Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo mouse utilizzando In utero Elettroporazione

Lo scopo di questa procedura è utilizzare l'elettroporazione in utero per visualizzare e manipolare geneticamente dendriti e spine nel cervello del topo, in particolare nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo. Questo viene realizzato innanzitutto iniettando la soluzione di DNA plasmidico desiderata nel ventricolo laterale degli embrioni in utero. Successivamente, utilizzando diverse posizioni degli elettrodi Palo.

In base all'iniezione di DNA, la corteccia cerebrale o l'ippocampo vengono elettroporati, quindi a uno stadio postnatale o adulto desiderato. I topi vengono perfusi e i cervelli vengono raccolti. Infine, i cervelli vengono sezionati con un vibram.

In definitiva, le dendriti e le spine possono essere visualizzate mediante microscopia confocale. La tecnica dell'elettroporazione unitaria presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi per lo studio delle dendriti e delle spine. Infatti, questa tecnica consente innanzitutto di studiare questo aspetto direttamente in vivo.

Inoltre, rispetto alla generazione di topi knock-out, l'elettroporazione è un approccio rapido per studiare l'effetto della soppressione genica o dell'espressione genica nel tubo neurale e nella spina dorsale, non solo in specifiche strutture cellulari, ma anche in un determinato punto dello sviluppo. L'utilizzo di un sistema inducibile nell'elettroporazione intermedia è inoltre uno strumento utile per identificare le interazioni funzionali tra geni coinvolti nello sviluppo del tubo neurale e della spina dorsale. In effetti, a differenza dei virus, ad esempio, è possibile per noi combinare simultaneamente più HNA o più geni nell'identica popolazione cellulare. Per iniziare, diluire il DNA alle concentrazioni desiderate in acqua e aggiungere il colorante fast green fino a una concentrazione finale dello 0,05%. Utilizzare un micropipettatore per preparare le micropipette di vetro per l'iniezione.

Posizionare un topo gravido in una camera di induzione anestetica utilizzando isoflurano e aprire l'ossigeno fino a due litri al minuto. Quando l'animale perde il riflesso di scrittura, trasferirlo su una maschera pre-operatoria. Applicare una goccia di IGEL su ciascun occhio e utilizzare un rasoio elettrico per rasare i peli dell'addome.

Pulire l'area rasata una volta con clorhexidina per raccogliere i peli volanti. Trasferire l'animale su una seconda maschera nell'area chirurgica, con il dorso appoggiato sul tappetino riscaldante. Iniziare l'intervento chirurgico quando il riflesso palpebrale è stato perso.

Indossare una maschera e guanti sterili e coprire l'animale con un telo sterile. Pulire l'area rasata almeno tre volte con clorhexidina. Utilizzare un bisturi per praticare un'incisione verticale lungo la linea mediana attraverso la cute.

Utilizzando le forbici, effettuare un'incisione simile sul muscolo dell'addome lungo il gomito lineare. Selezionare gli embrioni più accessibili.

Posizionare la pinza a anello tra due embrioni ed estrarre con attenzione la catena embrionale dalla cavità addominale. Da questo momento in poi, mantenere gli embrioni idratati con PBS sterile preriscaldato. Utilizzando la pinza a anello.

Manipola delicatamente la posizione dell'embrione all'interno della sacca amniotica e stabilizza la testa tra gli anelli. Premi delicatamente per spingere l'embrione più vicino alla parete uterina. Con l'altra mano, prendi il supporto della capillare e inserisci con attenzione l'ago nella parte centrale dell'emisfero per colpire il ventricolo laterale.

Cercando di minimizzare il movimento dell'ago sulla superficie della parete uterina ed evitando di perforare i vasi sanguigni, premere il pedale per iniettare circa 0,5 microlitri di soluzione verde di DNA. Posizionare gli elettrodi ai lati della testa dell'embrione con il pedale positivo dallo stesso lato del ventricolo iniettato per l'elettroporazione della corteccia, oppure sul lato opposto rispetto al ventricolo iniettato per l'elettroporazione dell'ippocampo. Applicare quindi cinque impulsi elettrici di 30 volt della durata di 50 millisecondi a intervalli di un secondo.

Evitare di applicare corrente attraverso la placenta poiché ciò provocherebbe la morte dell'embrione. Per aumentare le probabilità di sopravvivenza, iniettare ed eseguire l'elettroporazione su tutti gli embrioni entro 30 minuti. Al termine, immergere in PBS la cavità addominale e utilizzare la pinza a anello per riposizionare il corno uterino nella sua posizione originale. Chiudere l'addome, la parete e la pelle con suture assorbibili in vicryl. Posizionare l'animale in una camera di recupero fino al risveglio.

Quindi trasferirla in una gabbia su un tappetino riscaldante a 24 e 48 ore dopo l'intervento chirurgico. Verificare il comportamento del topo per valutare dolore, sofferenza o distress e pesare l'animale per analizzare il cervello. In stadi postnatale, utilizzare un vibratomo per sezionare i cervelli precedentemente perfusi e postfissati, montare le sezioni in aqua poly mount per ottenere immagini di dendriti e spine.

Questa figura mostra esempi di cellule elettroporate nella corteccia cerebrale, nel CA1 e nel giro dentato dell'ippocampo, in topi di tipo selvatico elettroporati al giorno embrionale 14,5, in cui il costrutto GFP e i cervelli sono stati raccolti al giorno postnatale 14. Iniettando un piccolo volume di soluzione di DNA, vengono marcate poche cellule, permettendo la visualizzazione dell'arborizzazione dendritica di cellule isolate positive per GFP, nonché dei loro spine a ingrandimento maggiore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di iniettare un piccolo volume di DNA per mirare solo a poche cellule e per poter visualizzare e quantificare correttamente le spine e i neuroni eletroporati.