Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo

L'obiettivo generale dell'esperimento dimostrato in questo video è valutare se il peptide antimicrobico liina svolge un ruolo nel miglioramento della colite indotta da destrano solfato nei topi. Ciò si ottiene iniettando il midollo osseo di topi wild type in topi leciti e knockout irradiati e il midollo osseo di topi knockout in topi wild type irradiati. Il midollo osseo trapiantato genererà nuove cellule del sangue nel ricevente del genotipo del donatore.

I topi riceventi vengono quindi esposti al destrano solfato per indurre la colite dopo quattro settimane. Il successo del trapianto è convalidato dalla citometria a flusso e il danno tissutale del colon è valutato dall'istologia. Si ottengono risultati che mostrano che la colite è migliorata quando il midollo osseo wild type viene trapiantato in topi knockout.

Al contrario, la colite peggiora quando il midollo osseo knockout viene trapiantato in topi wild type. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel determinare le espressioni geniche da cellule derivate dal midollo osseo o da cellule non derivate dal midollo osseo nell'infiammazione o nell'infezione. Per questo esperimento si raccomandano i topi C 57, black six, wild type e C elicited knockout per rendere possibile il monitoraggio dei topi wild type e dei topi knockout.

Cellule del donatore dopo il trapianto di midollo osseo. Usa i mouse CD 45.1 per rappresentare i topi wild type e il CD 45.2 per i topi knockout. Il grafico mostrato qui descrive la configurazione sperimentale che vengono assegnati a ciascun gruppo cinque topi donatori e 10 topi riceventi.

Per i gruppi A e B, il midollo osseo sarà trapiantato dai topi wild type ai topi knockout. La colite sarà indotta nel gruppo A, ma non nel gruppo B.Per il gruppo C e D.Il midollo osseo sarà trapiantato dai topi knockout al wild type e la colite sarà indotta nel gruppo C solo per E e F.Il trapianto sarà da wild type a wild type e per i gruppi G e H, Il trapianto sarà da knockout a knockout. Per preparare il midollo osseo del donatore per il trasferimento ai topi irradiati, iniziare estraendo il midollo osseo dalle ossa dei topi sacrificati in una cabina di biosicurezza.

Utilizzare strumenti di dissezione sterili per esporre le ossa dell'omero, del femore, della tibia e del perone libere da muscoli e legamenti e trasferirli in una capsula di Petri. Taglia entrambe le estremità delle ossa per mostrare il midollo osseo rosso. Quindi afferrare una delle ossa con una pinza.

Sciacquare il midollo osseo rosso con PBS freddo con una siringa da tre millilitri e aghi da 25 gauge in un'altra capsula di Petri. Quindi sciacquare l'osso dall'altra estremità per produrre più cellule del midollo osseo. Ripeti questo processo con ciascuna delle ossa.

Raccogli il midollo osseo di tipo selvatico e metti fuori combattimento i topi separatamente. Utilizzare una siringa da sei millilitri con un ago da 18 gauge da mezzo pollice per rompere i tappi rossi del midollo osseo mediante aspirazione ed espulsione ripetute. Quindi utilizzare una pipetta sierologica per trasferire il midollo osseo raccolto in una provetta conica da 50 millilitri.

Una volta che tutto il midollo osseo è stato trasferito, centrifugare il midollo osseo a 740 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, scartare il surnatante e risospendere il pellet vorticando per cinque-10 secondi. Al pellet, aggiungere nuovamente cinque millilitri di un tampone di lisi XRBC per vortice di topo donatore per cinque secondi e incubare per esattamente tre minuti a temperatura ambiente.

Dopo tre minuti, aggiungere 20 millilitri di PBS freddo a ciascuna provetta e mescolare per inversione per fermare la lisi. Quindi versare il contenuto attraverso un colino cellulare da 40 micron in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Sciacquare la provetta originale con cinque millilitri di PBS e trasferire la soluzione nel filtro cellulare.

Continuando a raccogliere il flusso attraverso il tubo conico. Quindi portare il volume fino a 50 millilitri con PBS e mescolare per inversione. Successivamente, determinare la conta delle cellule vitali mediante esclusione del trian blue utilizzando un emocitometro.

Una volta determinata la conta cellulare, centrifugare le cellule del midollo osseo a 913 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante in base alla conta totale delle cellule. Resus sospendere il pellet in PBS a una volta da 10 all'ottavo di cellule per millilitro.

Le cellule del midollo osseo sono ora pronte per il trasferimento in topi riceventi irradiati. I topi riceventi wild type e knockout per questo esperimento sono stati irradiati con 1000 rad come descritto nel documento di accompagnamento, i topi sono allevati e alloggiati in una struttura priva di agenti patogeni da quattro a 24 ore dopo l'irradiazione ha riscaldato i topi riceventi su un termoforo sotto una lampada riscaldante per iniettare il midollo osseo del donatore. Posizionare un topo ricevente nel sistema di contenzione, pulire la coda con etanolo al 70% per sterilizzare il sito di iniezione e promuovere la vasodilatazione locale per facilitare l'iniezione.

Utilizzando una siringa da insulina con un ago calibro 28 e mezzo, iniettare una volta da 10 a 200 microlitri nella vena caudale di ciascun topo dopo l'iniezione. Metti il topo in una gabbia con un massimo di altri tre topi iniettati per le prime quattro settimane dopo l'iniezione. Mantenere i topi riceventi iniettati in gabbie autoclavi con acqua contenente l'antibiotico sulfamidico trim.

Ciò consente agli animali di riacquistare l'immunità, cambiare le gabbie, l'acqua e il cibo trattati con antibiotici ogni quattro giorni per mantenere l'igiene. Quattro settimane dopo l'irradiazione e il trapianto di midollo osseo, passare all'acqua normale senza antibiotici e mantenere i topi per altre due settimane per ritrovare la loro normale microflora intestinale. Sei settimane dopo l'iniezione del midollo osseo, misurare il peso corporeo iniziale per indurre la colite.

Somministrare ai topi del gruppo sperimentale per la colite il 5% di destrano solfato nell'acqua potabile. Cinque giorni dopo, raccogliere il sangue periferico di quattro topi in un tubo rivestito di eparina vacutainer e metterlo sul ghiaccio. Quindi, in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri, unire 300 microlitri di sangue con 300 microlitri di colorazione cellulare, tamponare e aliquotare il sangue in cinque provette per citometria a flusso etichettate da una a cinque ciascuna con 100 microlitri di ghiaccio.

Dopo aver sacrificato i topi, misura nuovamente il peso corporeo e calcola il resto. Sezionare i tessuti del colon e stimolarli in formalina per la colorazione h e d. Quindi ottenere le cellule del midollo osseo come prima.

Dividere il midollo osseo risospeso in cinque provette da centrifuga etichettate da una a cinque ciascuna con 100 millilitri. In preparazione per l'analisi mediante citometria a flusso, preparare la miscela di anticorpi per ciascuna rispettiva provetta al buio come descritto nel documento di accompagnamento, i campioni di sangue e midollo osseo etichettati come numero uno serviranno come controlli e non saranno campioni di sangue e midollo osseo macchiati. Il numero due etichettato sarà colorato con il controllo dell'isotipo fitzy, il controllo dell'isotipo PE e la soluzione bloccante CD 16 slash 32.

Questi controlli isotipici vengono utilizzati per confermare la specificità dei campioni di legame degli anticorpi primari. L'etichetta numero tre sarà macchiata con FZ CD 45.1 e CD 16 slash 32. I campioni di soluzione bloccante etichettati con il numero quattro saranno colorati con CD 45.2 e CD 16 slash 32.

Soluzione bloccante. L'etichettatura monocolore può rivelare la presenza di cellule del donatore o del ricevente nel sangue o nel midollo osseo. Chiaramente i campioni etichettati con il numero cinque saranno colorati per CD 45.1, CD 45.2 e CD 16 slash 32.

Bloccando qui, l'etichettatura a due colori mostra il rapporto relativo tra le cellule del donatore e del ricevente nel sangue o nel midollo osseo. Aggiungere cinque microlitri di miscela di anticorpi due e cinque alle rispettive provette del campione. Quindi aggiungere tre microlitri di miscela di anticorpi tre e quattro alle rispettive provette del campione.

Incubare tutte le provette con ghiaccio per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere due millilitri, un tampone di lisi XRBC a ciascuna provetta. Quindi incubare i campioni per altri 15 minuti su ghiaccio al buio.

Far girare le celle a 350 volte G, cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante, risospendere il pellet con 500 microlitri di tampone per la colorazione delle cellule al buio. Quindi vortice brevemente.

Successivamente, eseguire la citometria a flusso sui campioni di sangue e midollo osseo con colorazione immunologica. Selezionare FZ per rappresentare il tipo selvaggio CD 45.1 e PE per rappresentare il CD 45.2 knockout. Analizza i risultati della citometria a flusso utilizzando il software di Flo Joe.

Calcolare il rapporto tra fit E e PE o PE per determinare se il genotipo del donatore è dominante nel sangue e nel midollo osseo. Questa immagine mostra le immagini h ed e campione di colon con istologia normale e colite DSS. Le immagini istologiche vengono valutate in base al danno tissutale della mucosa e all'infiltrazione dei neutrofili nei tessuti mucosi e sottomucosi.

Pertanto, un punteggio istologico più alto indica una colite più grave per verificare se la liina svolge un ruolo nella prevenzione della colite. Il midollo osseo è stato scambiato tra topi wild type e knockout come descritto in questo video. L'istologia è stata quindi valutata e valutata come mostrato qui.

I punteggi istologici sono stati significativamente aumentati quando il midollo osseo di topo knockout è stato introdotto in topi wild type irradiati. Al contrario, i punteggi sono diminuiti significativamente quando il midollo osseo wild type è stato introdotto nei topi knockout. Questi dati indicano che il C endogeno proveniente da cellule derivate dal midollo osseo ha effetti antinfiammatori e migliora la colite per verificare che il trapianto abbia avuto successo in questi topi.

citometria a flusso è stata eseguita anche sul midollo osseo e sul sangue dei topi dopo il trapianto. Il midollo osseo di tipo selvaggio colora fortemente per Fitz CD 45.1 ma non per PE, CD 45.2 come mostrato qui, il midollo osseo knockout colora fortemente per PE ma non Fitz come mostrato qui. Dopo il trapianto, tuttavia, sia il midollo osseo che il sangue di topi wild type che hanno ricevuto il midollo osseo knockout sono stati colorati fortemente per l'EP ma non per Fitz, indicando che la popolazione predominante di cellule colorate proveniva dal donatore.

Allo stesso modo, il midollo osseo e il sangue di topi knockout che hanno ricevuto midollo osseo wild type sono colorati fortemente per fitzy ma non pe, confermando ancora una volta che le popolazioni colorate predominanti erano di origine donatrice. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di eseguire l'esperimento di trapianto di midollo osseo e dovresti essere in grado di modificare la colite tramite cellule derivate dal midollo osseo.