8 e nat in una provetta di coltura da cinque millilitri con un coperchio allentato, la densità ottica iniziale di 600 nanometri è circa 0,1. Ruotare la coltura a 30 gradi Celsius per 24 ore.

Ciò consente la selezione dei diploidi perché solo i diploidi contenenti entrambi possono MX quattro nel toolkit GM A e nat MX quattro. Nel toolkit GM, Alpha può crescere in presenza di G, quattro, 18 e Nat trasferire 20 microlitri della coltura di un giorno a 500 microlitri di terreno GN fresco contenente G, quattro, 18 e netto. La densità ottica iniziale a 600 nanometri è di circa 0,2.

Ruotare la provetta a 30 gradi Celsius per cinque ore per portare le celle alla fase logaritmica. Per s, correlare i diploidi e isolare le spore. Seguire la procedura descritta nel protocollo scritto.

Procedere a dividere la sospensione di cellule correlate a SPO in due parti da 300 microlitri e mettere ciascuna in un tubo di orph separato da 1,5 millilitri. Centrifugare le provette a 800 G per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante S, praticare un foro nel coperchio di ciascuna provetta.

Usando una puntina, aggiungere 100 microlitri di minus his medium al pellet di un tubo. Per selezionare un haplos al PT dell'altro tubo, aggiungere 100 microlitri di terreno meno loo. Per selezionare alpha haplos.

Ruotare i tubi a 30 gradi Celsius durante la notte. La densità ottica finale a 600 nanometri dovrebbe essere inferiore a 0,5. Se la densità ottica a 600 nanometri tende ad essere troppo alta triolo a temperatura ambiente.

Per indurre la GFP, aggiungere 100 microlitri di terreno fresco meno sibilo o meno LU contenente 20 microgrammi per millilitro, doxiciclina ai diversi ceppi. La concentrazione finale di doxiciclina è di 10 microgrammi per millilitro. Agitare il tubo e ruotarlo a 30 gradi Celsius per due giorni.

Per iniziare la citometria a flusso, aggiungere 900 microlitri di tampone TE prefiltrato a una provetta in polipropilene da cinque millilitri con il tappo sostituito con un tappo del filtro cellulare da una provetta in polistirene da cinque millilitri. Le provette in polipropilene sono adatte per la citometria a flusso. Il tappo del filtro è necessario per rimuovere le particelle di grandi dimensioni.

Posizionare delicatamente 75 microlitri di tampone sul tappo del filtro cellulare. Aggiungere 25 microlitri di cellule indotte alla soluzione sul tappo premendo la punta del perpe e contro la rete. Sparare tutta la soluzione combinata attraverso il colino.

Premere il tappo del filtro e far vorticare il tubo. Preparare le provette di raccolta, provette da 1,6 millilitri riempite con 200 microlitri di mezzo lubrificante meno sibilo o meno. Avviare lo smistatore di celle e regolare le impostazioni in base al manuale del produttore.

Agitare i tubi di raccolta per rivestire la parete con il fluido. Agitare anche il tubo contenente le cellule prima di caricarle sulla selezionatrice di cellule. Acquisire i dati di citometria a flusso del campione.

Un ceppo senza GFP può essere un controllo negativo. Disegnare i cancelli per lo smistamento per evitare aggregati cellulari, che potrebbero mostrare un'elevata intensità di GFP. Scartare i valori anomali con una larghezza dell'impulso sproporzionatamente grande o un'area per la diffusione diretta abbreviata FSC utilizzando un grafico dell'ampiezza e dell'altezza dell'impulso o un grafico dell'area FSC e dell'altezza FSC.

Poiché per gli aggregati cellulari è previsto un FSC di grandi dimensioni, solo le cellule nel 20% inferiore in FSC. Evitare le regioni con i valori più bassi di FSC e dispersione laterale o SSC dove si trovano spesso detriti cellulari. I segnali SSC e GFP sono spesso correlati positivamente.

Per evitare di arricchire le celle con un valore SSC più alto, disegnare un cancello lungo la periferia della popolazione utilizzando un grafico di intensità GFP e SSC per prelevare una percentuale simile delle cellule più luminose da ciascun punto lungo l'asse SSC del tutto. Lo 0,1-1% della sottopopolazione selezionata utilizzando i cancelli FSC e SSC prima di questo passaggio deve essere contrassegnata per lo smistamento del tipo 200 nella provetta di raccolta. Agitare la provetta di raccolta per coprire le celle selezionate con una piastra media.

Un sottoinsieme di cellule su piastra A-Y-P-D-A per la genotipizzazione. Incubare la piastra a 30 gradi Celsius per due giorni dopo l'incubazione. Crea un lisato per circa 12 colonie.

Seguendo i passaggi descritti nel protocollo scritto per la genotipizzazione. Analizzare un microlitro di un lisato diluito utilizzando una reazione PCR da 10 microlitri con un primer in avanti. Quel 10 si inginocchia nella regione fiancheggiante a monte di ciascun gene deleto abbinato a un primer comune che 10 si inginocchia all'interno di tutti i loci di delezione.

La PCR può essere eseguita in un 96 o 3 84. Formattare bene dopo l'amplificazione. Analizzare i prodotti della PCR mediante elettroforesi.

Identificare gli haplos che possono avere i genotipi desiderati. Stabilisci queste varietà su un piatto fresco. Congelali anche in glicerolo al 25% a meno 80 gradi Celsius.

Si raccomandano ulteriori test, come la conferma dell'assenza di sequenze wild type per i geni deleti e l'elettroforesi su gel post-campo. Ripeti il ciclo sessuale con ceppi utili. La progenie di Haplo da un incrocio di due ceppi è stata indotta ad esprimere GFP.

Ogni delezione genica aveva una cassetta GFP utilizzando cancelli con un citometro a flusso, è stata selezionata una popolazione delle cellule risultanti. È improbabile che contenga detriti o aggregati cellulari all'interno di questa popolazione. L'1% più luminoso delle celle è stato ordinato e trattenuto dalle celle di gating sulla base dell'area di dispersione diretta e dell'altezza di dispersione diretta.

Gli aggregati cellulari, che tendono ad avere un'area di diffusione diretta sproporzionatamente ampia o esclusi dalle celle di gating sulla base della dispersione diretta e delle celle di diffusione laterale nel 20% inferiore nella dispersione diretta, sono stati accettati, escludendo i detriti diurni con la dispersione diretta più bassa e la dispersione laterale mediante gating delle celle sulla base della dispersione laterale e del segnale GFP, sono state prese le cellule più fluorescenti tra quelle in un dato intervallo di dispersione laterale per consentire il confronto della miscela miotica e il campione di controllo negativo che non esprime GFPA GA identico a quello utilizzato per selezionare la popolazione P tre è mostrato nel diagramma. Per le cellule selezionate in modo simile del controllo negativo in un haplos separato sono state analizzate con PCR dopo essere state indotte ad esprimere GFP e ordinate in base alla fluorescenza. Il numero atteso di delezioni per una cellula non ordinata risultante dalla segregazione casuale era di 7,5.

In questo particolare esperimento, le celle ordinate avevano il numero medio di delezioni di 8,8 più o meno 0,3, comprese cinque celle contenenti 10 delezioni. Genotipo DO. Il PCL dei ceppi selezionati è stato eseguito utilizzando un primer inverso.

Quel 10 si inginocchia nella regione fiancheggiante a valle abbinato a un innesco in avanti. Quel 10 si inginocchia all'estremità della cassetta. La presenza di una banda indica la presenza della cassetta GFP.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il metodo del mostro verde per ingegnerizzare le delezioni nel lievito.