Una valutazione quantitativa della migrazione cellulare con il Test Phagokinetic motilità Traccia

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di essere in grado di misurare quantitativamente la motilità cellulare nel tempo utilizzando un saggio di motilità cellulare basato su nanoparticelle d'oro. Ciò si ottiene preparando prima i vetrini coprioggetto per un rivestimento di nanoparticelle d'oro. In particolare, i vetrini coprioggetto privi di endotossine vengono ricoperti di gelatina e poi cotti.

Il secondo passo consiste nel ridurre l'acido clorourico, che creerà nanoparticelle d'oro e nel rivestire uniformemente i vetrini di copertura rivestiti di gelatina con la soluzione. Successivamente, le celle vengono posizionate sui vetrini di copertura del rivestimento di nanoparticelle d'oro per il periodo di tempo desiderato delle celle dell'esperimento. Andando avanti, la gelatina sposterà le nanoparticelle d'oro creando tracce.

La fase finale è il monitoraggio e la quantificazione della motilità cellulare utilizzando la microscopia per visualizzare le tracce create dalle cellule in movimento. Infine, le misurazioni dell'area delle tracce vengono eseguite utilizzando un software disponibile gratuitamente. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'imaging time lapse, è che questo test richiede solo un microscopio ottico standard, una fotocamera standard e utilizza un software di imaging disponibile gratuitamente.

Inoltre, il test consente anche di analizzare e confrontare facilmente più campioni utilizzando un metodista in grado di eseguire screening ad alta produttività. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'influenza di diversi fattori fisiologici e sul movimento cellulare, può essere applicato anche ad altri sistemi, come gli studi sugli effetti che i patogeni hanno sulla motilità delle cellule infette. In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché il metodo richiede di seguire rigorosamente i volumi e le temperature indicate nel protocollo.

In questo protocollo, viene posta l'enfasi sulla valutazione del colore della soluzione finale di nanoparticelle d'oro precipitate per garantire il successo. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Poiché le fasi del saggio di motilità della traccia cinetica FGO, sono difficili da imparare.

Contengono diverse procedure non comunemente utilizzate nei laboratori di biologia cellulare e molecolare. Per preparare i vetrini di copertura ricoperti di gelatina, prima sospendere la gelatina e l'acqua deionizzata per ottenere la soluzione con una concentrazione finale di 0,5 grammi per 300 millilitri, quindi sterilizzare in autoclave la miscela per 15-30 minuti. È importante farlo entro due ore dall'aggiunta della gelatina in una cappa di coltura tissutale.

Preparare i vetrini coprioggetto per il rivestimento trasferendo prima da otto a nove vetrini coprioggetto lavati con acido in un piatto di plastica da 100 millimetri. Assicurarsi che i vetrini coprioggetto non si tocchino tra loro o con i lati del piatto. Pipettare con cura due o tre gocce di gelatina su ciascun vetrino coprioggetto evitando che trabocchi sulla piastra.

Quindi mettere la teglia contenente i vetrini di copertura ricoperti di gelatina in forno e cuocere a 90 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo 10 minuti, togliete la pirofila dal forno e rimettetela nel fazzoletto. Cappa di cultura.

Pipettare delicatamente la gelatina in eccesso. Rimettere la pirofila in forno e asciugare i vetrini coprioggetti a 70 gradi Celsius per 45 minuti. Una volta che i vetrini coprioggetto sono asciutti, togliere la pirofila dal forno e rimetterla nella cappa di coltura in tessuto.

Utilizzando delicatamente un ago sterile, sollevare un lato del vetrino coprioggetto. Quindi utilizzare una pinzetta sterile per rimuovere i vetrini di copertura ricoperti di gelatina dal piatto e posizionarli in pozzetti separati di una piastra a 24 pozzetti. Il passo successivo è quello di preparare i vetrini coprioggetto rivestiti in oro colloidale.

Iniziare preparando 10 millilitri di soluzione di citrato di sodio allo 0,5% lavorando in una cappa di coltura tissutale combinati 1,5 millilitri della soluzione di acido cloro-ORICO da 14,5 millimolari e 13,5 millilitri di acqua deionizzata in autoclave in un pallone di erlenmeyer sterile privo di endotossine Per ogni otto-nove vetrini coprioggetti, il risultato dovrebbe produrre una soluzione gialla tenue. L'acido cloro ORIC è tossico e deve essere maneggiato con cura. È anche sensibile alla luce, quindi la fase di ebollizione deve essere eseguita in condizioni di scarsa illuminazione.

Quando la soluzione ha raggiunto il punto di ebollizione, rimuovere il pallone dalla piastra calda e trasferirlo su una piastra di agitazione. Per formare le particelle di oro colloidale in soluzione, aggiungere 0,7 millilitri della soluzione di citrato di sodio allo 0,5% per 15 millilitri di soluzione di acido cloro ORIC mescolando, continuando a mescolare per circa due minuti. Durante questo periodo, la soluzione cambierà da un giallo tenue a chiaro a grigio a viola a viola intenso.

Prima di raggiungere finalmente un colore rosso o preferibilmente ruggine, aspirare la soluzione di oro colloidale in una pipetta da 10 millilitri e lasciare raffreddare la soluzione nella pipetta per uno o due minuti fino a raggiungere la temperatura ambiente. Quindi aggiungere da 0,5 a un millilitro sopra i vetrini coprioggetti rivestiti di gelatina nella piastra a 24 pozzetti Posizionare la piastra a 24 pozzetti contenente i vetrini coprioggetti ricoperti di oro colloidale in un incubatore a 37 gradi Celsius e incubare per 30 minuti. Dopo che le particelle hanno avuto il tempo di depositarsi sui vetrini coprioggetti rivestiti di gelatina, controllarne la densità al microscopio ottico.

L'appropriata distribuzione delle nanoparticelle d'oro aiuta a distinguere in modo semplice ed efficiente i bordi dei camion solari. La densità ottimale varia con le dimensioni della cella. Una concentrazione di particelle d'oro troppo alta ostacola la capacità delle cellule di muoversi, mentre una concentrazione di particelle d'oro troppo bassa limita la capacità di delineare un percorso accurato della motilità.

Per questo motivo, negli esperimenti individuali dovrebbero essere utilizzati insieme solo vetrini di copertura realizzati nello stesso lotto o che sono stati progettati per avere la stessa densità. Se la concentrazione di particelle d'oro è insufficiente, aggiungere altri 0,5-1 millilitro di soluzione di oro colloidale ai vetrini coprioggetti rivestiti di gelatina. Se invece la concentrazione di particelle d'oro è troppo alta, come nel caso qui mostrato, l'unica scelta efficace è quella di rifare la soluzione di oro colloidale e rivestire nuovi vetrini.

Se la densità delle particelle è corretta, rimettere la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius e incubare per un'ora per tutta la notte per risciacquare via le particelle d'oro non legate immergendo tre volte i vetrini di copertura in soluzione salina sterile tamponata con fosfato. Quindi conservare i vetrini coprioggetti rivestiti di oro colloidale in pozzetti riempiti di PBS di una piastra pulita a 12 pozzetti a quattro gradi Celsius fino a quando non sono pronti per essere utilizzati. I vetrini coprioggetti non devono essere lasciati asciugare e devono essere utilizzati entro due o tre mesi dalla data in cui sono stati realizzati.

Il passo successivo è quello di preparare i vetrini coprioggetti rivestiti in oro colloidale per la coltura cellulare. Iniziare posizionandoli nei singoli pozzetti di una piastra da 24 pozzetti a cui sono stati aggiunti circa 0,3 millilitri di terreno di coltura prima dell'aggiunta del coperchio I vetrini trasferiscono da 5.000 a 50.000 cellule su ciascun vetrino di copertura rivestito in oro colloidale. Il numero di celle varia in base al tipo di cella, ma la densità delle celle deve essere sufficientemente bassa da evitare la sovrapposizione di tracce di celle da più celle nella stessa area.

Coprire la piastra e metterla in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per sei-24 ore In base alla motilità del tipo di cellula, il periodo di tempo ottimale dovrebbe essere determinato sperimentalmente per ciascun tipo di cellula dopo l'incubazione, correggere eventuali vetrini di copertura che non verranno analizzati immediatamente immergendoli prima due volte in PBS seguito dall'incubazione in 3% di para formaldeide per 15 minuti a temperatura ambiente utilizzando un Cattura immagini luminose dei binari creati da una singola cella in movimento su vetrini di copertura fissi o non fissi. L'ingrandimento utilizzato per scattare foto delle tracce cellulari varia a seconda del tipo di cellula. Tuttavia, lo stesso ingrandimento deve essere utilizzato per ogni studio per poter confrontare i risultati.

Per i monociti, l'ingrandimento 40x funziona bene utilizzando il software disponibile gratuitamente come l'immagine, l'immagine JNIH o lo strumento di immagine per determinare l'area media dell'oro colloidale eliminato da 10 a 20 o più cellule per ogni campione dalle immagini catturate mostrate qui è il percorso liberato delle particelle di oro colloidale da un singolo monocita non stimolato prelevato con un obiettivo 40x. Le cellule non mobili creano caratteristiche piccole tracce ovali o circolari intorno a se stesse, il che indica un basso livello di movimento vassallo. Al contrario, le cellule altamente mobili sono caratterizzate da un movimento direzionale come tratti allungati e aree complessive più grandi a causa delle loro forme irregolari.

Le tracce cellulari vengono analizzate al meglio utilizzando lo strumento a mano libera del software Image J per delinearne il volume. Le misurazioni quantitative dell'area possono quindi essere eseguite utilizzando lo strumento di misurazione nel menu di analisi dell'immagine J. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di seguire rigorosamente i volumi e le temperature indicati nel protocollo, poiché le deviazioni possono influenzare fortemente i risultati finali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare vetrini di copertura rivestiti di gelatina, come preparare nanoparticelle d'oro e vetrini di copertura rivestiti di nanoparticelle d'oro e come monitorare e valutare quantitativamente il movimento cellulare utilizzando una microscopia ottica.

Non dimenticare che lavorare con le soluzioni bollenti su una piastra calda, in particolare i vapori della soluzione bollente di fluoro, acido AIC e citrato di sodio, può essere pericoloso prendere precauzioni come lavorare nella cappa e usare il buon senso durante l'esecuzione di questa procedura.