Valutazione funzionale della motilità intestinale e Wall infiammazione intestinale nei roditori: Analisi in un modello standardizzato di manipolazione intestinale

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è eseguire una manipolazione intestinale per studiare lo sviluppo e la risoluzione dell'ileo postoperatorio in un modello murino; ciò viene ottenuto mediante manipolazione standardizzata dell'intestino tenue tra due applicatori di cotone umido. Successivamente, vengono analizzati il transito gastrointestinale e quello colico per misurare la motilità postoperatoria. Infine, viene effettuata un'analisi istochimica e una coltura d'organo della muscolare esterna dell'intestino tenue, o me, per esaminare i livelli di infiammazione.

Si ottengono risultati che mostrano una marcata infiltrazione di granulociti neutrofili nella mucosa e una produzione eccessiva di ossido nitrico nelle colture di mucosa, con conseguente ritardo nei tempi di transito gastrointestinale e colico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo lo sviluppo e la risoluzione dell'ileo postoperatorio, nonché all'indagine di possibili strategie di profilassi o terapia. A dimostrare la procedura sarà Mario Lewison, un tecnico del nostro laboratorio. Dopo aver somministrato 0,8-1% di isoflurano in ossigeno a un topo maschio, posizionare l'animale in posizione supina e utilizzare del nastro adesivo per fissare gli arti.

Utilizzare un lieve stimolo doloroso per verificare la sedazione profonda. Quindi eseguire una laparotomia mediana, lunga due centimetri. Successivamente, inserire due retrattori sterili per mantenere aperto l'addome ed eviscerare con cura l'intestino tenue verso sinistra, posizionandolo su garza di cotone bagnata.

Utilizzando due applicatori di cotone inumiditi, rimuovere il contenuto luminale dell'intero intestino tenue arrotolando contemporaneamente gli applicatori dal poro al cieco. Riposizionare l'intestino nella cavità peritoneale senza torcerlo, per prevenire ischemia o ostruzione meccanica, e chiudere con due strati di sutura continua in poliammide 5.0 non riassorbibile. Chiudere l'incisione addominale.

Posizionare l'animale sotto una lampada riscaldante e monitorarlo fino a quando non si riprende dall'anestesia. Successivamente, rimettere il topo nella sua gabbia e consentirgli l'accesso a cibo e acqua. Il giorno successivo.

Dopo aver anestetizzato completamente il topo, estendere con attenzione la testa e utilizzare pinze ottuse per estrarre la lingua; riempire una siringa da un millilitro con almeno 100 microlitri di dextrano marcato con fluoresceina. Collegarla a un catetere arterioso e inserire con cura il catetere come sonda gastrica nello stomaco. Iniettare rapidamente 100 microlitri di dextrano marcato con FITC ed estrarre il catetere.

Lasciare che l'animale riprenda conoscenza e attendere 90 minuti. Trascorsi i 90 minuti, praticare l'eutanasia al topo e rimuovere l'intero tratto gastrointestinale dallo stomaco al retto. Posizionare l'intestino su un supporto di polistirene ed evitare di stirarlo.

Successivamente, misurare la lunghezza totale dell'intestino tenue e del colon. Utilizzare delle cannule per fissare l'intestino al supporto in polistirene. Dividere l'intestino tenue in 10 segmenti uguali e il colon in tre segmenti uguali.

Dopo aver sezionato l'intestino nelle posizioni prestabilite, risciacquare una volta le sezioni con un millilitro di tampone Krebs-bicarbonato, o KHB. Trasferire le sezioni in provette da due millilitri etichettate consecutivamente e vorticare vigorosamente le provette prima di centrifugare i campioni. Successivamente, trasferire il sopranatante in provette pulite da 1,5 millilitri numerate.

Conservare a quattro gradi Celsius al buio fino all'analisi. Successivamente, pipettare aliquote duplicate di cento microlitri di ciascun sopranatante in una piastra nera a 96 pozzetti e utilizzare un lettore di fluorescenza per leggere la piastra al fine di verificare il tempo di transito colico dopo l'anestesia settimanale dell'animale.

Esaminare attentamente la pervietà del colon inserendo una fistola. Esplorare attraverso l'ano fino al colon utilizzando la sonda. Inserire una sfera di vetro di due millimetri a tre centimetri all'interno del colon, quindi rimuovere la sonda.

Avviare immediatamente un cronometro. Posizionare il topo in una gabbia trasparente e monitorarlo per tutta la durata necessaria all'espulsione della pallina. Per l'analisi istochimica di campioni medi.

Dopo aver prelevato segmenti di tessuto dall'intestino e averli immersi in KHB freddo in una piastra riempita di silicone, utilizzare aghi per insetti per fissare il mesentere alla piastra. Aprire i segmenti lungo il margine mesenterico e stirare il tessuto al 120% della sua lunghezza e larghezza. Fissare il tessuto con gli aghi a partire dal mesentere. Meccanicamente.

Separare la muscolare esterna o me dalla tunica mucosa. Fissare e colorare i campioni secondo la parte scritta di questo protocollo per la coltura. La me.

24 ore dopo la procedura di manipolazione intestinale, resecare l'intero intestino tenue e collocarlo in KHB freddo contenente penicillina, G e streptomicina. Tagliare l'intestino in segmenti lunghi tre centimetri e fissare ciascun segmento su una piastra di vetro rivestita di silicone utilizzando forbici fini. Rimuovere il mesentere e far scivolare l'intestino su un ago oscillante con pinze a punta fine.

Incidi delicatamente la mucosa e utilizza un applicatore di cotone umido. Staccala dalla sottomucosa e collocala in KHB freddo più Ps. Successivamente, taglia le strisce di mucosa in pezzi lunghi da due a quattro millimetri e incuba in KHB ghiacciato più PS per 30 minuti, risciacquando il campione più volte.

Quindi trasferisca circa 50-60 milligrammi di me in una piastra sterile da 24 pozzetti contenente 500 microlitri di DMEM. Incubi il tessuto a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per 24 ore. Raccogli il sopranatante e centrifuga a 1000 RCF per cinque minuti.

Quindi, spezzare e congelare rapidamente in azoto liquido per le misurazioni di citochine o di ossido nitrico. Infine, asciugare il tessuto muscolare per 30 secondi utilizzando un fazzoletto di carta pulito e quindi pesarlo. Il parametro più importante per valutare la gravità dell'ileo postoperatorio è l'esame del transito gastrointestinale o GIT in vivo.

Questa figura mostra una tipica distribuzione del dextrano-FITC lungo il tratto gastrointestinale in controlli non trattati e in topi sottoposti a manipolazione intestinale, 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Come mostrato qui, gli animali sottoposti a intervento fittizio hanno presentato un transito gastrointestinale normale, con un centro geometrico calcolato nel cieco. Mentre Im ha determinato un significativo ritardo nel transito gastrointestinale a livello del jejunum prossimale, nell'analisi della motilità colica mediante l'uso di una sfera di vetro, i topi sottoposti a intervento fittizio hanno espulso la sfera entro 48-200 secondi, mentre Im ha prolungato il tempo di espulsione a 470-775 secondi al fine di misurare l'infiammazione.

All'interno del ME, i livelli di leucociti sono stati analizzati mediante istochimica o immunohistochimica, come mostrato qui. Nei topi di controllo sono stati osservati pochi neutrofili polimorfonucleati; tuttavia, nell'intestino tenue si è assistito a un forte infiltrato. Molti mediatori infiammatori liberati dalle cellule sono difficili da rilevare nei tessuti.

Le colture organotipiche di lisati permettono il rilevamento di marcatori infiammatori nella coltura. Il surnatante, un mediatore rappresentativo nella IOP, è l'ossido nitrico, o NO, che è un importante neurotrasmettitore inibitorio nel tratto gastrointestinale. Questa figura mostra che il NO non è stato rilevato nel ME.

Nei colture d'organo, nei supernatanti di controllo e negli animali sottoposti a intervento fittizio nei topi, sono stati osservati livelli basali di nno. Tuttavia, le colture di topi sottoposti a manipolazione intestinale producono significativamente più nno dopo un'incubazione di 24 ore. Una volta padroneggiata, questa tecnica di manipolazione intestinale può essere eseguita entro 15 minuti se effettuata correttamente.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre l'ileo postoperatorio nei topi e di come analizzarne la gravità.