Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo mouse utilizzando In utero Elettroporazione

Lo scopo di questa procedura è quello di utilizzare in utero, l'elettroporazione, di visualizzare e manipolare geneticamente i dendriti e le spine nella corteccia cerebrale del topo e nell'ippocampo. Ciò si ottiene iniettando prima la soluzione di DNA plasmidico desiderata nel ventricolo laterale degli embrioni in utero. Successivamente, utilizzando diverse posizioni degli elettrodi Palo.

Secondo l'iniezione di DNA, la corteccia cerebrale o l'ippocampo viene elettroporato, quindi uno stadio postnatale o adulto desiderato. I topi vengono perfusi e i cervelli vengono raccolti. Infine, i cervelli vengono sezionati con un vibram.

In definitiva, i dendriti e le spine possono essere visualizzati utilizzando la microscopia confocale. La tecnica dell'elettroporazione unitaria presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi per lo studio del non retto e della colonna vertebrale. Infatti, questa tecnica permette innanzitutto di studiare questo aspetto direttamente in vivo.

Inoltre, rispetto alla generazione di topi knockout in elettro operazione è un approccio rapido per studiare l'effetto della soppressione genica o dell'espressione genica e don bianco e colonna vertebrale, non solo in una specifica struttura cellulare, ma anche in uno specifico punto di sviluppo. L'utilizzo di sistemi inducibili nel funzionamento inter elettro è anche uno strumento utile per identificare l'interazione funzionale tra i geni coinvolti nella scrittura del don e nello sviluppo della colonna vertebrale. Infatti, a differenza dei virus, ad esempio, è difficile per noi combinare più HNA o più tonnellate di gene nella stessa popolazione di cellule Per iniziare diluire il DNA alle concentrazioni desiderate in acqua e aggiungere rapidamente colorante verde a una concentrazione finale dello 0,05%Utilizzare un micro estrattore per perpet per estrarre aghi di vetro per iniezione.

Mettere una topolina incinta in una camera di induzione anestetica utilizzando fluoro e aprire l'ossigeno fino a due litri al minuto. Quando l'animale perde il riflesso della scrittura, trasferiscilo in una maschera pre-operatoria. Metti una goccia di IGEL su ciascun occhio e usa un rasoio elettrico per radere i peli dell'addome.

Pulisci una volta l'area rasata con clorexidina per raccogliere i peli volanti. Trasferire l'animale in una seconda maschera nell'area chirurgica con la schiena sul termoforo. Iniziare l'intervento chirurgico quando il riflesso dei petali è stato perso.

Indossa una maschera e guanti sterili e copri l'animale con un telo sterile. Pulire la zona rasata almeno tre volte con clorexidina. Usa un bisturi per praticare un'incisione verticale lungo la linea mediana attraverso la pelle.

Usando le forbici. Fai un'incisione simile sul muscolo dell'addome lungo il gomito lineare. Scegliere gli embrioni più accessibili.

Posizionare la pinza ad anello tra due embrioni ed estrarre con cautela la catena embrionale dalla cavità addominale. Da questo punto in poi, mantieni gli embrioni idratati con PBS preriscaldato sterile. Usando il forcipe ad anello.

Manipolare delicatamente la posizione dell'embrione all'interno del sacco amniotico e stabilizzare la testa tra gli anelli. Strizzare delicatamente per spingere l'embrione più vicino alla parete uterina. Con l'altra mano, prendi il supporto capillare e inserisci con cautela l'ago al centro dell'emisfero per colpire il ventricolo laterale.

Facendo attenzione a ridurre al minimo il movimento dell'ago sulla superficie della parete uterina ed evitando di perforare i vasi sanguigni, premere il pedale per iniettare circa 0,5 microlitri di soluzione di DNA verde. Posizionare gli elettrodi ai lati della testa dell'embrione con il pedale positivo sullo stesso lato del ventricolo iniettato per l'elettroporazione della corteccia, o sul lato opposto del ventricolo iniettato, l'elettroporazione dell'ippocampo. Quindi applicare cinque impulsi elettrici da 30 volt della durata di 50 millisecondi a intervalli di un secondo.

Evitare di applicare corrente attraverso la placenta in quanto ciò provocherà la morte dell'embrione Per aumentare le possibilità di sopravvivenza, iniettare ed elettrooperare tutti gli embrioni in meno di 30 minuti una volta completato al PBS, la cavità addominale, e utilizzare la pinza ad anello per sostituire il corno uterino nella sua posizione originale. Utilizzare suture riassorbibili in vicryl per chiudere l'addome, la parete e la pelle. Metti l'animale in una camera di recupero fino a quando non si sveglia.

Quindi trasferirlo in una gabbia su un termoforo 24 e 48 ore dopo l'intervento. Controlla il comportamento del topo per valutare il dolore, la sofferenza o l'angoscia e pesa l'animale per analizzare il cervello. Nelle fasi postnatali, utilizzare un vibratore per sezionare i cervelli precedentemente perfusi e montare i cervelli postfissi in aqua poly mount per visualizzare i dendriti e le spine.

Questa figura mostra esempi di cellule elettroporate nella corteccia cerebrale, quella ca e il giro dentato dell'ippocampo, mentre i topi di tipo sono stati elettroporati a E 14.5, dove il costrutto GFP e i cervelli sono stati raccolti al 14° giorno postnatale. Iniettando un piccolo volume di soluzione di DNA, alcune cellule vengono marcate, il che consente la visualizzazione dell'arborizzazione dendritica delle cellule GFP positive isolate, nonché delle loro spine a un ingrandimento maggiore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di iniettare un piccolo volume di DNA per colpire solo poche cellule, e di essere in grado di visualizzare e quantificare il non scrivere nella colonna vertebrale o negli elettroneuroni.