Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare l'espressione di micro RNA nelle microglia. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando il cervello e il midollo spinale, quindi omogeneizzando il tessuto del sistema nervoso centrale o SNC. Nel secondo passaggio, le cellule mononucleate del SNC vengono isolate mediante un gradiente percella, e successivamente la popolazione di microglia viene identificata mediante FACS.

Successivamente, l'RNA microgliale viene isolato e la qualità del campione viene analizzata. Infine, viene eseguita la PCR in tempo reale per il particolare microRNA di interesse. In definitiva, il metodo delta delta CT può essere utilizzato per mostrare il livello relativo di espressione di un particolare microRNA nelle microglia.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché non riescono ad isolare un numero sufficiente di cellule mononucleate dal SNC o perché il campione è contaminato da mielina e detriti cellulari. Entrambi i casi portano a una preparazione di bassa qualità, rispettivamente con bassa concentrazione di RNA o contaminazione proteica. A dimostrare la procedura sarò io e vir.

Dopo la perfusione di tutti i topi, dissezionare i cervelli e i midolli spinali. Quindi inserire un cervello e un midollo spinale alla volta in un omogeneizzatore da 15 millilitri aggiungendo cinque millilitri di PBS ai tessuti ogni volta. Dopo aver effettuato da 10 a 20 movimenti delicati, far passare l'omogeneato attraverso filtri cellulari da 70 micron in provette coniche individuali da 50 millilitri e centrifugare le provette da cinque a sette minuti a 834 ×g e a quattro gradi Celsius.

Dopo aver eliminato il soprannatante, risospendere l'omogenato di cervello e midollo spinale ottenuto da due o tre topi in cinque-sette millilitri di soluzione al 70% per cella. Quindi sovrapporre sette millilitri di soluzione al 40% per cella e centrifugare la soluzione cellulare per 30 minuti a 850 ×g a 20 °C senza frenata. Rimuovere le cellule danneggiate e il materiale inerte presente in cima alla soluzione al 70% per cella.

Quindi raccogliere le cellule mononucleate all'interfaccia tra le soluzioni al 70% e al 40% per call e diluire le cellule raccolte in PBS, almeno in un rapporto uno a uno. Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere il pellet in mezzo millilitro di PBS e trasferirle in una provetta einor da 1,7 millilitro. Iniziare trasferendo 50 microlitri delle cellule separate tramite gradiente di densità in una nuova provetta einor da 1,7 millilitro e aggiungere 350 microlitri di buffer fax alla provetta.

Quindi, dopo aver aggiunto da cinque a 10 microlitri di anticorpi anti FCR al tubo, incubare le cellule per 10-15 minuti sul ghiaccio. Suddividere il campione di cellule in due tubi eppendorf: in un tubo aggiungere un microlitro di anticorpi anti CD11B e due microlitri di anticorpi anti CD45.

Incubare le cellule per altri 10-15 minuti sul ghiaccio. Etichettare il secondo tubo come controllo negativo e posizionarlo sul ghiaccio. Dopo l'incubazione con gli anticorpi di marcatura, aggiungere un millilitro di buffer fax in entrambi i tubi e centrifugare le cellule in una microcentrifuga per cinque minuti a 1200 ×g.

Quindi fissare i pellet in 400 microlitri di paraformaldeide al 1% in PBS e vortexare i tubi per evitare l'aggregazione. Infine, analizzare le cellule mediante citometria a flusso utilizzando il campione di cellule di controllo negativo e le perline BD com. Iniziare immunizzando per via sottocutanea un gruppo di cinque-dieci topi C57 Black Six di età compresa tra otto e dodici settimane con 150 milligrammi di peptide MOG 35-55 in 4 milligrammi per millilitro di adiuvante completo di Freund per indurre l'EAE. Successivamente, somministrare tossina pertussica per via intraperitoneale al giorno zero e al giorno due post-immunizzazione.

Dopo aver isolato e colorato le cellule come appena mostrato, sospendere i pellet in 400 microlitri di PBS invece di fissativo subito prima dell'ordinamento. Quindi riempire due provette einor da 1,7 millilitro con 300 microlitri di PBS integrato con FBS al 10% per raccogliere i campioni. Infine, ordinare le popolazioni di microglia e macrofagi con elevata purezza utilizzando la strategia di gating illustrata in questo grafico di densità rappresentativo.

Dopo il sorting, ri-analizzare le popolazioni di microglia e macrofagi per determinare la purezza dei campioni cellulari isolati. Dopo aver centrifugato le popolazioni cellulari ordinate a 1200 ×g per cinque-sette minuti in una microcentrifuga, rimuovere con attenzione il soprannatante e congelare i pellet cellulari su ghiaccio secco. Successivamente, trasferire i pellet cellulari congelati sul ghiaccio normale.

Per la scongelazione, aggiungere 300 microlitri di buffer di lisi proveniente da un kit Nirvana, quindi mescolare delicatamente la soluzione cellulare aspirando e rilasciando dal pipettaggio da cinque a sette volte. Aggiungere poi 30 microlitri dell'additivo per omogeneizzato, vortexare la sospensione cellulare per 30 secondi e quindi posizionare i tubi sul ghiaccio per 10 minuti. Aggiungere ora 300 microlitri di fenolo acido, cloroformio e vortexare il tubo per altri 30 secondi.

Successivamente, dopo aver centrifugato le cellule per cinque minuti a 9.500 × g, trasferire con attenzione i 300 microlitri superiori del soprannatante contenente la fase acquosa in un nuovo tubo Eppendorf da 1,7 millilitri. Mescolare la soluzione con 375 microlitri di etanolo al 100%. Trasferire l'intero contenuto del tubo in una cartuccia filtrante del kit Nirvana e centrifugare la cartuccia per un minuto a 9.500 × g. Successivamente, scartare il buffer del flusso in eccesso.

Aggiungere 700 microlitri della soluzione di lavaggio 1 del kit Nirvana e centrifugare per un altro minuto a 9.500 ×g dopo aver lavato la cartuccia. Ripetere altre due volte con 500 microlitri della soluzione di lavaggio 2 del kit Nirvana. Eluire l'RNA dalla cartuccia con 60 microlitri di acqua priva di nucleasi preriscaldata.

Infine, utilizzare uno spettrofotometro NanoDrop per valutare la purezza e la quantità di RNA dopo aver eseguito la Q-R-T-P-C-R in tempo reale per rilevare il micro RNA nei campioni di microglia e macrofagi. Le curve P-R-T-P-C-R per i prodotti PCR marcati fluorescentemente di mere 1 24 e snow RNA 55 possono essere create come mostrato nel primo grafico. Vengono mostrate curve tipiche della quantità di prodotti PCR specifici marcati fluorescentemente per campioni di controllo di snow RNA 55 RNA isolati da microglia o macrofagi derivati dal midollo osseo, in confronto al numero di cicli di PCR.

Si noti come i valori CT per l'analisi dell'espressione di snow RNA 55 nelle diverse popolazioni cellulari siano determinati all'intersezione della linea di base con la parte inferiore del range lineare delle curve Q-R-T-P-C-R, come indicato nel grafico dalle linee verticali verdi e blu. In questo secondo grafico, viene mostrata la quantità di prodotti PCR specifici marcati con fluorocromo per i campioni sperimentali di RNA mere 1 24 provenienti da microglia o da macrofagi derivati dal midollo osseo, in funzione del numero di cicli di PCR. Si noti come i valori CT per l'analisi dell'espressione di mere 1 24 nelle diverse popolazioni cellulari siano nuovamente determinati all'intersezione della linea di base con la parte inferiore del range lineare delle curve Q-R-T-P-C-R, come indicato nel grafico dalle linee verticali verdi e blu.

Dopo aver determinato i valori di CT per ciascun campione, come per l'espressione di snow RNA 55 e mere 1 24 nelle microglia e nei BM dms di topi normali e con EAE mostrati in questa tabella, sottrarre il valore di CT del campione controllo snow RNA 55 dal valore di CT del campione sperimentale mere 1 24 per calcolare i valori delta CT per ciascun duplicato di ogni campione. Successivamente, sottrarre il delta CT del campione di riferimento dai valori delta CT degli altri campioni per calcolare i valori delta delta CT. Infine, il livello relativo di espressione per ogni campione viene calcolato come due elevato alla potenza di meno delta delta CT, come mostrato in questo grafico di densità.

Nel caso di un buon isolamento di microglia dal SNC normale, il 95-98% delle cellule sarà rappresentato da microglia CD11B positiva CD45 bassa, con il 2-5% della sospensione cellulare costituita da macrofagi perivascolari CD11B positivi CD45 alti; meno dell'1% saranno linfociti CD11B negativi CD45 alti, astrociti CD11B negativi CD45 negativi o cellule gliali oligodendrogliali o frammenti cellulari, presenti in misura comparativamente maggiore in un isolamento scadente. In quest’ultimo caso, si osserva una significativa contaminazione da cellule o frammenti cellulari CD11B negativi CD45 negativi, come astrociti o particelle di mielina, che rendono le cellule inadatte all'isolamento di RNA e ad ulteriori analisi. Inoltre, possono essere presenti cellule CD11B negative CD45 alte, indicando una contaminazione da linfociti ematici dovuta a una perfusione insufficiente. In questo grafico di densità, le tre popolazioni cellulari presenti nel SNC durante l'infiammazione neurologica — microglia CD11B positiva CD45 bassa, macrofagi CD11B positivi CD45 alti e linfociti CD11B negativi CD45 alti — sono mostrate in questa figura.

La qualità dell'RNA determinata mediante elettroforesi su gel dopo un'isolazione buona rispetto a una cattiva è mostrata. Quando l'RNA viene isolato in modo accurato, sono evidenti una scala di RNA e l'RNA ribosomiale; quando il processo di isolazione viene eseguito male, compaiono strisce diffuse e prodotti di degradazione a basso peso molecolare. Questi dati finali dimostrano l'espressione di meri 1 24 nelle microglia normali di adulti, nelle microglia di topi con EAE e nelle microglia isolate da topi durante le fasi iniziali dello sviluppo.

In questo primo grafico a barre, l'espressione relativa di mere 1 24 è molto maggiore nelle microglia del SNC normale rispetto a quella osservata nei macrofagi derivati dal midollo osseo. Analogamente, sebbene vi sia un aumento dell'RNA di mere 1 24 nei macrofagi del SNC di topi con EAE, le microglia esprimono comunque cinque volte la quantità di RNA di mere 1 24. Questo ultimo grafico a barre illustra come le variazioni nel livello di espressione di mere 1 24 nelle microglia durante lo sviluppo di topi di una, due e quattro settimane di età, rispetto a topi adulti di otto settimane, possano essere valutate anche con questo metodo durante il tentativo della procedura.

È importante ricordare di avere una quantità sufficiente e una buona qualità di cellule isolate, che garantiranno buoni risultati per l'intero esperimento.