Name: High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ricombinanti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Impara la purificazione ad alta portata di proteine ricombinanti con tag di affinità utilizzando robotica per la manipolazione di liquidi. Questo metodo automatizzato garantisce riproducibilità e riduce gli errori umani nelle analisi biochimiche.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un progetto Wellcome Grant (078043/Z/05/Z) a ROJW

A PARTE: High-throughput crescita di colture batteriche. 1. Crescere batteri Pernottamento in 2 ml di terreno autoinduzione Utilizzando piastre da 24 pozzetti <ol><li> Sterilizzare le piastre da 24 pozzetti da microonde. </li><li> Inoculare 1,5 ml di mezzo di autoinduzione (Overnight Medio Express) con appena cresciute colonie batteriche o stock glicerolo congelati. Di solito inoculare tre pozzi per mutante con tre singole colonie clonati. Riserva sei pozzetti per i controlli positivi e negativi. Per i controlli positivi si cresce tre cloni di tipo selvatico e per i controlli negativi si cresce 2 cloni che sono state trasformate con un plasmide che esprime non. Controllare per la sterilizzazione sufficiente della piastra lasciando un pozzetto vuoto per il medio-solo il controllo. </li><li> Crescere le cellule per 18 ore a 37 ° C e agitazione a 250 rpm. Usiamo lac-inducibile BL21 (DE3) Rosetta 2 celle. Medie autoinduzione contiene una miscela di glucosio e lattosio. I batteri inizialmentenutrono di glucosio e quindi iniziare ad utilizzare il lattosio, che induce anche l&#39;espressione delle proteine ​​ricombinanti. </li><li> Togliere il coperchio e posizionare la piastra sulla piattaforma robotica. </li></ol> PARTE B: Robotic purificazione di proteine ​​ricombinanti. 2. Preparare la piattaforma robotica <ol><li> Compongono il tampone costituito da 20 mM imidazolo, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetato, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% glicerolo, e il tampone di eluizione costituito di 0,5 M imidazolo, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetato, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% glicerolo. Questi buffer verrà utilizzato per lavare le perle dopo le proteine ​​marcate sono stati legati a loro, o per eluire le proteine ​​dalle perline, rispettivamente. </li><li> Portare il diluente batterico (100 ml di acqua distillata con 15 microlitri di reagente antischiuma). Questa soluzione sarà utilizzataeffettuare delle diluizioni delle colture batteriche durante la notte per la densità ottica (A600) misurazioni. La presenza di antischiuma nel diluente previene la formazione di bolle d&#39;aria che potrebbero interferire con le misurazioni lettore a piastra. </li><li> Portare la soluzione di lisi composto da reagente contropiede 10x, 2 lysonase microlitri per ogni campione e 15 mM MgOAc 2. Fastbreak contiene una miscela di detergenti e sali che rompono le pareti cellulari batteriche e facilitare il rilascio di proteine ​​intracellulari. Lysonase è una miscela brevettata di lisozima e una nucleasi. Lisozima aiuta a distruggere la parete cellulare e la nucleasi digerisce le Liberatoria acidi nucleici batterici. </li><li> Opzionale: Fare una M 6 soluzione cloridrato di guanidina. Alcune proteine ​​ricombinanti tendono ad attaccarsi agli aghi di pipettaggio rivestiti in teflon. Il cloridrato di guanidina soluzione denatura le proteine ​​e si lava di dosso più efficacemente di acqua che viene solitamente usata per sciacquare i lavabili suggerimenti robotici pipettaggio dopo ogni step. </li><li> Preparare la (acido bicinconinico) BCA reagente quantificazione delle proteine ​​miscelando una soluzione di acido bicinconinico (reagente A) e la soluzione di solfato di rame (reagente B): legami peptidici ridurre Cu 2 + dal componente 4 CuSO presente nel reagente BCA di Cu 1 + cui la quantità di Cu 1 + è proporzionale al numero di legami peptidici presenti nella soluzione. In una seconda fase, due molecole di acido bicinconinico chelato Cu 1 + conseguente cambiamento di assorbanza a 562 nm, risultante in un colore viola. La reazione del colore è dipendente dal tempo e ha bisogno di solito diverse ore per essere definitivo. Dopo che il colore è stabile per diverse ore. </li><li> Riempire abbeveratoi o piatti della giusta misura e metterli nelle loro posizioni pre-assegnati sulla piattaforma robotica. </li><li> Posizionare una piastra a 24 pozzetti per i rifiuti guanidina cloridrato, due lastre trasparenti a 96 pozzetti per OD 600 e misurazioni di assorbanza e una blu piastra a 96 pozzetti per the proteine ​​purificate sulle loro posizioni sulla piattaforma. Posizionare un 96-Deepwell piastra sul supporto magnetico. </li><li> Diluire MagneHis Ni-particelle che si legano le proteine ​​formando chelati con i loro suo-tag 5 volte in acqua distillata e riempirli nel tallone-agitazione unità. Accendere l&#39;agitatore a mantenere le microsfere in sospensione. </li><li> Accendere la piattaforma robotica e lavare gli aghi di dispensazione per alcuni minuti per eliminare le bolle d&#39;aria che altrimenti interferire con la precisione di pipettaggio. Gli aghi riutilizzabili pipettaggio sono lavata tra le fasi di pipettamento individuali. In alternativa, puntali monouso potrebbe essere utilizzato. Tutte le fasi successive sono eseguite robot. Il protocollo robot è disponibile su richiesta. </li></ol> 3. La crescita cellulare è verificato misurando la OD600 <ol><li> 10 pl di coltura durante la notte è diluito in 90 ml di soluzione diluente. </li><li> Misurare la OD 600 per garantire che i batteri sono cresciuti a densità simili(Figura 1). </li></ol> 4. Le cellule sono rotto fino a rilasciare le proteine ​​e per consentire Bead-binding <ol><li> 100 pl di sospensione magnetica Ni-bead è distribuito in ciascun pozzetto di una seconda piastra a 24 pozzetti. </li><li> 900 microlitri di ogni piccola coltura batterica è trasferito nella piastra a 24 pozzetti contenenti le perline. Aggiungere 100 microlitri della 10x contropiede / lysonase mix. </li><li> Il 24-pozzetti viene trasferito alla piattaforma agitazione per scuotimento rapido (800 rpm) per 30 minuti a temperatura ambiente. Pareti cellulari batteriche sono interrotti da una combinazione di forze meccaniche e agli agenti chimici e le proteine ​​ricombinanti prodotte vengono rilasciati in soluzione. Con i loro tag di affinità che legano immediatamente le perline chelanti nichel paramagnetiche. </li></ol> 5. Le perline vengono lavati <ol><li> Gli lisati cellulari contenenti le microsfere in sospensione magnetici sono trasferiti ad un 96-Deepwell Plate che è posizionato su un supporto con maste agnetica che scorrono tra i pozzetti. Le piastre a 96 pozzetti hanno ottenuto un quadrato forma conica del fondo, che facilita la rimozione del supernatante. I pozzetti possono contenere volumi fino a 2,1 ml, ma sono pieni di volumi molto piccoli. Questo ci permette di effettuare misure vigorose stringono senza campione di cross-contaminazione da spruzzi. </li><li> I puntali vengono lavati tra le singole fasi di pipettamento con 6 M guanidina-HCl. Questo passaggio è fondamentale per la purificazione di TFIIB e altri &quot;sticky&quot; proteine ​​per evitare la contaminazione incrociata. Con altre proteine ​​può essere sufficiente per risciacquare gli aghi estensivamente con acqua tra le fasi di pipettamento. </li><li> Le barre magnetiche del supporto magnetico attirare le perline paramagnetiche, strappandoli i centri della pozzetti e lasciare gli aghi pipettaggio libero accesso al supernatante. Il supernatante viene scartato. </li><li> 500 pl di tampone di lavaggio prima aggiunta al 24-pozzetti e successivamente trasferito alla piastra a 96 pozzetti a eNsure il completo trasferimento delle perle. Il 24-pozzetti viene rimosso dal shaker. </li><li> Altri 500 pl di tampone di lavaggio viene aggiunto direttamente alla piastra a 96 pozzetti, la piastra viene trasferito shaker e agitare vigorosamente per 1 min. La piastra viene riportato al supporto magnetico e il tampone di lavaggio scartato. </li><li> Questo passaggio viene ripetuto due volte e la procedura di lavaggio è finito rimuovendo eventuali residui tampone dalla piastra. </li></ol> 6. Eluire le proteine ​​in tampone di eluizione <ol><li> 100 pl di tampone di eluizione viene aggiunto ai talloni, la piastra viene spostato shaker e agitare vigorosamente per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> La piastra viene riportato l&#39;agitatore e l&#39;eluato, contenente la proteina ricombinante purificata, viene trasferito in una nuova piastra. </li></ol> 7. Misurare le concentrazioni di proteine ​​purificate <ol><li> 190 pl di miscela di reagente BCA viene trasferito ad una chiara piastra da 96 pozzetti e 10 pl della proproteina soluzione aggiunta. </li><li> Dopo diverse ore di incubazione (tipicamente 5-6 o durante la notte), misurare l&#39;assorbanza e confrontarlo con standard BSA per determinare le concentrazioni di ciascuna delle preparazioni proteina purificata (Figura 2). </li><li> Le proteine ​​purificate possono essere utilizzati per applicazioni a valle, alle concentrazioni appropriate (Figura 3). </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Il protocollo di purificazione offre due fasi di controllo di qualità, esempi delle quali sono mostrate. Siamo in grado di identificare e documentare potenziali problemi in fase di crescita batterica (Figura 1) e successivamente su di valutare il tenore di proteine ​​purificate (Figura 2). Noi di solito purificare proteine ​​e testarli in triplice copia. Questo, in combinazione con le due fasi di controllo di qualità, ci dà fiducia che qualsiasi variazione abbiamo osservato nei nostri saggi funzionali sono dovute al phenotyp mutantee (Figura 3) e non causata da variazioni sperimentali o purificazioni falliti. Le rese ottenute variano tipicamente 50-200 mcg e sono più che sufficienti per vari saggi funzionali. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" /> Figura 1. Istogramma delle misurazioni di OD di una piastra a 24 pozzetti con culture overnight. Tre cloni di sei varianti TFIIB mutanti nonché del TFIIB tipo selvatico sono state coltivate. Due cloni non trasportano un plasmide esprimente e un pozzo con mezzo servono solo come controlli negativi. Le misurazioni OD mostrano che ci sono piccole variazioni nei tassi di crescita tra le culture individuali. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" /> Figura 2. Rese proteici ottenuti da queste colture come determinato mediante un saggio BCA e confermata mediante SDS PAGE. Una delle varianti non è espressa a livelli elevati. In comcombinazione con la figura 1, possiamo concludere che ciò non è dovuto alla crescita delle cellule differenziale ma a causa di espressione della proteina non essere indotti in modo corretto. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" /> Figura 3. Risultato rappresentativo di un saggio di trascrizione. Abbiamo misurato l&#39;attività di stimolazione varianti TFIIB sulla produzione di piccoli trascritti da RNAP abortivi. Qui, gli effetti di stimolazione di una libreria piena di singole sostituzioni aminoacidiche di residui TFIIB K87 sono mostrati. L&#39;alto grado di riproducibilità è confermata dal piccolo errore. Un gel di esempio che mostra le prestazioni di tre mutanti rispetto al tipo selvatico (in peso), controlli negativi (NC) e tampone di eluizione controlla solo è raffigurato sotto.

<ol><li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li>
<li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+polymerase+factory%3A+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li>
<li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40(2008).</li>
<li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li>
<li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+Function+of+TFIIB%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li>
<li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li>
<li>Tyree, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+minimal+set+of+proteins+that+is+sufficient+for+accurate+initiation+of+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II.</a> Genes. 7, 1254-1265 (1993).</li>
<li>Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+nucleoside+triphosphates+and+role+of+the+entry+site+to+the+RNA+polymerase+II+active+center%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).</li>
<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li>
<li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li>
<li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo automatizzato purificazione della proteina ricombinante qui descritto consente la produzione e purificazione di un gran numero di proteine ​​mutanti in una piccola formato in condizioni altamente riproducibili con minimo intervento umano. Figure 1 e 2 mostrano i risultati di sistematiche qualità-controlli ed esempi del proteine ​​purificate. Figura 3 mostra che i fattori di trascrizione purificati utilizzati in questo esempio effettuare in un modo altamente riproducibile in saggi funzionali. Anche se la procedura è stata sviluppata per la purificazione di archaeal TFIIB, è ampiamente applicabile per la purificazione di proteine ​​affinità-etichetta. L&#39;uso di tali protocolli di purificazione automatizzati così notevolmente facilitare l&#39;analisi biochimica delle proteine ​​ricombinanti e, quindi, ulteriormente la nostra comprensione di interazioni proteina-proteina su una scala che è difficile da ottenere manualmente.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Overnight Express Media TB istantanea </td><td> VWR International srl </td><td> 71491-4 </td><td></td></tr><tr><td> Contropiede </td><td> Promega Ltd. </td><td> V8573 </td><td></td></tr><tr><td> Lysonase Reagente Bioprocessing / 1 ml </td><td> VWR International srl </td><td> 71230 </td><td></td></tr><tr><td> Antischiuma 204 </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> A6426 </td><td></td></tr><tr><td> MagneHis Ni-particelle </td><td> Promega </td><td> V8565 </td><td></td></tr><tr><td> Imidazolo </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> 56750 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma di base </td><td> Sigma-Aldrich Compqualsiasi Ltd. </td><td> 93362 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Bicinconinico Acid determinazione delle proteine </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> BCA1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> Deep Well Tavola 2.2 ml Piazza Wells PP PK10 </td><td> Anachem Ltd </td><td> 1810-1800 </td><td></td></tr><tr><td> Polistirene fondo Micropiastra MicroWell 96 pozzetti piatto non trattata 12 bussole su 5 piastre chiaro il volume di 0.4 ml e 128 millimetri x 86 mm Thermo Scientific Nunc </td><td> Fisher Scientific Ltd. </td><td> DIS-984-090M </td><td></td></tr><tr><td> Micropiastre Blu </td><td> VWR </td><td> NUNC367001 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Well Blocchi RB (24) </td><td> Qiagen </td><td> 19583 </td><td></td></tr><tr><td> Guanidina cloridrato </td><td> VWR </td><td> ALFAA13543.0B </td><td></td></tr><tr><td> Ago lavabile per TheOnyx </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-317001 </td><td></td></tr><tr><td> Rack Reagente per sfere magnetiche </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-035003 </td><td></td></tr><tr><td> Piatto Reader Synergy HT </td><td> BioTek </td><td> 4200-000043 </td><td></td></tr><tr><td> Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8145-050046 </td><td></td></tr><tr><td> Shaker per micropiastre Variomag Teleshaker </td><td> Inheco </td><td> 3800047 </td><td></td></tr><tr><td> 96 pozzetti Tipo di magnete A </td><td> Qiagen </td><td> 36915 </td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Cristallografia a raggi X è il metodo di scelta per ottenere una vista dettagliata della struttura delle proteine. Tali studi devono essere integrate da ulteriori analisi biochimiche di acquisire le conoscenze dettagliate in relazioni struttura / funzione. Advances in oligonucleotide-gene e tecnologia di sintesi rendono grandi strategie mutagenesi sempre possibili, compresa la sostituzione dei residui bersaglio da tutti e 19 altri amminoacidi. Guadagno o perdita di funzione fenotipi quindi consentire sistematici conclusioni da trarre, come il contributo di residui particolari per l&#39;attività catalitica, la stabilità della proteina e / o proteina-proteina specificità dell&#39;interazione. Al fine di assegnare diversi fenotipi alla natura della mutazione - anziché fluttuanti condizioni sperimentali - è vitale per purificare e analizzare le proteine ​​in modo controllato e riproducibile. High-throughput strategie e l&#39;automazione di protocolli manuali surobotici liquido di gestione piattaforme hanno creato opportunità di eseguire tali complesse procedure di biologia molecolare, con poco intervento umano ei tassi di errore minimo 1-5. Qui, presentiamo un metodo generale per la purificazione di His-tag proteine ​​ricombinanti in un modo ad alta produttività. In un recente studio, abbiamo applicato questo metodo per una dettagliata struttura-funzione di indagine TFIIB, un componente della macchina trascrizione basale. TFIIB è indispensabile per promotore-diretta trascrizione in vitro ed è essenziale per l&#39;assunzione di RNA polimerasi in un complesso preinitiation 6-8. TFIIB contiene un dominio linker flessibile che penetra il sito attivo fessura di RNA polimerasi 9-11. Questo dominio linker conferisce due attività biochimicamente quantificabili TFIIB, vale a dire (i) la stimolazione dell&#39;attività catalitica durante la fase di &#39;fallita&#39; di inizio trascrizione, e (ii) un ulteriore contributo allaassunzione specifica di RNA polimerasi nella preinitiation complesso 4,5,12. Abbiamo sfruttato l&#39;alta produttività metodo di purificazione per generare singola, doppia sostituzione e triple mutazioni e delezioni nel linker TFIIB e successivamente analizzarli in saggi funzionali per il loro effetto sulla stimolazione dell&#39;attività catalitica della polimerasi RNA 4. Complessivamente, abbiamo generato, purificati ed analizzati 381 mutanti - compito che sarebbe stato lungo e laborioso effettuare manualmente. Abbiamo prodotto e analizzato le proteine ​​in multiplicates che ci ha permesso di apprezzare le variazioni sperimentali e ci ha dato una chiara idea della riproducibilità dei nostri risultati. Questo metodo serve da protocollo generico per la purificazione di His-tag proteine ​​ed è stato usato con successo per purificare altre proteine ​​ricombinanti. Attualmente è ottimizzato per la purificazione di proteine ​​di 24, ma può essere adattato per purificare fino a 96 proteine.

Si descrive un metodo per la purificazione per affinità-tag di proteine ​​ricombinanti utilizzando liquido movimentazione robotica. Questo metodo è generalmente applicabile alla piccola scala purificazione di solubili His-tagged proteine ​​in una high-throughput formato.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

La cristallografia a raggi X è il metodo d'elezione per ottenere una visione dettagliata della struttura delle proteine. Tali studi devono essere completati da ulteriori...

Lo scopo di questa procedura è purificare proteine ricombinanti con tag his in modo ad alto rendimento, utilizzando un protocollo automatizzato su una piattaforma robotica. Questo viene ottenuto innanzitutto mediante la sovraespressione delle proteine in e coli, impiegando colture a piccolo volume. Successivamente, le cellule vengono lisate chimicamente per rilasciare le proteine, che quindi si legano a microsferette magnetiche di nichel.Successivamente, le perle vengono lavate per rimuovere le proteine contaminanti e migliorare la purezza delle proteine desiderate. Infine, le proteine vengono purificate dalle perle magnetiche. In ultima analisi, si possono ottenere risultati che mostrano la concentrazione e la purezza delle proteine mediante saggi BCA e SDS-PAGE, nonché ulteriori saggi funzionali per determinare l'attività delle proteine.Il vantaggio principale di questa tecnica è che ora possiamo purificare un elevato numero di proteine in condizioni identiche con un intervento minimo. Ciò ci permette di ottenere un elevato grado di riproducibilità e riduce al minimo gli errori umani. Questo metodo è particolarmente utile per lo studio di un gran numero di mutanti puntiformi di una specifica proteina, poiché assicura che la variabilità nell'attività della proteina sia effettivamente dovuta alla mutazione e non alle differenze nella preparazione dei campioni.Per preparare colture batteriche notturne, iniziare riempiendo delle piastre a 24 pozzetti con acqua e riscaldandole al microonde per due minuti per sterilizzarle. Eliminare l'acqua e riscaldare nuovamente le piastre al microonde per due minuti. Utilizzando colonie batteriche appena cresciute inducibili al lattosio, BL21 Rosetta due, o scorte congelate in glicerolo, inoculare 1,5 millilitri di mezzo di induzione automatica contenente una miscela di glucosio e lattosio. Preparare tre pozzetti per i controlli positivi e tre per i controlli negativi, e un pozzetto con solo mezzo come controllo.Coltivare le cellule a 250 RPM per 18 ore a 37 gradi Celsius. Rimuovere il coperchio e posizionare la piastra sulla piattaforma robotica. La piattaforma contiene un braccio afferratore per spostare oggetti da una posizione all'altra, un braccio per la pipettaggio e diverse posizioni per piastre e serbatoi, inclusa una piattaforma agitatrice, un agitatore per perline magnetiche e una piattaforma magnetica.Per piastre a 96 pozzetti, preparare i tamponi di lavaggio e diluizione per la procedura di purificazione seguendo il protocollo scritto, utilizzando 100 millilitri di acqua distillata e 15 microlitri di un agente antischiuma. Preparare una soluzione per diluire colture notturne per le misurazioni della densità ottica. Preparare una soluzione di lisi contenente reagente fast break, lisasi e acetato di magnesio, e preparare la soluzione per il saggio proteico BCA.Poiché la TF due B tende ad aderire agli aghi della pipetta, preparare una soluzione di cloridrato di guanina sei molare per lavarli. Riempire canali o piastre della dimensione corretta con i tamponi appropriati e posizionarli nelle rispettive posizioni predefinite sulla piattaforma robotica, nei loro posti sulla piattaforma. Posizionare una piastra a 24 pozzetti per lo smaltimento del cloridrato di guanina, due piastre trasparenti a 96 pozzetti per le misurazioni dell'OD 600 e dell'assorbanza, e una piastra a 96 pozzetti di colore blu per le proteine purificate.Posizionare una piastra a 96 pozzetti profondi sul supporto magnetico. Utilizzare acqua per diluire le particelle di nickel magna hair e aggiungerle all'unità di partenza dei bead. Accendere l'agitatore per mantenere i bead in sospensione.Accendere la piattaforma robotica e lavare le punte di pipettaggio per diversi minuti. Per rimuovere le bolle d'aria, posizionare la piastra su una piattaforma oscillante per verificare la crescita delle colture cellulari overnight. Diluire 10 microlitri di coltura in 90 microlitri di soluzione diluente, lavando le pipette tra un'aggiunta e l'altra.Quindi misurare la densità a OD 600 quando le colture hanno raggiunto densità simili. Trasferire 100 microlitri di sospensione di perle magnetiche al nichel nelle pozzette di una piastra a 24 pozzette e trasferire 900 microlitri di ciascuna coltura nelle pozzette, lavando le pipette tra un passaggio e l'altro. Quindi aggiungere 100 microlitri di miscela di Fast Break Lyase.Posizionare la piastra sulla piattaforma agitatrice a 800 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente per consentire la lisi delle cellule e il legame delle proteine marcate con his ai microsferini per lavare i microsferini. Trasferirli in una piastra a 96 pozzetti posizionata su un supporto con aste magnetiche che allontanano i microsferini dai centri dei pozzetti, scartare il sopranatante e utilizzare sei mo iGuide cloridrato per lavare le punte della pipetta. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di buffer di lavaggio ai pozzetti del 24.Piastra a pozzetti e trasferire i campioni nella piastra a 96 pozzetti. Quindi rimuovere il sopernatante. Aggiungere 500 microlitri di buffer di lavaggio alla piastra a 96 pozzetti.Piastra a pozzetti. Trasferire la piastra sullo shaker e agitare vigorosamente per un minuto. Successivamente, riposizionare la piastra sul supporto magnetico ed eliminare il buffer di lavaggio.Dopo il lavaggio finale, aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione alle perle e agitare vigorosamente per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire l'eluato in una nuova piastra. Per quantificare i campioni proteici, aggiungere 190 microlitri di reagente BCA nei pozzetti di una piastra trasparente a 96 pozzetti e aggiungere 10 microlitri dei campioni proteici nei pozzetti.Incubare i campioni per almeno cinque ore e misurare l'assorbanza utilizzando una serie di standard di BSA. Le proteine vengono quindi conservate a meno 80 gradi Celsius. Il protocollo di purificazione prevede due fasi di controllo qualità.Prima durante la fase di crescita batterica e successivamente durante la valutazione dei rendimenti proteici. Purificando le proteine in triplicato, è possibile determinare che eventuali variazioni nei saggi funzionali sono dovute ai fenotipi mutanti e non a variazioni sperimentali o a purificazioni fallite. I rendimenti tipici variano da 50 a 200 microgrammi e sono più che sufficienti per i saggi funzionali. Una volta appresa la tecnica, richiede solo circa tre ore e, a parte l'allestimento della strumentazione, l'inoculo delle colture e la raccolta delle proteine purificate, non è necessario eseguire ulteriori operazioni.Al termine di questa procedura, è possibile eseguire saggi funzionali. Nel nostro caso, si tratterebbe di una serie di saggi di trascrizione al fine di studiare come la mutazione del fattore di trascrizione due B modifichi il suo effetto sull'attività catalitica della RNA polimerasi.

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Un romanzo e altamente efficiente in due fasi cromatografia di affinità protocollo è stato sviluppato ed è descritto in dettaglio. Il metodo si basa su un tag purificazione con due affinità intrinseca ed è applicabile ad una vasta gamma di proteine ​​bersaglio con proprietà diverse.

Purificazione delle proteine ​​ortogonali Facilitato da una piastrina Affinity Bispecific

Fonte: Becker, B., et al. Un semplice saggio reporter basato sulla fluorescenza per identificare i componenti cellulari necessari al traffico della catena della tossina A (RTA) nel lievito. J. Vis. Esp. (2017).Questo video dimostra la purificazione di una proteina ricombinante contrassegnata con poliistidina utilizzando cromatografia di affinità a base di nichel. Descrive i passaggi chiave, tra cui la lisi batterica tramite sonicazione, la chiarificazione e filtrazione del lisato, e il legame...

 Una tecnica di cromatografia di affinità per la purificazione di una proteina batterica ricombinante

In questo video, dimostriamo la tecnica di cromatografia di affinità al nichel per purificare gli enzimi pirofosfochinasi marcati con istidina dai batteri Clostridium difficile.

Purificazione delle proteine basata sulla cromatografia di affinità al nichel: una tecnica per purificare le proteine ricombinanti marcate con poliistidina dal lisato cellulare batterico

Questo video dimostra la purificazione di affinità tandem, una tecnica per purificare complessi proteici da cellule eucariotiche per studiare l'interazione proteina-proteina. Il complesso contiene due proteine marcate con diversi tag epitopici. Dopo la purificazione del complesso utilizzando due resine con un'affinità per i due diversi tag in modo sequenziale, la presenza di entrambe le proteine nell'eluito conferma l'interazione tra le due.

Saggio di purificazione di affinità tandem per studiare le interazioni proteina-proteina

Complessi proteici catalizzano le funzioni cellulari fondamentali. Caratterizzazione funzionale e strutturale dettagliata di molti complessi essenziali richiede la produzione ricombinante. MultiBac è un sistema di celle di baculovirus / insetto particolarmente adattato per esprimere proteine ​​eucariotiche e dei loro complessi. MultiBac è stato implementato come una piattaforma open-access, e le procedure operative standard sviluppati per massimizzare la sua utilità.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Nel presente protocollo, si dimostra un metodo altamente efficiente e conveniente purificazione di proteine ​​su piccola scala, che permette la purificazione di proteine ​​ricombinanti, combinando in modo univoco un scindibile GST-tag e un piccolo His-tag.

GST-la sua purificazione: A Two-step Affinity Purification protocollo Cedendo Full-length proteine ​​purificate

Un protocollo per l'espressione elevato throughput screening e quantitativa analitica purificazione di proteine ​​di fusione di piccoli culture Escherichia coli è descritto ed applicato alla espressione di proteine ​​bersaglio veleno animale ricchi di disolfuro.

High Throughput Screening espressione quantitativa e purificazione Applicata al ricombinante Disulfide ricchi di Venom proteine ​​prodotte in<em&gt; E. coli</em

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Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain

Un adattatore a piastre multi-colonna consente di interfacciare le colonne cromatografiche con piastre di raccolta multi-pozzo per l'affinità parallela o la purificazione dello scambio ionico fornendo un metodo economico di purificazione delle proteine ad alta produttività. Può essere utilizzato sotto gravità o sottovuoto producendo quantità di milligrammo di proteine tramite strumentazione conveniente.

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Gli studi strutturali e biochimici dei trasportatori di membrana umani richiedono quantità di milligrammi di proteine stabili, intatte e omogenee. Qui descriviamo metodi scalabili per lo screening, l'espressione e la purificazione di trasportatori di soluti umani utilizzando geni ottimizzati per i codoni.

Espressione e purificazione ad alto rendimento di vettori di soluti umani per studi strutturali e biochimici

Questo articolo fornisce una procedura per la purificazione per affinità di una proteina ricombinante umana, l'endonucleasi del lembo 1 (FEN1), che è stata marcata con un tag 6X-istidina. Il protocollo prevede l'utilizzo di due distinte colonne ioniche metalliche immobilizzate per la purificazione della proteina marcata.

Purificazione per affinità di una proteina marcata 6X-His-Tagged utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce 

Impara la purificazione ad alta portata di proteine ricombinanti con tag di affinità utilizzando robotica per la manipolazione di liquidi. Questo metodo automatizzato garantisce riproducibilità e riduce gli errori umani nelle analisi biochimiche.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

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