Vivo Valutazione Ex della contrattilità, affaticabilità e alternanza in isolati muscoli scheletrici

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare muscoli sani e integri per lo studio della funzione contrattile in vitro. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto il muscolo estensore lungo delle dita o EDL e il muscolo soleo o muscoli soli dal topo. Il secondo passaggio consiste nell'annodare i legamenti e i tendini dei muscoli EDL e soli con un filo chirurgico.

Successivamente, montare i muscoli isolati sul trasduttore di forza e nella camera contrattile. L'ultimo passaggio consiste nello stimolare il muscolo con impulsi elettrici applicati mediante campo elettrico per indurre le contrazioni. Alla fine, le forze risultanti vengono trasmesse al trasduttore di forza e registrate; inoltre, possono essere eseguite diverse manipolazioni fisiologiche e farmacologiche per confrontarne gli effetti sulla contrattilità muscolare.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per valutare la funzione muscolare, come la misurazione della contrattilità in situ, la valutazione delle prestazioni maschili, ecc., consiste nel fatto che questo metodo elimina i componenti neuronali e vascolari dal muscolo scheletrico, permettendo una valutazione diretta delle proprietà intrinseche del muscolo contratto. Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontrano difficoltà nella procedura, poiché la dissezione di muscoli intatti richiede destrezza manuale e pazienza dimostrata. Questa procedura sarà eseguita da un tecnico del mio laboratorio e da Keyhole Park, un ricercatore post-dottorato nel laboratorio del Dott. Jma.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la dissezione muscolare e il montaggio nella camera contrattile sono operazioni difficili da eseguire. Pertanto, questo video aiuta a comprendere la struttura anatomica del muscolo e a valutare l'ordine di grandezza necessario per il montaggio del muscolo isolato. In questa procedura, si sacrifica un topo di tipo selvatico C 57 black six o un modello murino di malattia mediante dislocazione cervicale e lo si posiziona lateralmente.

Per dissezionare il muscolo EDL, effettuare un'incisione superficiale della cute. Aprire la fascia tra il tibiale anteriore e il gruppo muscolare posteriore. Individuare l'origine prossimale dove il legamento è connesso al condilo laterale della tibia e alla superficie anteriore della fibula, nei suoi tre quarti superiori.

Successivamente, tagliare il legamento con forbici oftalmiche delicate il più distante possibile dal muscolo, per rilasciare l'origine prossimale del muscolo EDL. Dopodiché, afferrare il legamento con un paio di pinzette ottuse e tirarlo lentamente per liberare il muscolo EDL. Potrebbe essere necessario tagliare parte del perimisio che circonda il muscolo EDL e altri muscoli adiacenti.

Questo passaggio deve essere eseguito con delicatezza per evitare di danneggiare il muscolo EDL. Successivamente, nella regione di inserzione in cui i quattro tendini distali si inseriscono nelle falangi mediale e distale delle dita da due a cinque, recidere i tendini il più lontano possibile dai muscoli. Trasferire il muscolo EDL isolato in una piastra per dissezione contenente soluzione di Tyro isotonica priva di calcio.

Il muscolo EDL è un muscolo glicolitico veloce dal colore bianco-rosato pallido, lungo circa 10-13 millimetri e con un peso di otto-e undici milligrammi. Successivamente, annodare saldamente un nodo chirurgico ad entrambe le estremità del muscolo EDL isolato utilizzando un filo di sutura di calibro sei, il più lontano possibile dal muscolo e leggermente al di sopra del punto medio in senso longitudinale del legamento o del tendine. Trasferire quindi il muscolo EDL nella camera del bagno tissutale saturata di ossigeno.

Montare il muscolo nella scanalatura del campione del trasduttore di forza e nell'uncino fisso nella parte inferiore della camera del bagno. Ripetere il processo di isolamento e montaggio per il muscolo EDL dall'altra gamba per dissezionare il soleo sul lato laterale posteriore della gamba. Spostare il muscolo gastrocnemio che normalmente lo ricopre.

Il soleo è un muscolo di tipo ossidativo lento, di colore rosso scuro, circa un millimetro più corto del muscolo dito-estensore (EDL), ma con un peso leggermente superiore rispetto all'EDL. All'origine prossimale, recidere il legamento che si connette alla metà prossimale della tibia posteriore lungo la linea del soleo e al terzo prossimale della fibula posteriore.

Successivamente, all'inserzione distale, recidere il tendine calcaneare che si inserisce sul calcagno posteriore. Liberare con attenzione il muscolo della pianta in seguito. Montare correttamente il muscolo della pianta nella camera del bagno.

Dopo aver posizionato i muscoli in camere separate per bagni tissutali, iniziare la registrazione dei dati. Ricordarsi di azzerare la linea di base del trasduttore di forza. Questo agevolerà l'osservazione delle variazioni della linea di base e semplificherà il confronto delle contrazioni muscolari in diverse condizioni sperimentali.

Quindi stimolare i muscoli isolati con impulsi a onde quadre. Utilizzare correnti elettriche comprese tra 60 e 300 milliampere, con durata individuale degli impulsi a onde quadre compresa tra 0,3 e 1 millisecondo e durata degli stimoli ripetuti di 350, 500 o 1000 millisecondi. Il passo successivo consiste nella selezione di una frequenza di stimolazione in grado di produrre la forza tetanica massimale quando il muscolo isolato è allungato alla sua lunghezza ottimale a temperatura ambiente.

Questa frequenza è tipicamente di circa 100 hertz per il muscolo EDL e di 60 hertz. Per il solio, allungare lentamente il muscolo e attendere 30 secondi, quindi stimolarlo a 100 hertz o 60 hertz. Successivamente, allungarlo nuovamente.

Attendere altri 30 secondi e stimolare nuovamente durante l'allungamento. Se la forza non aumenta ulteriormente, ciò indica normalmente che è stata raggiunta la forza massima. Nel frattempo, durante cicli ripetuti di allungamento e stimolazione, una diminuzione della forza suggerisce che i muscoli sono stati troppo allungati. In questa situazione, rilasciare il muscolo al livello di allungamento precedente e stimolare nuovamente il muscolo fino a quando non si osserva la forza massima.

Ora, ottenere la relazione tra forza e frequenza. Stimolare il muscolo con frequenze comprese tra 1 e 140 hertz, con incrementi di cinque a 10 hertz e una periodicità di 30-60 secondi. Quando si eseguono gli esperimenti a 25 gradi Celsius, se gli esperimenti vengono effettuati a 37 gradi Celsius, estendere la FF a frequenze più elevate, fino a 300 hertz per il muscolo diaframma, da 180 a 200 hertz per il soleo e da 220 a 250 hertz per l'EDL.

Successivamente, confrontando la quantità di forza generata da ciascuna frequenza di stimolazione, identificare la frequenza che produce una forza tetanica massima e approssimativamente pari alla metà della forza tetanica massima. Tmax fornisce informazioni importanti sulla modulazione dell'apparato contrattile. Mentre la metà di Tmax fornisce informazioni più pertinenti alla regolazione del calcio e al processo di accoppiamento eccitazione-contrazione (ECC).

Il muscolo viene quindi stimolato con frequenza tmax a intervalli di un minuto per 30 minuti, un processo definito equilibratura, per studiare il contributo del reticolo sarcoplasmatico. Il rilascio di calcio sulla contrattilità muscolare dopo l'equilibratura induce affaticamento del muscolo mediante stimolazione alla metà di Tmax a intervalli di due secondi per cinque minuti. In questo caso, abbiamo utilizzato una durata dell'impulso di 500 millisecondi e, di conseguenza, il ciclo di lavoro è del 25%. Successivamente, si recupera il muscolo stimolando alla metà di Tmax a intervalli di un minuto.

Per 30 minuti o fino a quando la forza non diventa stabile, può essere eseguito un ulteriore protocollo di affaticamento. Attualmente, l'affaticamento a tmax effettuato a Tmax è ritenuto un test accurato dello stato della macchina contrattile. Successivamente, ripetere le procedure per ottenere FF in modo da poter osservare le differenze fenotipiche tra diversi ceppi, modelli di malattia o trattamenti farmacologici.

Analizzando il FF prima e dopo l'affaticamento per esaminare il contributo dell'ingresso di calcio extracellulare alla contrattilità muscolare, la soluzione di bagnatura può essere sostituita con una soluzione priva di calcio, ma contenente EGTA 0,1 millimolare. In alternativa, diversi inibitori dei canali attivati dallo svuotamento dei depositi possono essere aggiunti alla soluzione di bagnatura. Al termine dell'esperimento, misurare la lunghezza sperimentale dei muscoli, quindi pesarli singolarmente con una bilancia analitica, congelarli rapidamente in azoto liquido e conservarli a meno 80 gradi Celsius per analisi biochimiche.

Ora, calibrare il trasduttore di forza. Convertire la forza muscolare registrata in millivolt in forza in grammi sulla base dei risultati di calibrazione. Quindi normalizzarla rispetto all'area fisiologica della sezione trasversale.

Questa figura mostra le forze contrattili indotte da cinque hertz, 20 hertz e la forza tetanica massimale; qui è riportata una traccia della forza contrattile di un muscolo danneggiato. Questo è un esempio rappresentativo che mostra le singole contrazioni di una relazione forza-frequenza nel muscolo EDL e la curva plottata risultante dalla ff. Questo è un profilo tipico di affaticamento con declino rapido del muscolo EDL e un profilo di affaticamento con declino lento del muscolo soleo.

Una stimolazione faticante porta all'insorgenza di alternanze meccaniche in un muscolo knock-out con alterate proprietà di gestione del calcio. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore. Se eseguita correttamente, l'intero esperimento richiederà più tempo e dipenderà dal numero di interventi effettuati. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante isolare e montare il muscolo DL il più rapidamente possibile, poiché l'ambiente in vitro a basso contenuto di ossigeno potrebbe causare danni irreversibili al muscolo, particolarmente sensibile.

Seguendo questa procedura, analisi genica, immunoblotting, immunohistochemia e studi strutturali possono essere eseguiti sugli stessi muscoli sperimentali per rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, livello di espressione e localizzazione di una proteina specifica o di componenti delle proteine muscolari che regolano la contrattilità o il segnale del calcio, nonché alterazioni morfologiche o ultrastrutturali nei muscoli derivanti da una particolare condizione dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia muscolare per esplorare difetti genetici che influenzano la funzione del muscolo scheletrico in vari modelli, inclusi topi, ratti e criceti.