Name: Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Impara a rilevare i microRNA nella microglia mediante PCR in tempo reale nel sistema nervoso centrale normale e durante la neuroinfiammazione. Questo metodo consente di analizzare l'espressione genica nelle cellule immunitarie residenti.

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Il lavoro è stato supportato dal NIH R01 NS071039-01A1 assegno di ricerca.

<ol><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li>
<li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li>
<li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li>
<li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C%2FEBPbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C%2FEBP-alpha-PU.1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li>
<li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li>
<li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+in+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li>
<li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Throughput+MicroRNA+Profiling%3A+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552(2011).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Recentemente notevole interesse è stato dato a microglia e il coinvolgimento di queste cellule in molte patologie associate neuroinfiammazione e neurodegenerazione. Inoltre, il ruolo dei microRNA nella differenziazione delle cellule immunitarie e cancro è drammaticamente cresciuta negli ultimi anni diversi 5,10. Abbiamo precedentemente riportato il ruolo di miR-124 nel mantenimento del fenotipo non attivata o di riposo della microglia nel CNS normali 7, ma il ruolo degli altri tipi di microRNA nel ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190 </td><td> Può essere preparati da componenti secchi nel pH laboratorio,: ​​7,2-7,4 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30258.02 </td><td> Può essere preparati da componenti secchi nel pH laboratorio,: ​​7,2-7,4 </td></tr><tr><td> DMEM; FBS </td><td> GBCO </td><td> 11965, 10438 </td><td></td></tr><tr><td> Mirvana kit </td><td> Invitrogen </td><td> AM1561 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937-500 ml </td><td> 100 ml di Percoll 100% viene preparato miscelando 10 ml di PBS 10X e 90 ml di Percoll da Sigma. 50 ml di Percoll 70% èpreparata miscelando di 35 ml di Percoll al 100% e 15 ml di DMEM 50 ml di Percoll 40% viene preparata miscelando 20 ml di Percoll al 100% e 30 ml di 1X PBS </td></tr><tr><td> MOG 35-55 peptide </td><td> AnaSpec Inc </td><td> 60130-5 </td><td></td></tr><tr><td> CFA </td><td> DIFCO </td><td> 263810 </td><td></td></tr><tr><td> Tossina della pertosse </td><td> Sigma </td><td> P7208 </td><td></td></tr><tr><td> FcR bloccando gli anticorpi </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Clone 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-CD11b - PE mAb </td><td> BD Biosciences </td><td> 553311 </td><td> Può essere utilizzato con fluorofori differenti (es. AF488) </td></tr><tr><td> Anti-CD45-APC-Cy7 mAbs </td><td> Biolegend </td><td> 103116 </td><td> Può essere utilizzato con fluorofori differenti (ad es APC) </td></tr><tr><td> Paraformalformaldeide (16%) </td><td> EMS Inc </td><td> 15710 </td><td> Diluire 1:15 in PBS 1X </td></tr><tr><td> 15% Urea TBE-Gel </td><td> Life Technologies Inc. </td><td> EC68855BOX </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4366596 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Universal PCR Master Mix </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td> Saggi TaqMan MicroRNA mmu-miR-124a </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001182 </td><td></td></tr><tr><td> Saggi TaqMan MicroRNA snoRNA-55 </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001228 </td><td></td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> Life Technologies Inc </td><td> AM9937 </td><td> Acqua priva di nucleasi </td></tr><tr><td> 384 pozzetti di reazione chiara ottica </td&gt; <td> Life Technologies Inc. </td><td> 4309849 </td><td> Possono essere sostituiti con altri (ad esempio piastre da 96 pozzetti) in tempo reale diversi strumenti PCR </td></tr><tr><td> Omogeneizzatore Dounce (15 ml) </td><td> Wheaton Science Products. </td><td> 358044 </td><td> Teflon / vetro </td></tr><tr><td> 40 μ nylon filtro cella </td><td> Falco </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga Big </td><td> Sorval </td><td> RT 6000B </td><td> Diametro rotore 18,5 centimetri </td></tr><tr><td> Centrifuga Piccolo </td><td> Eppendorf </td><td> 5415 R </td><td> Diametro rotore 6,5 centimetri </td></tr><tr><td> Real-time PCR Instrument </td><td> Life Technologies Inc. </td><td> AB 7900 HT </td><td> Possono essere sostituiti con altri strumenti </td></tr><tr><td> Citometro a flusso </td><td> BD Biosciencess </td><td> LSR II </td><td> Possono essere sostituiti con altri strumenti </td&gt; </tr><tr><td> FACS </td><td> BD Biosciences </td><td> FACSAria </td><td> Possono essere sostituiti con altri strumenti </td></tr><tr><td> Spettrofotometro NanoDrop </td><td> Thermo Scientific </td><td> NanoDrop 1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento dei microrna nella microglia da real-time pcr in cns normale e durante neuroinfiammazione

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia sono cellule della linea mieloide che risiedono nel sistema nervoso centrale (CNS) 1. Queste cellule hanno un ruolo importante in patologie di molte malattie associate neuroinfiammatoria come la sclerosi multipla (MS) 2. Microglia nel sistema nervoso centrale di un normale esprimere macrofagi CD11b marcatore e mostrano un fenotipo di riposo da esprimere bassi livelli di marker di attivazione quali CD45. Durante gli eventi patologici del sistema nervoso centrale, microglia si attivano come determinato dal upregulation di CD45 e di altri marcatori 3. I fattori che influenzano il fenotipo e le funzioni di microglia nel sistema nervoso centrale non sono ben studiati. I microRNA (miRNA) sono una famiglia crescente di molecole conservate (circa 22 nucleotidi) che sono coinvolte in molti processi fisiologici come la crescita e la differenziazione cellulare 4 e patologie come l&#39;infiammazione 5. MicroRNA downregulate l&#39;espressione di geni bersaglio determinati legame sequenze complementari dimRNA ir e svolgono un ruolo importante nella attivazione di cellule immunitarie innate tra macrofagi e microglia 6 7. Al fine di indagare miRNA-mediate percorsi che definiscono la microglia fenotipo, funzione biologica, e per distinguere microglia da altri tipi di macrofagi, è importante per valutare quantitativamente l&#39;espressione dei microRNA in particolari sottogruppi distinti del SNC residente microglia. Metodi comuni per misurare l&#39;espressione dei miRNA nel SNC includono quantitativa PCR da intero tessuto neuronale e ibridazione in situ. Tuttavia, quantitativa PCR da omogenato tissutale intero non consente la valutazione dell&#39;espressione di miRNA in microglia, che rappresentano solo 5-15% delle cellule del tessuto neuronale. Ibridazione in situ permette di valutare l&#39;espressione di microRNA in specifici tipi cellulari nelle sezioni di tessuto, ma questo metodo non è del tutto quantitativa. In questo rapporto descriviamo una quantitativa e sensitive metodo per la rilevazione di miRNA dal real-time PCR in microglia isolato dal sistema nervoso centrale normali o durante neuroinfiammazione con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello murino di sclerosi multipla. Il metodo descritto sarà utile per misurare il livello di espressione dei microRNA in cellule microgliali in CNS normali o durante neuroinfiammazione associato a varie patologie tra cui sclerosi multipla, ictus, lesioni traumatiche, morbo di Alzheimer e tumori cerebrali.

Microglia risiedono macrofagi che forniscono la prima linea di difesa e sorveglianza immunitaria del sistema nervoso centrale. I microRNA sono molecole regolatrici che svolgono un ruolo importante in molti processi fisiologici tra cui l&#39;attivazione e la differenziazione dei macrofagi. In questo articolo, si descrive il metodo per la misurazione dei microRNA in cellule microgliali.

Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione

Le microglia sono cellule della linea mieloide che risiedono nel sistema nervoso centrale (SNC)1. Queste cellule svolgono un ruolo importante nelle patologie di molti...

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare l'espressione di micro RNA nelle microglia. Ciò viene ottenuto innanzitutto dissezionando il cervello e il midollo spinale, quindi omogeneizzando il tessuto del sistema nervoso centrale o CNS. Nel secondo passaggio, le cellule mononucleate del CNS vengono isolate mediante un gradiente Percoll e successivamente la popolazione di microglia viene identificata mediante citometria a flusso.Successivamente, l'RNA microgliale viene isolato e la qualità del campione viene analizzata. Infine, viene eseguita la PCR in tempo reale per il particolare microRNA di interesse. In definitiva, il metodo delta delta CT può essere utilizzato per mostrare il livello relativo di espressione di un particolare microRNA nelle microglia.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché non riescono ad isolare un numero sufficiente di cellule mononucleate dal SNC o perché il campione è contaminato da midollo e detriti cellulari. Entrambi i casi portano a una preparazione di scarsa qualità, con una bassa concentrazione di RNA o contaminazione proteica, rispettivamente. A dimostrare la procedura sarò io e vir.Dott. O. collega da

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Immunologia e Infezioni

Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

Descriviamo un protocollo di PCR in tempo reale al profilo microRNA nel fluido cerebrospinale (CSF). Con l'eccezione di protocolli di estrazione di RNA, la procedura può essere estesa a RNA estratto da altri fluidi corporei, cellule coltivate, ei campioni di tessuto.

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

Attivazione microglia e microgliosis sono risposte chiave per neurodegenerazione cronica. Qui vi presentiamo i metodi per in vivo, la visualizzazione a lungo termine della retina CX3CR1-GFP + cellule microgliali di oftalmoscopia confocale, e per la soglia e le analisi morfometrica per identificare e quantificare la loro attivazione. Monitoriamo modifiche microgliali durante fasi iniziali di glaucoma all'età.

In Vivo Dynamics of Retinal microglia attivazione durante neurodegenerazione: confocale oftalmoscopico Imaging e Morfometria cellulare in mouse Glaucoma

Le microglia (cellule immunitarie del cervello), vengono utilizzate come biosensore surrogato per determinare come le nanoparticelle influenzano la neurotossicità. Descriviamo una serie di esperimenti progettati per testare la risposta microgliale alle nanoparticelle e l'esposizione dei neuroni ipotalamici al surnatante della microglia attivata per determinare la neurotossicità.

Microglia come un biosensore surrogato per determinare nanoparticelle neurotossicità

Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare microglia da cuccioli di topo postnatale (giorno 1) per la sperimentazione in vitro. Questo metodo improvvisato di isolamento genera sia elevata resa e purezza, un vantaggio significativo rispetto ai metodi alternativi che consente un'ampia gamma sperimentazione ai fini di chiarire biologia microglia.

Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Le colture primarie di microglia sono comunemente utilizzate per valutare nuove molecole anti-infiammatorie. Il presente protocollo descrive un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati.

Isolamento magnetico di cellule microgliali da topo neonato per colture cellulari primarie

Questo articolo descrive un metodo per l'osservazione cronica in vivo della microglia a riposo nell'ippocampo CA1 del topo utilizzando la chirurgia controllata con precisione e la microscopia a due fotoni.

In vivo Imaging cronico a due fotoni della microglia nell'ippocampo del topo

Descriviamo un protocollo per isolare le cellule microgliali dall'ipotalamo del topo (o piccole strutture cerebrali equivalenti) utilizzando il cell sorting attivato magneticamente (MACS), in un tempo relativamente breve. La microglia ipotalamica selezionata con MACS può essere utilizzata per analisi ex vivo e può essere piastrata per eseguire saggi in vitro .

Isolamento della microglia ipotalamica dal cervello di topo adulto appena perfuso mediante smistamento cellulare attivato magneticamente  

Questo articolo dimostra un metodo per visualizzare e quantificare la motilità della microglia e il contatto con i punti postsinaptici nella retina utilizzando la microscopia confocale a disco rotante.

Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia e delle interazioni con le sinapsi nella retina murina malata

Microgliale Parameters Software (MMPS) è una pipeline di analisi intuitiva che non richiede competenze di codifica e che semi-automatizza l'analisi della morfologia microgliale di singola cellula da immagini di immunofluorescenza. Validata in un modello di neuroinfiammazione indotta da lipopolisaccaridi di roditori, la MMPS rileva riproducibilmente i cambiamenti morfologici associati all'attivazione e consente un fenotipaggio microgliale standardizzato e scalabile.

Software per la Mappatura dei Parametri Microgliali (MMPS): Uno strumento open-source e facile da usare per l'analisi quantitativa della morfologia della microglia

Impara a rilevare i microRNA nella microglia mediante PCR in tempo reale nel sistema nervoso centrale normale e durante la neuroinfiammazione. Questo metodo consente di analizzare l'espressione genica nelle cellule immunitarie residenti.

Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione

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