Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

Lo scopo di questo video è quello di descrivere una procedura per caratterizzare la transizione di permeabilità mitocondriale. Scarsa apertura nei mitocondri, isolata dal cuore del topo. In primo luogo, i mitocondri sono isolati dai cuori dei topi.

Utilizzando il metodo della centrifugazione differenziale, la qualità dei mitocondri isolati viene quindi valutata utilizzando un elettrodo ossitermico di ossigeno collegato a un computer per misurare il rapporto di controllo respiratorio e per valutare l'integrità della membrana mitocondriale. Quindi, utilizzando la strumentazione spettrofluorimetrica, la misurazione simultanea della manipolazione del calcio, del potenziale di membrana mitocondriale e del volume mitocondriale viene utilizzata per determinare la transizione di permeabilità. Scarsa apertura.

I dati risultanti hanno mostrato differenze nella capacità di ritenzione del calcio e nella transizione della permeabilità mitocondriale. Scarsa sensibilità dei mitocondri isolati, Apertura della transizione di permeabilità mitocondriale. Il poro è un fenomeno complesso che comporta cambiamenti a diversi livelli nella fisiologia e nell'anatomia mitocondriale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che la misurazione di più parametri contemporaneamente offre un quadro più completo del fenomeno rispetto alla misurazione dei singoli parametri da soli, come il calcio, la mobilizzazione o il gonfiore Prima di iniziare la procedura, scongelare il tampone di isolamento mitocondriale e controllare il pH, che dovrebbe essere 7,4. Quindi posizionare tutti i tamponi, i piatti e i tubi che verranno utilizzati sul ghiaccio. Si noti che tutti i passaggi del protocollo di isolamento dei mitocondri devono essere eseguiti su ghiaccio.

Metti i cuori dei topi soppressi su una capsula di Petri e risciacqua il sangue con mitocondri freddi. Buffer di isolamento. Successivamente, trasferire i cuori in una nuova capsula di Petri utilizzando una lama, eliminare il grasso e gli atri, quindi tritare i cuori fino ad ottenere un prodotto omogeneo.

Trasferire i cuori tritati in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di tampone di isolamento dei mitocondri con 0,1 milligrammi per millilitro di tripsina e lasciare che il campione venga digerito su ghiaccio per 10 minuti. Si noti che l'uso della tripsina aumenta la resa dei mitocondri isolati e deve essere mantenuto costante tra la preparazione mitocondriale.

Tuttavia, si consiglia di testare la funzionalità dei mitocondri isolati su preparati ottenuti in assenza di tripsina per garantire che l'enzima non interferisca con i loro ioni. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 millilitri di tampone di isolamento dei mitocondri contenente lo 0,1% di inibitore della tripsina privo di acidi grassi, BS, a e cinque milligrammi e mescolare capovolgendo più volte il tubo Per neutralizzare la tripsina, recuperare il tessuto digerito a velocità medio-bassa. Centrifugazione per un minuto di quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifuga Resus, sospendere il tessuto in otto millilitri di tampone di isolamento dei mitocondri con BSA privo di acidi grassi allo 0,1%, mantenendo il campione in ghiaccio. Utilizzare un omogeneizzatore di danza motorizzato con un pestello in teflon per omogeneizzare il campione con quattro o sei passaggi a 1, 200 - 1, 400 giri/min. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare a 800 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Per pellettare i nuclei e i detriti di tessuto. Dopo la centrifuga, recuperare il supinato contenente i mitocondri in provette da microcentrifuga e centrifugarle a 8.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo il giro, il pellet avrà uno strato bianco sopra di esso.

Utilizzare un sistema a vuoto per aspirare con cura e rimuovere lo strato bianco sopra il pellet mitocondriale. Quindi risospendere il pellet più scuro rimanente, che contiene i mitocondri in un millilitro di mitocondri. Buffer di isolamento.

Quindi centrifugare i mitocondri a 8.000 volte G per 10 minuti di quattro gradi Celsius. Scartare il supinato e risospendere il pellet mitocondriale. In 150 microlitri di mitocondri, tampone di isolamento, mantenere i mitocondri sul ghiaccio.

La respirazione dei mitocondri isolati viene misurata con un elettrodo ossitermico di ossigeno collegato a un computer e controllato da ossi. Il software plus, l'elettrodo di ossigeno, deve essere calibrato il giorno dell'esperimento. Aggiungere due millilitri di tampone respiratorio mitocondriale contenente una concentrazione finale di un rotenone micromolare alla camera ossigena, sigillare la camera e iniziare a registrare il segnale dell'ossigeno.

Il segnale registrato dal sistema e visualizzato sullo schermo del computer è proporzionale alla concentrazione di ossigeno nella camera ossitermica. Una volta che il segnale dell'ossigeno è stabile, aggiungere 250 microgrammi di mitocondri e registrare la respirazione basale per un minuto. La respirazione a questo punto dovrebbe essere molto bassa poiché i mitocondri aspirano su substrati endogeni.

Questo è lo stato di uno respiro. Aggiungere il succinato a una concentrazione finale di cinque millimolari per avviare la respirazione mitocondriale al complesso due e registrare il segnale per un minuto. Il consumo di ossigeno dovrebbe aumentare durante la respirazione di secondo stato.

Per indurre la respirazione di stato, aggiungere un DP a una concentrazione finale di 150 micromolari. A questo punto, il consumo di ossigeno dovrebbe aumentare a causa di una sintesi di TP attraverso la fosforilazione ossidativa. Registrare il segnale fino a quando la respirazione non rallenta indicando un consumo di DP e passare al record di respirazione dello stato quattro.

Stato quattro, respirazione per almeno un minuto. Aggiungere CCCP a una concentrazione finale di un micromolare e registrare il segnale per un minuto. A questo punto, la respirazione disaccoppiata dovrebbe essere massima.

Calcola il rapporto di controllo respiratorio dividendo il tasso di consumo di ossigeno durante lo stato tre. Respirazione in base al tasso di consumo di ossigeno durante lo stato quattro, la respirazione di un RCR target dovrebbe essere maggiore di quattro. Successivamente, per valutare l'integrità della membrana mitocondriale, indurre la respirazione dello stato tre in un nuovo campione di mitocondri aggiungendo un DP a una concentrazione finale di un millimolare.

Quindi registrare il consumo di ossigeno per un minuto, aggiungere 10 micromolari di citocromo C e registrare il consumo di ossigeno per due o tre minuti. Poiché il citocromo C è impermeabile alle membrane mitocondriali intatte in una buona preparazione mitocondriale, non ci sarà alcun aumento o un aumento molto piccolo della respirazione. Un aumento della respirazione indica la rottura o il danneggiamento delle membrane mitocondriali.

La strumentazione per la misura multiparametrica dell'apertura della porta di transizione della permeabilità mitocondriale è costituita da un computer fluorimetro a doppia emissione a doppia emissione quantum master controllato dal programma Felix GX. Utilizzando il programma Felix GX, creare un protocollo di acquisizione multidi e inserire i parametri per la misurazione del potenziale di membrana mitocondriale del calcio e del rigonfiamento per il rapporto coloranti metrici, Forer e JC one generano le tracce derivate per un rapporto e JC un rapporto in una miscela monouso di metanfetamina a quattro lati ACRL vete un tampone per il saggio dei mitocondri da un millilitro con una concentrazione finale di un rotenone micromolare, cinque millimolari di succinato e 800 nanomolari. Per una FF, aggiungere 250 microgrammi di mitocondri e posizionare il campione nello scomparto del campione dello spettrofluorimetro.

Iniziare a registrare i segnali fluorescenti dopo un minuto, mettere in pausa l'acquisizione, aggiungere 500 nanomolari JC one e quindi riavviare l'acquisizione. Il segnale del rapporto JC one dovrebbe aumentare, indicando l'assorbimento del die da parte dei mitocondri attivi. Continuare la registrazione fino a quando il segnale JC uno non ha raggiunto un plateau.

Di solito entro cinque minuti, aggiungere cloruro di calcio a una concentrazione finale di 20 micromolari. Si dovrebbe osservare un aumento istantaneo del segnale del rapporto Fluor FF, che rappresenta un aumento della presenza di calcio nel tampone del saggio, seguito da una graduale diminuzione dovuta all'assorbimento mitocondriale del calcio. Il segnale JC one ratio dovrebbe mostrare una breve diminuzione transitoria indicativa di una leggera depolarizzazione della membrana mitocondriale.

Quando il segnale del rapporto ER FF ritorna al livello basale, di solito entro uno o 1,5 minuti ad altri 20 micromolari di cloruro di calcio, continuare a pulsare a intervalli fissi fino a quando i mitocondri non riescono ad accumulare calcio e iniziare a rilasciare calcio nel tampone del saggio. L'apertura della porta di transizione della permeabilità mitocondriale è visualizzata dall'aumento concomitante del segnale del rapporto URA FF dovuto al rilascio di calcio. Una diminuzione del rapporto del segnale JC 1 a causa del collasso del potenziale di membrana e una diminuzione della diffusione della luce a causa del rigonfiamento mitocondriale mentre isolati da topi C 56 neri a sei J.

Come mostrato in questo video, il consumo di ossigeno è stato quindi misurato durante la respirazione dello stato tre in presenza di succinato e un DP e durante la respirazione dello stato quattro dopo un consumo di DP come mostrato qui, un'aggiunta di DP aumenta il consumo di ossigeno a causa della fosforilazione ossidativa e il consumo di ossigeno rallenta. Una volta che tutta una DP è stata consumata, la risposta dei mitocondri isolati al disaccoppiamento viene misurata mediante l'aggiunta di CCCP in presenza di CCCP. Il tasso di consumo di ossigeno è superiore a quello della respirazione allo stato tre per valutare l'integrità della membrana dei mitocondri isolati.

Il consumo di ossigeno è stato misurato in presenza di succinato e un DP e dopo l'aggiunta di citocromo C.As visto qui, l'aggiunta di citocromo C non aumenta significativamente il consumo di ossigeno rispetto a un DP e succinato indicando che le membrane mitocondriali intatte non sono permeabili al citocromo C per valutare la transizione di permeabilità mitocondriale, scarsa apertura nei mitocondri cardiaci isolati come indicatore della capacità di ritenzione del calcio mitocondriale. Transizione di permeabilità mitocondriale. La scarsa apertura è stata innescata da aggiunte sequenziali di 20 micromolari.

Il cloruro di calcio, il calcio extra mitocondriale e il potenziale di membrana sono stati misurati con gli indicatori metrici del rapporto. URA FF mostrato come traccia verde e JC quello mostrato come traccia rossa di rigonfiamento dei mitocondri è stato misurato registrando la diffusione della luce a 525 nanometri mostrata dalla traccia nera. La specificità dei segnali JC 1 e di rigonfiamento è stata testata con un micromolare, CCCP e cinque microgrammi per millilitro della tossina microbica etina Come si può vedere qui, l'assorbimento del calcio da parte dei mitocondri è accompagnato da una leggera depolarizzazione della membrana mitocondriale.

Dopo quattro impulsi di calcio, l'apertura del pool di transizione della permeabilità mitocondriale è vista come un aumento dell'URA FF che indica il rilascio di calcio. Una diminuzione di JC uno che indica il collasso del potenziale di membrana e un aumento del volume della matrice mitocondriale, che è visto come una riduzione della diffusione della luce come marcatore di gonfiore per verificare la specificità dell'apertura della porta di transizione della permeabilità mitocondriale. Le stesse misurazioni sono state eseguite in presenza di ciclosporina A, che si lega al componente PO di transizione della permeabilità mitocondriale cyclofillin D.As mostrato in questa figura, la presenza di un ciclista micromolare che bora A aumenta il numero di impulsi di cloruro di calcio necessari per aprire il PO di transizione di permeabilità mitocondriale rispetto al campione di controllo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare l'apertura della porta di transizione della permeabilità mitocondriale nei mitocondri cardiaci isolati. L'aspetto più difficile di questa procedura è ottenere mitocondri isolati di buona qualità. Pertanto, è importante eseguire misurazioni di controllo qualità prima di utilizzare i mitocondri per ulteriori esperimenti.