High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

Lo scopo di questa procedura è purificare proteine ricombinanti con tag his in modo ad alto rendimento, utilizzando un protocollo automatizzato su una piattaforma robotica. Questo viene ottenuto innanzitutto mediante la sovraespressione delle proteine in e coli, impiegando colture a piccolo volume. Successivamente, le cellule vengono lisate chimicamente per rilasciare le proteine, che quindi si legano a microsferette magnetiche di nichel.

Successivamente, le perle vengono lavate per rimuovere le proteine contaminanti e migliorare la purezza delle proteine desiderate. Infine, le proteine vengono purificate dalle perle magnetiche. In ultima analisi, si possono ottenere risultati che mostrano la concentrazione e la purezza delle proteine mediante saggi BCA e SDS-PAGE, nonché ulteriori saggi funzionali per determinare l'attività delle proteine.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che ora possiamo purificare un elevato numero di proteine in condizioni identiche con un intervento minimo. Ciò ci permette di ottenere un elevato grado di riproducibilità e riduce al minimo gli errori umani. Questo metodo è particolarmente utile per lo studio di un gran numero di mutanti puntiformi di una specifica proteina, poiché assicura che la variabilità nell'attività della proteina sia effettivamente dovuta alla mutazione e non alle differenze nella preparazione dei campioni.

Per preparare colture batteriche notturne, iniziare riempiendo delle piastre a 24 pozzetti con acqua e riscaldandole al microonde per due minuti per sterilizzarle. Eliminare l'acqua e riscaldare nuovamente le piastre al microonde per due minuti. Utilizzando colonie batteriche appena cresciute inducibili al lattosio, BL21 Rosetta due, o scorte congelate in glicerolo, inoculare 1,5 millilitri di mezzo di induzione automatica contenente una miscela di glucosio e lattosio. Preparare tre pozzetti per i controlli positivi e tre per i controlli negativi, e un pozzetto con solo mezzo come controllo.

Coltivare le cellule a 250 RPM per 18 ore a 37 gradi Celsius. Rimuovere il coperchio e posizionare la piastra sulla piattaforma robotica. La piattaforma contiene un braccio afferratore per spostare oggetti da una posizione all'altra, un braccio per la pipettaggio e diverse posizioni per piastre e serbatoi, inclusa una piattaforma agitatrice, un agitatore per perline magnetiche e una piattaforma magnetica.

Per piastre a 96 pozzetti, preparare i tamponi di lavaggio e diluizione per la procedura di purificazione seguendo il protocollo scritto, utilizzando 100 millilitri di acqua distillata e 15 microlitri di un agente antischiuma. Preparare una soluzione per diluire colture notturne per le misurazioni della densità ottica. Preparare una soluzione di lisi contenente reagente fast break, lisasi e acetato di magnesio, e preparare la soluzione per il saggio proteico BCA.

Poiché la TF due B tende ad aderire agli aghi della pipetta, preparare una soluzione di cloridrato di guanina sei molare per lavarli. Riempire canali o piastre della dimensione corretta con i tamponi appropriati e posizionarli nelle rispettive posizioni predefinite sulla piattaforma robotica, nei loro posti sulla piattaforma. Posizionare una piastra a 24 pozzetti per lo smaltimento del cloridrato di guanina, due piastre trasparenti a 96 pozzetti per le misurazioni dell'OD 600 e dell'assorbanza, e una piastra a 96 pozzetti di colore blu per le proteine purificate.

Posizionare una piastra a 96 pozzetti profondi sul supporto magnetico. Utilizzare acqua per diluire le particelle di nickel magna hair e aggiungerle all'unità di partenza dei bead. Accendere l'agitatore per mantenere i bead in sospensione.

Accendere la piattaforma robotica e lavare le punte di pipettaggio per diversi minuti. Per rimuovere le bolle d'aria, posizionare la piastra su una piattaforma oscillante per verificare la crescita delle colture cellulari overnight. Diluire 10 microlitri di coltura in 90 microlitri di soluzione diluente, lavando le pipette tra un'aggiunta e l'altra.

Quindi misurare la densità a OD 600 quando le colture hanno raggiunto densità simili. Trasferire 100 microlitri di sospensione di perle magnetiche al nichel nelle pozzette di una piastra a 24 pozzette e trasferire 900 microlitri di ciascuna coltura nelle pozzette, lavando le pipette tra un passaggio e l'altro. Quindi aggiungere 100 microlitri di miscela di Fast Break Lyase.

Posizionare la piastra sulla piattaforma agitatrice a 800 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente per consentire la lisi delle cellule e il legame delle proteine marcate con his ai microsferini per lavare i microsferini. Trasferirli in una piastra a 96 pozzetti posizionata su un supporto con aste magnetiche che allontanano i microsferini dai centri dei pozzetti, scartare il sopranatante e utilizzare sei mo iGuide cloridrato per lavare le punte della pipetta. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di buffer di lavaggio ai pozzetti del 24.

Piastra a pozzetti e trasferire i campioni nella piastra a 96 pozzetti. Quindi rimuovere il sopernatante. Aggiungere 500 microlitri di buffer di lavaggio alla piastra a 96 pozzetti.

Piastra a pozzetti. Trasferire la piastra sullo shaker e agitare vigorosamente per un minuto. Successivamente, riposizionare la piastra sul supporto magnetico ed eliminare il buffer di lavaggio.

Dopo il lavaggio finale, aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione alle perle e agitare vigorosamente per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire l'eluato in una nuova piastra. Per quantificare i campioni proteici, aggiungere 190 microlitri di reagente BCA nei pozzetti di una piastra trasparente a 96 pozzetti e aggiungere 10 microlitri dei campioni proteici nei pozzetti.

Incubare i campioni per almeno cinque ore e misurare l'assorbanza utilizzando una serie di standard di BSA. Le proteine vengono quindi conservate a meno 80 gradi Celsius. Il protocollo di purificazione prevede due fasi di controllo qualità.

Prima durante la fase di crescita batterica e successivamente durante la valutazione dei rendimenti proteici. Purificando le proteine in triplicato, è possibile determinare che eventuali variazioni nei saggi funzionali sono dovute ai fenotipi mutanti e non a variazioni sperimentali o a purificazioni fallite. I rendimenti tipici variano da 50 a 200 microgrammi e sono più che sufficienti per i saggi funzionali. Una volta appresa la tecnica, richiede solo circa tre ore e, a parte l'allestimento della strumentazione, l'inoculo delle colture e la raccolta delle proteine purificate, non è necessario eseguire ulteriori operazioni.

Al termine di questa procedura, è possibile eseguire saggi funzionali. Nel nostro caso, si tratterebbe di una serie di saggi di trascrizione al fine di studiare come la mutazione del fattore di trascrizione due B modifichi il suo effetto sull'attività catalitica della RNA polimerasi.