Name: Imaging Glioma Iniziazione In Vivo Attraverso un lucido e sottile rinforzato cranio finestra craniale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Impara a visualizzare l'iniziazione del glioma in vivo mediante una finestra cranica sottile e lucida su modelli murini. Questa tecnica consente l'imaging longitudinale dello sviluppo tumorale con microscopia a due fotoni.

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Questo lavoro è supportato da Il Laboratorio pilota di Grant Jackson Cancer Center e The Maine Cancer Foundation.

1. Protocollo <ol><li> Anestetizzare il mouse con chetamina e xilazina alla dose di 0,1 mg di ketamina e 0,01 mg di xilazina per 1 g di peso corporeo. Carprofen (0,005 mg per 1 g di peso corporeo) è utilizzato per analgesia e viene somministrato prima dell&#39;intervento. </li><li> Tutti gli strumenti chirurgici, compresa la punta dentale, sono sterilizzati a vapore in autoclave. Se ambulatori lotti devono essere eseguite, le punte di strumenti chirurgici devono essere sterilizzati con una perlina di vetro sterilizzatore (Belle Scienza Strumenti FST 250) prima di ogni intervento chirurgico successivo. </li><li> Una volta che il mouse ha raggiunto un piano chirurgico di anestesia, valutato da mancanza di una risposta a una presa punta, viene posto su un dischetto di cotone che viene poi posto su un pad riscaldato per mantenere una temperatura corporea di ~ 37 ° C. La profondità di anestesia viene monitorata frequentemente durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Pelliccia viene rimossa dalla testa dorsale in una zona approssimativamente triangolare ~ 3 mm caudale alle narici ed estendendo caudalmente al cervical vertebre. Pomata oftalmica è applicato occhi per proteggerli da disidratazione e irritazione. </li><li> Il mouse viene posizionato in recumbancy ventrale e la pelle viene disinfettato con iodio chirurgica, 70% di etanolo, e tamponi sterili. Un x 0,8 1,0 cm pattina di pelle che ricopre il dorso delle ossa frontali e parietali del cranio viene rimosso con le forbici sottili. </li><li> Un analgesico topico, 0,5% lidocaina, viene applicato localmente sul periostio e tessuti esposti alla periferia della ferita. Il periostio viene rimosso delicatamente raschiando il cranio con una lama di bisturi; questo aiuterà la colla cianoacrilato di aderire all&#39;osso. </li><li> L&#39;area corticale di interesse è descritta sul cranio con un pennarello. L&#39;area di interesse non deve essere posizionato su linee di sutura del cranio, per evitare danni alle navi di grandi dimensioni sottostanti. </li><li> Un sottile strato di adesivo cianoacrilato è applicato ai margini della ferita, per impedire la fuoriuscita di liquido sanguinolento, e al cranio salvol&#39;area di interesse. </li><li> Fotoattivabile cemento dentale viene utilizzato nel nostro protocollo per sigillare il cranio. Prima dell&#39;applicazione del cemento dentale, tutte cranio esposto tranne l&#39;area destinata assottigliamento viene trattato con primer e successivamente con il legante dal fotoattivabile kit cemento dentale. Una volta che l&#39;adesivo è essiccato, il fotoattivabile cemento dentale viene applicato per coprire il cranio. Per stabilizzare la testa del topo per la chirurgia successiva e di imaging, una sterile # 00-90 dado esagonale è incorporato nel cemento dentale a distanza dalla zona di essere assottigliato. L&#39;utilizzo della luce-attivato cemento dentale ci permette di preparare il cranio senza dover correre per completare l&#39;intera procedura. Dopo la preparazione del cemento dentale sul cranio è completata, il cemento dentale viene indurito con luce visibile. </li><li> Dopo il cemento dentale viene indurita, un supporto copricapo dal dispositivo stereotassica è montato il dado esagonale sulla testa mouse usando una vite # 00-90. </li><li> A drop di temperatura ambiente, 0,9% soluzione salina sterile viene applicato alla zona cranio per essere assottigliato. Con l&#39;ausilio di uno stereomicroscopio, ad alta velocità micro-trapano viene utilizzato per diluire un&#39;area circolare del cranio (tipicamente ~ 4-5 mm di diametro) sopra la regione di interesse. Foratura e l&#39;applicazione della soluzione salina per la zona forata vengono eseguite intermittenza durante la procedura di assottigliamento per evitare danno termico al tessuto sottostante cerebrale. Saline assorbe calore e aiuta anche ammorbidire l&#39;osso. </li><li> Il cranio del mouse è composto da due sottili strati di osso compatto, sandwich uno spesso strato di osso spugnoso. Lo strato esterno di osso compatto e più dell&#39;osso spugnoso vengono rimossi con il trapano. </li><li> Dopo la maggioranza dell&#39;osso spugnoso viene rimosso, le cavità rimanenti all&#39;interno dell&#39;osso spugnoso può essere visto sotto un microscopio da dissezione, che indica che si sta avvicinando alla foratura strato interno osso compatto. In questa fase, lo spessore cranio dovrebbe essere ancora più di 50 pm. Skull diradamento deve esserecontinuato accuratamente per ottenere una preparazione molto sottile (circa 20 micron) e liscia. </li><li> Una volta che lo spessore desiderato del cranio è ottenuta (~ 20 micron), il cranio viene prima lucidata con una misura frusta in silicone con pasta diamantata (6-15 micron) per circa 10 minuti. Il diamante, pasta per lucidatura serve a due scopi. In primo luogo, si assottiglia ulteriormente il cranio senza applicare pressione sul cranio assottigliato, evitando in tal modo i danni accidentali al tessuto cerebrale sottostante. In secondo luogo, serve come una fase di lucidatura iniziale per il cranio diluito prima della grana fine ossido di stagno è usata per la lucidatura cranio ulteriormente. </li><li> Dopo il diamante pasta lucidante, il cranio diluito viene lucidato con ossido di stagno per circa 10 min. Una volta che il cranio è lucido, l&#39;ossido di stagno viene lavata via con soluzione fisiologica fino a quando il cranio appare assottigliato pulito. </li><li> A questo punto, se la finestra cranica è da utilizzare per longitudinale imaging in vivo, la zona pulita cranio sottile viene essiccato. Una piccola goccia di chiaracolla di cianoacrilato è applicato per sigillare la finestra cranica. Lo strato di colla cianoacrilato tra il cranio assottigliato e il coprioggetto deve essere il più sottile possibile. </li><li> Se l&#39;iniezione deve essere eseguita dopo la creazione di una finestra porti cranica, in questa fase, un 26-gauge siringa viene usato per creare una piccola apertura su un lato del cranio lucido sottile finestra. Questa apertura è utilizzato per l&#39;iniezione di cellule GBM. </li><li> Una pipetta di vetro sterile con una punta di apertura di circa 50 micron di diametro viene tirato con un estrattore pipetta. Questo pipetta sarà utilizzato per l&#39;iniezione di cellule GBM, e viene caricato su un micromanipolatore. La pipetta è caricato in un angolo di 30 gradi in modo che il GBM sito di iniezione delle cellule sarà lontano dal sito di imaging finale. La punta della pipetta viene rimosso sotto un microscopio di dissezione. La sospensione cellulare è GBM caricato frontalmente nella pipetta per aspirazione usando una pompa a siringa. </li><li> Una volta che la pipetta di iniezione è caricato con cellule GBM, il mouse viene spostato indietro in the microscopio. La pipetta di iniezione si abbassa verso la piccola apertura nella finestra craniale ed infine inserito nel cervello attraverso l&#39;apertura utilizzando un micromanipolatore. 1 ml di sospensione cellulare GBM viene iniettato nel cervello 100-200 micron dalla superficie del cervello (velocità: 0,1 microlitri / min, durata: 10 min). </li><li> Il cranio è essiccato, una piccola goccia di colla di cianoacrilato chiaro viene applicato al cranio essiccato, e un pezzo di 3 mm di dimensione # 1 coprioggetto viene fatto aderire alla superficie del cranio sottile e lucido. Lo spazio tra il vetrino e adiacente cemento dentale è sigillato con colla cianoacrilato. </li><li> Dopo l&#39;intervento chirurgico, il mouse viene iniettato per via sottocutanea con 1 ml di soluzione salina calda sterile e dotato a calore per mantenere la temperatura corporea fino alla completa guarigione da anestesia. </li><li> Per l&#39;imaging, i topi vengono anestetizzati con chetamina e xilazina alla dose di 0,1 mg di ketamina e 0,01 mg di xilazina per 1 g di peso corporeo. I topi sono immobilizzate con un telaio su misura stereotassicosotto il microscopio. Se ripetitivo imaging in vivo è effettuata su base giornaliera, isofluorano sarà una scelta migliore, come topi mostrano segni di dipendenza con l&#39;uso ripetitivo di ketamina. </li></ol> 2. Risultati rappresentativi Un successo l&#39;intervento chirurgico finestra Porte cranica permette la finestra cranica rimanere chiaro per settimane o mesi. Figura 1 mostra la vascolarizzazione sotto una finestra porte cranica visualizzato per mezzo di luce riflessa. Queste immagini vascolatura stati usati come punti di riferimento per la localizzazione stesse aree cerebrali per l&#39;imaging ripetitivo. Per visualizzare sia le cellule endoteliali e le cellule vascolarizzazione GBM, abbiamo attraversato il B6.Cg-Tg (Tek-cre) 1Ywa / J del mouse, che etichetta cellule endoteliali con la B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato ) HZE / J del mouse, e generata topo con cellule endoteliali vascolari etichettati con il tdTomato rosso proteina fluorescente. Abbiamo quindi effettuato la procedura di craniotomia porte su questi mice, e iniettata GFP marcati GBM cellule nel cervello attraverso una piccola apertura sul lato di una finestra cranica. Abbiamo quindi effettuato in vivo a due fotoni di imaging longitudinalmente sui topi iniettati. La lunghezza d&#39;onda di eccitazione del laser è stato fissato a 910 nm, che ha portato l&#39;eccitazione di entrambi GFP e tdTomato. Due fotoni di imaging è stato eseguito su una fuoriserie due fotoni a scansione laser con due rivelatori per simultanea capacità verde / rosso rilevazione della fluorescenza. Figura 2 mostra un esempio in vivo di apertura da cellule di glioma GBM iniettato vicino la vascolarizzazione. La finestra porti cranica è anche una scelta eccellente per cronica time-lapse imaging in vivo. Figura 3 mostra una colorazione GFAP di sezioni corticali da un mouse senza intervento chirurgico porte, un mouse 7 giorni dopo l&#39;intervento porti, e un mouse 7 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico porti e iniezione di soluzione salina. È evidente dalle immagini che il mouse senza intervento chirurgico e il mouse con PoRTS chirurgia non hanno gliosi, mentre dopo l&#39;iniezione salina, gliosi è osservata nel tessuto cerebrale di topo, per pipettare penetrazione e iniezione salina nel cervello. Questo risultato dimostra che gliosi non si verifica sotto la finestra porti cranica, che fornisce una convalida indipendente che le porte finestra cranica qui descritte non comporti la gliosi che è in genere associato a un &quot;aperto skull&quot; finestra cronica cranica. Figura 4 mostra ad alta risoluzione imaging di spine dendritiche dal mouse stesso il giorno dell&#39;intervento (giorno 0) e 32 giorni dopo la creazione della finestra porte (giorno 32), a dimostrazione che la finestra porti è anche una scelta eccellente per l&#39;alta risoluzione imaging in vivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig1.jpg" /> Figura 1. Visualizzazione dei vasi sotto una finestra lucido e armato cranio diluito cranica con luce riflessa. Giorni rappresentano t<html> l numero di giorni dopo l&#39;intervento, le immagini sono state scattate a partire dal giorno dell&#39;intervento chirurgico subito dopo il completamento della iniezione di cellule GBM. Scala bar:. 0,5 millimetri <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig2.jpg" /> Figura 2. Visualizzazione delle cellule iniettate GBM e vascolarizzazione in vivo. I topi che trasportano sia Tek-Cre e ROSA26 CAG-tdTomato sono stati utilizzati per l&#39;iniezione di cellule GBM. Cellule endoteliali vascolari sono state marcate con tdTomato (rosso), e le cellule sono state marcate con GBM GFP (verde). Le immagini sono state acquisite a partire 24 ore dopo l&#39;iniezione di cellule GBM. Un totale di 10-12 campi adiacenti di vista sono stati prelevati e sono stati assemblati adiacenti l&#39;una all&#39;altra, con le celle identificate GBM iniettato nel centro del campo totale, per produrre le immagini finali. Giorni rappresentano il numero di giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. Scala bar: 100 micron.href = target &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg&quot; = &quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig3.jpg" /> Figura 3. Gliosi non si verifica dopo l&#39;intervento finestra Porte cranica. I pannelli superiori: cervello sezione coronale del mouse in basso ingrandimento. Sinistra: un mouse senza alcun intervento chirurgico finestra cranica; non si osserva l&#39;attivazione GFAP nel tessuto cerebrale. Pannello centrale: un mouse con una finestra porte cranica generata sul lato destro del cervello, non si osserva attivazione GFAP nel tessuto cerebrale. Pannello di destra: un mouse con una finestra porte cranica e iniezione salina dal lato della finestra Porte. Attivazione GFAP è osservato il lato della finestra porte, ma non sul lato del tessuto cerebrale intatto. Scala bar: 1 mm. Pannello inferiore: più potenza immagini dei tessuti cerebrali in aree come indicato nella casella bianca della parte superiore del pannello immagini. Scala bar: 100 micron. <ahref = target &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig3large.jpg&quot; = &quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig4.jpg" /> Figura 4. Imaging ad alta risoluzione delle spine dendritiche di Thy-1 topi YFPH. Le immagini sono state acquisite sul giorno dell&#39;intervento porte, e 32 giorni dopo l&#39;intervento porti. E &#39;evidente dalle immagini che la maggior parte spine presentano al giorno 0 sono chiaramente visibili 32 giorni dopo l&#39;intervento porti. Scala bar: 2 micron.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La chiave per una finestra portuale di successo del cranio è l&#39;assottigliamento e la lucidatura. Mentre il diradamento iniziale può essere eseguita rapidamente, occorre prestare attenzione a garantire assottigliamento omogenea del cranio su una vasta area. Abbiamo tipicamente applicare un sottile strato di soluzione salina al cranio, e quindi un passaggio sottile il cranio alla volta, in modo tale che la soluzione salina evapora poco dopo la microdrill è passato sopra la volta cranica. Questo ci permette di lentamen...

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> DMEM/F12 (1:1) con piruvato di sodio </td><td> Thermo Sci Hyclone </td><td> SH3026101 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 Supplemento Siero gratuita (50x) </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-1 Supplementare </td><td> Invitrogen </td><td> 35050061 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-Streptomicina soluzione </td><td> Thermo Sci Hyclone </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Accutase-enzima cellulare Medio distacco </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> T25 fiaschi-vent tappo verde </td><td> SARSTEDT </td><td> 83.1810.502 </td><td></td></tr><tr><td> 70% di alcool </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% di povidone-iodio soluzione topica </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ketamina HCl </td><td> Butler Animal Health di alimentazione </td><td> NDC # 11695-0550-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazina </td><td> Akorn, Inc. </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Carprofen </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Unguento oftalmico </td><td> Dechra veterinari </td><td> 17033-211-38 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5% lidocaina HCl </td><td> REGENT, Inc. </td><td> NDC 0517-0625-25 </td><td></td></tr><tr><td> Colla cianoacrilato </td><td> Henkel Corp. </td><td> 46551 </td><td></td></tr><tr><td> Tamponi sterili </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-114 </td><td></td></tr><tr><td> Diamante pasta </td><td> Widget di alimentazione </td><td> BBE60 </td><td></td></tr><tr><td> Ossido di stagno </td><td> LORTONE, Inc. </td><td> 591-038 </td><td></td></tr><tr><td> Liner Obbligazioni 2V </td><td> KURARAY Medical Inc. </td><td> 1921-KA </td><td></td></tr><tr><td> Clearfil AP-X </td><td> KURARAY Medical Inc. </td><td> 1721-KA </td><td></td></tr><tr><td> Salino </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Copertura in vetro </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0720 </td><td></td></tr><tr><td> Dado esagonale </td><td> Parti piccole, Inc. </td><td> HNX-0090-C </td><td></td></tr><tr><td> Pompa a siringa </td><td> Syringepump.com </td><td> NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Due-Photon sistema di imaging </td><td> Costruito su misura (Qualsiasi sistema commerciale sarebbelavoro) </td><td></td><td></td></tr></table>

imaging glioma iniziazione<em&gt; in vivo</em&gt; attraverso un lucido e sottile rinforzato cranio finestra craniale

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Glioma è una delle forme più letali di cancro umano. La terapia più efficace per glioma data-chirurgia seguita da radioterapia-offre ai pazienti solo benefici modesti, come la maggior parte dei pazienti non sopravvive più di cinque anni dopo la diagnosi a causa di 1,2 glioma ricaduta. La scoperta delle cellule staminali tumorali nei tumori cerebrali umani promette di avere un impatto enorme sullo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per il glioma 3. Cellule staminali tumorali sono definite dalla loro capacità sia di auto-rinnovarsi e differenziarsi, e si pensa siano le uniche cellule di un tumore che hanno la capacità di avviare nuovi tumori 4. Glioma radioterapia recidiva seguente è pensato per derivare da resistenza delle cellule staminali di glioma (GSC) alla terapia 5-10. In vivo, GSC sono mostrati di risiedere in una nicchia perivascolare che è importante per mantenere le loro cellule staminali-simili caratteristiche 11-14 . Al centro della organizzazionezione della nicchia GSC sono cellule endoteliali vascolari 12. I dati esistenti suggeriscono che la GSC e la loro interazione con le cellule endoteliali vascolari sono importanti per lo sviluppo del tumore, e identificare GSC e la loro interazione con le cellule endoteliali come importanti bersagli terapeutici per glioma. La presenza di GSC è determinato sperimentalmente in base alla capacità di avviare nuovi tumori upon trapianto ortotopico 15. Questo è in genere ottenuto iniettando un certo numero di cellule isolate da GBM tumori umani nel cervello di gravemente immuno-carente topo, o di cellule di topo GBM nel cervello di topi ospitanti congenici. Saggi di crescita tumorale vengono poi effettuate dopo un tempo sufficiente a consentire GSC tra le cellule iniettate GBM dare origine a nuovi tumori-tipicamente diverse settimane o mesi. Quindi, saggi esistenti non consentono esame del processo patologico importante di iniziazione tumore da GSC singoli in vivo. Di conseguenza, i essenzialensights nei ruoli specifici di GSC e la loro interazione con le cellule endoteliali vascolari nelle prime fasi di iniziazione tumorale mancano. Questi germi di pensiero sono fondamentali per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per il glioma, e avrà grandi implicazioni per la prevenzione delle recidive nei pazienti con glioma. Qui abbiamo adattato le porte procedura cranica finestra 16 e in vivo a due fotoni microscopia per permettere la visualizzazione di iniziazione del tumore dalle cellule GBM iniettate nel cervello di un topo vivo. La nostra tecnica aprirà la strada per futuri sforzi per chiarire i principali meccanismi di segnalazione tra GSC e cellule endoteliali vascolari durante l&#39;iniziazione glioma.

Grazie alla combinazione di un lucido e rafforzata sottile cranio (porte) cranica finestra e il glioblastoma (GBM) l&#39;iniezione di cellule, possiamo osservare l&#39;inizio glioma e la crescita di cellule di GBM iniettate nel cervello di un topo vivo longitudinalmente.

Imaging Glioma Iniziazione<em&gt; In Vivo</em&gt; Attraverso un lucido e sottile rinforzato cranio finestra craniale

Il glioma è una delle forme più letali di cancro umano. La terapia per il glioma più efficace ad oggi — l'intervento chirurgico seguito dal trattamento radioterapico — offre ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare le fasi iniziali dell'insorgenza del glioma a partire da singole cellule di glioblastoma iniettate in vivo. Questo risultato si ottiene innanzitutto assottigliando un'area del cranio del topo fino a uno spessore adatto per l'immagine in vivo. Successivamente, l'area assottigliata del cranio viene lucidata.Quindi, cellule di glioblastoma marcate con GFP vengono iniettate nel cervello del topo e la finestra cranica viene sigillata per l'immagine in vivo. Infine, le cellule di glioblastoma iniettate vengono osservate quotidianamente per visualizzare l'insorgenza del glioma a partire dalle cellule di glioblastoma iniettate, direttamente in vivo. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano l'insorgenza in vivo del glioma a seguito di una singola iniezione di cellule di glioblastoma e la sua relazione con le cellule endoteliali vascolari mediante microscopia a due fotoni in vivo a doppio colore.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle cellule staminali tumorali, come il ruolo cruciale dell'interazione tra cellule staminali del glioma e cellule endoteliali vascolari, nonché l'insorgenza del glioma in vivo, dimostrando che la procedura sarà eseguita sotto la supervisione del responsabile chirurgico JAK Surgical Services e postale nel mio laboratorio. Per prepararsi all'intervento chirurgico in un autoclave, sterilizzare a vapore tutti gli strumenti chirurgici, inclusa la punta del trapano dentale, dopo aver anestetizzato il topo con chetamina e xilazina e aver somministrato un analgesico. Verificare il livello di anestesia effettuando una compressione del dito del piede utilizzando un piccolo rasoio elettrico. Rimuovere il pelo dalla regione dorsale della testa in un'area approssimativamente triangolare, di circa tre millimetri, adiacente alle narici ed estesa lateralmente fino alle vertebre cervicali.Applicare un unguento oftalmico agli occhi. Posizionare il topo in decubito ventrale e utilizzare iodio chirurgico seguito da etanolo al 70%. Per disinfettare la cute, posizionare l'animale su un tampone di cotone e trasferirlo su un tappetino riscaldante.Per mantenere una temperatura corporea di circa 37 gradi Celsius, applicare un analgesico topico sul periostio e sui tessuti esposti della ferita. Utilizzando una lama di bisturi, rimuovere il periostio raschiando delicatamente il cranio. Questo favorirà l'adesione della colla di cianoacrilato all'osso.Successivamente, utilizzare un pennarello per delineare l'area corticale di interesse, avendo cura di evitare le linee di sutura per non danneggiare i vasi sanguigni sottostanti di grandi dimensioni. Applicare quindi uno strato sottile di adesivo a base di cianoacrilato sui margini della ferita per prevenire la fuoriuscita di liquido sierosanguinolento e sul cranio, tranne che nell'area di interesse, prima di sigillare il cranio con cemento dentale attivato dalla luce; trattare tutta la superficie esposta del cranio, eccetto l'area destinata all'assottigliamento, con primer e successivamente con agente adesivo. Una volta che l'agente adesivo si è asciugato, ricoprire il cranio con cemento dentale per stabilizzare la testa del topo.Per l'intervento chirurgico e l'acquisizione di immagini, incassare un dado esagonale di dimensione doppio zero trattino 90 in resina nei pressi della zona da assottigliare. Al termine della preparazione della resina, utilizzare luce visibile per polimerizzarla. Successivamente, utilizzando una vite di dimensione zero zero trattino 90, fissare il supporto del pezzo cranico del dispositivo stereotassico al dado esagonale.Successivamente, posizionare la testa del mouse sotto un microscopio stereoscopico e applicare una goccia di soluzione salina sterile allo 0,9% a temperatura ambiente sulla zona del cranio da assottigliare. Utilizzare un microtrapano ad alta velocità per assottigliare una zona circolare del cranio sovrastante una regione di interesse. Per evitare lesioni termiche al tessuto cerebrale sottostante, interrompere periodicamente la perforazione e applicare soluzione salina.Il cranio del mouse è composto da due strati sottili di osso compatto, tra i quali si trova uno strato spesso di osso spugnoso. Utilizzare il trapano per rimuovere lo strato sottile superiore e la maggior parte dell'osso spugnoso. Una volta che la maggior parte dell'osso spugnoso è stata rimossa, le cavità residue all'interno dell'osso spugnoso possono essere osservate al microscopio stereoscopico, indicando che la perforazione si sta avvicinando allo strato interno di osso compatto.A questo stadio, lo spessore del cranio dovrebbe essere ancora superiore a 50 micron. Continuare con attenzione l'assottigliamento del cranio per ottenere una preparazione molto sottile e liscia. Per assottigliare ulteriormente il cranio, utilizzare una frusta in silicone su misura e pasta di diamante per lucidarlo per circa 10 minuti.Continuare a lucidare il cranio con ossido di stagno a grana fine per ulteriori 10 minuti. Utilizzare soluzione salina per rimuovere l'ossido di stagno finché la calotta cranica sottile non appare pulita. Per eseguire un'iniezione, utilizzare un ago da siringa calibro 26 per creare un piccolo foro su un lato della finestra lucidata sotto il microscopio.Utilizzare il micromanipolatore per abbassare la punta della pipetta attraverso il foro nella finestra cranica e all'interno del cervello, fino a una profondità di 100-200 micron. Quindi iniettare un microlitro di sospensione cellulare a una velocità di 0,1 microlitri al minuto.Dopo aver rimosso l'ago per sigillare la finestra cranica, asciugare l'osso e applicare una piccola goccia di colla cianoacrilica trasparente e un pezzo di coprioggetto da tre millimetri, numero uno. Utilizzare la colla cianoacrilica per sigillare lo spazio tra il coprioggetto e il cemento dentale adiacente.Dopo l'intervento chirurgico, iniettare nel topo una millilitro di soluzione salina sterile e tiepida per via sottocutanea e fornire calore supplementare per mantenere la temperatura corporea fino al completo risveglio dall'anestesia. Somministrare iniezioni sottocutanee di analgesico una volta al giorno per cinque giorni dopo l'intervento e osservare il topo quotidianamente per accertarsi che la ferita stia guarendo correttamente e che l'animale stia mangiando, bevendo e comportandosi normalmente prima dell'imaging. Dopo aver anestetizzato il topo con chetamina e xilazina, immobilizzarlo utilizzando un telaio stereotassico personalizzato sotto il microscopio.Un intervento di finestra cranica con porti di successo permette alla finestra cranica di rimanere trasparente per settimane o mesi. Questa figura mostra la vascolarizzazione tra la finestra cranica di un porto, visualizzata mediante luce retrodiffusa. Queste immagini della vascolarizzazione sono state utilizzate come punti di riferimento per localizzare le stesse aree cerebrali durante ripetute sessioni di imaging.Per visualizzare sia le cellule endoteliali vascolari che le cellule GBM, sono stati generati topi con cellule endoteliali vascolari marcate con la proteina fluorescente rossa TD-tomato. Dopo la procedura di craniotomia del porto, le cellule GBM marcate con GFP sono state iniettate nei loro cervelli ed è stata eseguita un'immagine in vivo a due fotoni. Qui viene mostrato un esempio in vivo di iniziazione del glioma da cellule GBM iniettate vicino alla vascolarizzazione.Questa figura mostra la colorazione per GFAP di sezioni corticali di un topo senza intervento chirurgico, di un topo a sette giorni dall'intervento chirurgico per l'inserimento del port, e di un topo a sette giorni dall'intervento chirurgico per l'inserimento del port con iniezione di soluzione fisiologica. Dalle immagini risulta evidente che il topo senza intervento chirurgico e il topo sottoposto all'intervento chirurgico per l'inserimento del port non presentano gliosi. Al contrario, dopo l'iniezione di soluzione fisiologica, si osserva gliosi nel tessuto cerebrale del topo a causa della penetrazione della pipetta e dell'iniezione di soluzione fisiologica nel cervello.Questo risultato dimostra che la gliosi non si verifica sotto la finestra cranica del port. Fornisce una validazione indipendente che la finestra cranica del port descritta in questo studio non provoca la gliosi tipicamente associata a una finestra cranica cronica con apertura del cranio. Qui, sono mostrate immagini ad alta risoluzione di spine dendritiche dello stesso topo nel giorno dell'intervento chirurgico, giorno zero, e a 32 giorni dalla creazione della finestra del port.Dimostrare che la finestra del porto è anche un'ottima scelta per l'acquisizione di immagini in vivo ad alta risoluzione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come acquisire immagini dell'insorgenza del glioma iniettando cellule di glioblastoma attraverso una finestra cranica lucidata e rinforzata.

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