Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

Lo scopo di questo video è descrivere una procedura per caratterizzare la transizione della permeabilità mitocondriale. Apertura insufficiente nei mitocondri, isolati dal cuore di topo. In primo luogo, i mitocondri vengono isolati dai cuori di topo.

Utilizzando il metodo di centrifugazione differenziale, la qualità delle mitocondrie isolate viene quindi valutata mediante un elettrodo di ossigeno termoisolato collegato a un computer per misurare il rapporto di controllo respiratorio e valutare l'integrità della membrana mitocondriale. Successivamente, mediante strumentazione spettrofluorometrica, la misurazione simultanea del controllo del calcio, del potenziale della membrana mitocondriale e del volume mitocondriale viene utilizzata per determinare la transizione di permeabilità. Apertura insufficiente.

I dati ottenuti hanno mostrato differenze nella capacità di ritenzione del calcio e nella permeabilità mitocondriale alla transizione. Scarsa sensibilità dei mitocondri isolati, apertura della transizione della permeabilità mitocondriale. Il poro è un fenomeno complesso che coinvolge cambiamenti a più livelli nella fisiologia e nell'anatomia mitocondriale.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti consiste nel fatto che la misurazione simultanea di più parametri offre un quadro più completo del fenomeno rispetto alla misurazione di singoli parametri isolati, come il calcio, la mobilizzazione o il rigonfiamento. Prima di iniziare la procedura, scongelare il buffer per l'isolamento dei mitocondri e verificare il pH, che deve essere 7,4. Successivamente, porre tutti i buffer, le piastre e le provette che verranno utilizzati sul ghiaccio. Si noti che tutti i passaggi del protocollo di isolamento dei mitocondri devono essere eseguiti sul ghiaccio.

Posizionare i cuori di topi sacrificati su una piastra di Petri e rimuovere qualsiasi traccia di sangue con tampone freddo per l'isolamento delle mitocondri. Successivamente, trasferire i cuori su una nuova piastra di Petri utilizzando una lametta, rimuovere il tessuto adiposo e le atria, quindi tritare i cuori fino a ottenere un prodotto omogeneo.

Trasferire i cuori tritati in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di buffer per l'isolamento delle mitocondri contenente tripsina 0,1 milligrammo per millilitro e lasciare digerire il campione sul ghiaccio per 10 minuti. Si noti che l'uso della tripsina aumenta il rendimento delle mitocondri isolate e deve essere mantenuto costante tra le diverse preparazioni mitocondriali.

Tuttavia, si raccomanda di verificare la funzionalità dei mitocondri isolati su preparazioni ottenute in assenza di tripsina per assicurarsi che l'enzima non interferisca con i loro ioni. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 millilitri di buffer per l'isolamento dei mitocondri contenente 0,1% di BS privo di acidi grassi e 5 milligrammi di inibitore della tripsina e mescolare capovolgendo il tubo diverse volte per neutralizzare la tripsina. Recuperare il tessuto digerito mediante centrifugazione a bassa o media velocità per un minuto a 4 gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, sospendere il tessuto in otto millilitri di tampone di isolamento delle mitocondri con BSA priva di acidi grassi allo 0,1%, mantenendo il campione sul ghiaccio. Utilizzare un omogeneizzatore motorizzato con pestello in teflon per omogeneizzare il campione con quattro a sei passaggi a 1.200-1.400 giri al minuto. Trasferire l'omogenato in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 800 × g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Per pelletizzare i nuclei e i detriti cellulari. Dopo la centrifugazione, recuperare il sopranatante contenente i mitocondri in provette da microcentrifuga e centrifugarli a 8.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, il pellet presenterà uno strato bianco sulla sua superficie.

Utilizzare un sistema a vuoto per aspirare e rimuovere con attenzione lo strato bianco presente sulla superficie del pellet mitocondriale. Quindi, risospendere nuovamente il pellet residuo più scuro, che contiene i mitocondri, in un millilitro di buffer per l'isolamento dei mitocondri.

Successivamente, centrifugare i mitocondri a 8.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il sopranatante e risospendere il pellet mitocondriale in 150 microlitri di buffer di isolamento dei mitocondri, mantenendo i mitocondri sul ghiaccio.

La respirazione dei mitocondri isolati viene misurata con un elettrodo termico per l'ossigeno collegato a un computer e controllato da oxy. Il software Plus, l'elettrodo per l'ossigeno deve essere calibrato il giorno dell'esperimento. Aggiungere due millilitri di tampone per la respirazione mitocondriale contenente una concentrazione finale di un micromolare di rotenone nella camera di ossi, sigillare la camera e iniziare la registrazione del segnale di ossigeno.

Il segnale registrato dal sistema e visualizzato sullo schermo del computer è proporzionale alla concentrazione di ossigeno nella camera dell'ossitermo. Una volta che il segnale dell'ossigeno è stabile, aggiungere 250 microgrammi di mitocondri e registrare la respirazione basale per un minuto. A questo punto, la respirazione dovrebbe essere molto bassa poiché i mitocondri stanno utilizzando substrati endogeni.

Questa è la respirazione nello stato uno. Aggiungere succinato a una concentrazione finale di cinque millimolari per avviare la respirazione mitocondriale al complesso due e registrare il segnale per un minuto. Il consumo di ossigeno dovrebbe aumentare durante la respirazione nello stato due.

Per indurre la respirazione in stato 3, aggiungere un DP a una concentrazione finale di 150 micromolare. A questo punto, il consumo di ossigeno dovrebbe aumentare a causa della sintesi di TP mediante fosforilazione ossidativa. Registrare il segnale fino a quando la respirazione rallenta, indicando il consumo di DP e la transizione alla registrazione della respirazione in stato 4.

Stato quattro, respirazione per almeno un minuto. Aggiungere CCCP a una concentrazione finale di un micromolare e registrare il segnale per un minuto. A questo punto, la respirazione disaccoppiata dovrebbe essere massima.

Calcolare il rapporto di controllo respiratorio dividendo la velocità di consumo di ossigeno durante la fase tre della respirazione per la velocità di consumo di ossigeno durante la fase quattro della respirazione; un valore di RCR target deve essere superiore a quattro. Successivamente, per valutare l'integrità della membrana mitocondriale, indurre la respirazione in fase tre in un nuovo campione di mitocondri aggiungendo ADP a una concentrazione finale di un millimolare.

Quindi registrare il consumo di ossigeno per un minuto, aggiungere citocromo C a 10 micromolare e registrare il consumo di ossigeno per due o tre minuti. Poiché il citocromo C è impermeabile alle membrane mitocondriali integre in una preparazione mitocondriale di buona qualità, non si avrà alcun aumento oppure un aumento molto modesto della respirazione. Un aumento della respirazione indica membrane mitocondriali rotte o danneggiate.

Lo strumento per la misurazione multiparametrica dell'apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale è costituito da un fluorimetro spettrofotometrico Quantum Master Dual Emission, controllato tramite computer dal programma Felix GX. Utilizzando il programma Felix GX, creare un protocollo di acquisizione multidi e inserire i parametri per la misurazione del calcio, del potenziale di membrana mitocondriale e del rigonfiamento, relativi ai coloranti rapportometrici Fura-2 e JC-1; generare così i tracciati derivati per il rapporto Fura-2 e il rapporto JC-1. In un vasetto di reazione monouso in metilacrilato trasparente a quattro facce, aggiungere un millilitro di buffer per saggio mitocondriale contenente una concentrazione finale di un micromolare di rotenone, cinque millimolari di succinato e 800 nanomolari di Fura-2. Aggiungere quindi 250 microgrammi di mitocondri e posizionare il campione nel compartimento del fluorimetro spettrofotometrico.

Iniziare a registrare i segnali fluorescenti dopo un minuto, interrompere l'acquisizione, aggiungere 500 nanomolari di JC one quindi riprendere l'acquisizione. Il segnale del rapporto JC one dovrebbe aumentare, indicando il suo uptake da parte dei mitocondri attivi. Continuare la registrazione fino a quando il segnale di JC one non ha raggiunto un plateau.

Di solito entro cinque minuti, aggiungere cloruro di calcio fino a una concentrazione finale di 20 micromolari. Si dovrebbe osservare un aumento istantaneo del segnale del rapporto Fluor FF, che rappresenta un incremento della presenza di calcio nel buffer del saggio, seguito da una diminuzione graduale dovuta all'assorbimento mitocondriale del calcio. Il segnale del rapporto JC-1 dovrebbe mostrare una breve diminuzione transitoria indicativa di una leggera depolarizzazione della membrana mitocondriale.

Quando il segnale del rapporto ER FF ritorna al livello basale, di solito entro uno a 1,5 minuti con un ulteriore 20 micromolare di cloruro di calcio, continuare le stimolazioni a intervalli fissi finché i mitocondri non riescono più ad accumulare calcio e iniziano a rilasciarlo nel buffer saggio. L'apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale è visualizzata da un contemporaneo aumento del segnale del rapporto URA FF dovuto al rilascio di calcio. Una diminuzione del rapporto del segnale JC uno causata dal collasso del potenziale di membrana e una riduzione della dispersione della luce dovuta al rigonfiamento mitocondriale, mentre isolati da topi C 56 black six J.

Come mostrato in questo video, il consumo di ossigeno è stato quindi misurato durante la respirazione nello stato tre in presenza di succinato e ADP e durante la respirazione nello stato quattro dopo il consumo di ADP. Come mostrato qui, l'aggiunta di ADP aumenta il consumo di ossigeno a causa della fosforilazione ossidativa e il consumo di ossigeno rallenta. Una volta che tutto l'ADP è stato consumato, la risposta dei mitocondri isolati allo sblocco è misurata mediante l'aggiunta di CCCP in presenza di CCCP. La velocità di consumo di ossigeno è maggiore rispetto a quella osservata durante la respirazione nello stato tre, al fine di valutare l'integrità della membrana dei mitocondri isolati.

Il consumo di ossigeno è stato misurato in presenza di succinato e un DP e dopo l'aggiunta di citocromo C. Come si può osservare, l'aggiunta di citocromo C non aumenta significativamente il consumo di ossigeno rispetto al DP e al succinato, indicando che le membrane mitocondriali integre non sono permeabili al citocromo C. Per valutare la transizione della permeabilità mitocondriale, l'apertura del poro mitocondriale è stata analizzata in mitocondri isolati da cuore come indicatore della capacità di ritenzione del calcio mitocondriale. La transizione della permeabilità mitocondriale. L'apertura del poro è stata indotta da aggiunte sequenziali di 20 micromolar.

Il cloruro di calcio, il calcio extramitocondriale e il potenziale di membrana sono stati misurati mediante indicatori raziometrici. URA FF mostrato come traccia verde e JC uno mostrato come traccia rossa; il rigonfiamento delle mitocondrie è stato misurato registrando la dispersione della luce a 525 nanometri, indicata dalla traccia nera. La specificità dei segnali di JC uno e del rigonfiamento è stata verificata con un micromolare di CCCP e cinque microgrammi per millilitro della tossina microbica etina. Come si può osservare qui, l'assorbimento di calcio da parte delle mitocondrie è accompagnato da un leggero depolarizzazione della membrana mitocondriale.

Dopo quattro impulsi di calcio, l'apertura della pora di transizione della permeabilità mitocondriale è osservata come un aumento del FF di URA, indicativo del rilascio di calcio. Una diminuzione del JC-1 indica il collasso del potenziale di membrana e un aumento del volume della matrice mitocondriale, che si manifesta come una riduzione della diffusione della luce, utilizzata come marcatore del gonfiamento per verificare la specificità dell'apertura della pora di transizione della permeabilità mitocondriale. Le stesse misurazioni sono state effettuate in presenza di ciclosporina A, che si lega al componente ciclofillina D della pora di transizione della permeabilità mitocondriale. Come mostrato in questa figura, la presenza di un micromolare di ciclosporina A aumenta il numero di impulsi di cloruro di calcio necessari per aprire la pora di transizione della permeabilità mitocondriale rispetto al campione di controllo.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come valutare l'apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale in mitocondri cardiaci isolati. L'aspetto più complesso di questa procedura consiste nell'ottenere mitocondri isolati di buona qualità. È quindi fondamentale eseguire misurazioni di controllo della qualità prima di utilizzare i mitocondri in ulteriori esperimenti.