Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo

L'obiettivo generale dell'esperimento illustrato in questo video è valutare se il peptide antimicrobico lyin svolge un ruolo nel miglioramento della colite indotta da sodio dextran solfato nei topi. Questo viene ottenuto iniettando il midollo osseo di topi wild type in topi licit e knockout irradiati e il midollo osseo di topi knockout in topi wild type irradiati. Il midollo osseo trapiantato genererà nuove cellule sanguigne nel ricevente, portando il genotipo del donatore.

I topi riceventi vengono quindi esposti al dextran solfato per indurre colite dopo quattro settimane. Il successo del trapianto viene confermato mediante citometria a flusso e il danno tessutale del colon viene valutato mediante istologia. I risultati ottenuti mostrano che la colite migliora quando il midollo osseo di tipo selvatico viene trapiantato in topi knockout.

Al contrario, la colite peggiora quando il midollo osseo knockout viene trapiantato in topi di tipo selvaggio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali per determinare le espressioni geniche provenienti da cellule derivate dal midollo osseo o da cellule non derivate dal midollo osseo in caso di infiammazione o infezione. Si raccomandano topi C57, black six, di tipo selvaggio e topi knockout C elicited per questo esperimento, in modo da poter tracciare i topi di tipo selvaggio e i topi knockout.

Cellule donatrici dopo il trapianto di midollo osseo. Utilizzare topi CD45.1 per rappresentare i topi di tipo selvaggio e CD45.2 per i topi knock-out. Il grafico mostrato qui descrive l'allestimento sperimentale: cinque topi donatori e dieci topi riceventi vengono assegnati a ciascun gruppo.

Per i gruppi A e B, il midollo osseo verrà trapiantato da topi di tipo selvaggio a topi knockout. La colite verrà indotta nel gruppo A, ma non nel gruppo B. Per i gruppi C e D, il midollo osseo verrà trapiantato da topi knockout a topi di tipo selvaggio, e la colite verrà indotta solo nel gruppo C. Per i gruppi E e F, il trapianto avverrà da tipo selvaggio a tipo selvaggio; per i gruppi G e H, il trapianto avverrà da knockout a knockout. Per preparare il midollo osseo del donatore da trasferire nei topi irradiati, iniziare estraendo il midollo osseo dalle ossa di topi sacrificati all'interno di una cappa a sicurezza biologica.

Utilizzare strumenti di dissezione sterili per esporre le ossa dell'omero, del femore, della tibia e della fibula, liberandole dai muscoli e dai legamenti ad esse collegati, e trasferirle in una piastra di Petri. Tagliare entrambe le estremità delle ossa per evidenziare il midollo osseo rosso. Successivamente, afferrare una delle ossa con una pinza.

Aspirare il midollo osseo rosso con PBS freddo utilizzando una siringa da tre millilitri e aghi da 25 gauge in un’altra capsula di Petri. Quindi aspirare l’osso dall’altra estremità per ottenere un maggior numero di cellule midollari. Ripetere questo procedimento per ciascun osso.

Raccogliere separatamente il midollo osseo di topi wild type e di topi knock out. Utilizzare una siringa da sei millilitri con un ago da 18 gauge di mezzo pollice per frammentare i coaguli di midollo osseo rosso mediante ripetute aspirazioni ed espulsioni. Successivamente, utilizzare una pipetta sierologica per trasferire il midollo osseo raccolto in un tubo conico da 50 millilitri.

Dopo aver trasferito tutto il midollo osseo, centrifugare il campione a 740 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet agitando vorticosamente per cinque-dieci secondi. Aggiungere al pellet cinque millilitri di buffer di lisi XRBC uno per topo donatore, vorticare nuovamente per cinque secondi e incubare esattamente per tre minuti a temperatura ambiente.

Dopo tre minuti, aggiungere 20 millilitri di PBS freddo in ogni tubo e mescolare per inversione per arrestare la lisi. Quindi versare il contenuto attraverso un filtro cellulare da 40 micron in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Risciacquare il tubo originale con cinque millilitri di PBS e trasferire la soluzione nel filtro cellulare.

Continuare a raccogliere il flusso in provetta conica. Quindi portare il volume a 50 millilitri con PBS e mescolare per inversione. Successivamente, determinare il numero di cellule vitali mediante esclusione del blu di tripano utilizzando un emocitometro.

Dopo aver determinato il numero di cellule, centrifugare le cellule del midollo osseo a 913 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, rimuovere il soprannatante in base al numero totale di cellule. Risospendere il pellet in PBS a una concentrazione di 1 × 10⁸ cellule per millilitro.

Le cellule del midollo osseo sono ora pronte per essere trasferite nei topi riceventi irradiati. I topi riceventi di tipo selvaggio e knockout per questo esperimento sono stati irradiati con 1000 rad come descritto nel documento allegato; i topi vengono allevati e ospitati in un impianto privo di patogeni. Da quattro a ventiquattro ore dopo l'irradiazione, riscaldare i topi riceventi su un tappetino riscaldante sotto una lampada riscaldante per facilitare l'iniezione del midollo osseo del donatore. Posizionare un topo ricevente nel contenitore di immobilizzazione, pulire la coda con etanolo al 70% per sterilizzare il sito di iniezione e promuovere la vasodilatazione locale, facilitando così l'iniezione.

Utilizzando una siringa per insulina con un ago da 28 e mezzo, iniettare una volta 10 alla settima cellule in un volume da 1 a 200 microlitri nella vena della coda di ciascun topo subito dopo l'iniezione. Posizionare il topo in una gabbia insieme ad altri tre topi al massimo che sono stati iniettati, per le prime quattro settimane successive all'iniezione. Mantenere i topi riceventi iniettati in gabbie sterili ottenute con autoclave, con acqua contenente l'antibiotico sulfametossazolo-trimetoprim.

Questo permette tempo agli animali per recuperare l'immunità, cambiare le gabbie e fornire acqua e cibo trattati con antibiotici ogni quattro giorni per mantenere l'igiene. Quattro settimane dopo l'irradiazione e il trapianto di midollo osseo, passare ad acqua normale senza antibiotici e mantenere i topi per altre due settimane al fine di ripristinare la normale microflora intestinale. Sei settimane dopo l'iniezione di midollo osseo, misurare il peso corporeo iniziale per indurre la colite.

Somministrare ai topi del gruppo sperimentale di colite il 5% di dextran solfato nell'acqua da bere. Cinque giorni dopo, raccogliere il sangue periferico di quattro topi in provette vuotainer rivestite con eparina e porle sul ghiaccio. Successivamente, in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri, mescolare 300 microlitri di sangue con 300 microlitri di buffer per la colorazione cellulare e suddividere il sangue in cinque provette per citometria a flusso, etichettate da uno a cinque, ciascuna con 100 microlitri, mantenendole sul ghiaccio.

Dopo l'eutanasia dei topi, misurare nuovamente il peso corporeo e calcolare la variazione. Dissezionare i tessuti del colon e porli in formalina per la colorazione h e d. Quindi ottenere le cellule del midollo osseo come in precedenza.

Dividere il midollo osseo risospeso in cinque provette microcentrifughe etichettate da uno a cinque, ciascuna con 100 millilitri. In previsione dell'analisi mediante citometria a flusso, preparare la miscela di anticorpi per ciascuna provetta in modo separato e al buio, come descritto nel documento allegato; i campioni di sangue e midollo osseo etichettati con il numero uno fungeranno da controlli e non verranno colorati. I campioni di sangue e midollo osseo etichettati con il numero due verranno colorati con il controllo isotipico FITC, il controllo isotipico PE e la soluzione bloccante CD16/32.

Questi controlli di isotipo vengono utilizzati per confermare la specificità del legame dell'anticorpo primario ai campioni. Il campione contrassegnato con il numero tre verrà colorato con FZ CD 45.1 e CD 16/32. I campioni con soluzione di blocco contrassegnati con il numero quattro verranno colorati con CD 45.2 e CD 16/32.

Soluzione di bloccaggio. L'etichettatura monocromatica può rivelare la presenza di cellule donatrici o riceventi nel sangue o nel midollo osseo. Chiaramente, i campioni contrassegnati con il numero cinque verranno colorati per CD 45.1, CD 45.2 e CD 16/32.

L'analisi con marcatura a due colori mostra qui il rapporto relativo tra cellule donatrici e riceventi nel sangue o nel midollo osseo. Aggiungere cinque microlitri della miscela di anticorpi due e cinque ai rispettivi tubi del campione. Quindi aggiungere tre microlitri della miscela di anticorpi tre e quattro ai rispettivi tubi del campione.

Incubare tutti i tubi sul ghiaccio per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere due millilitri di buffer di lisi per XRBC a ogni tubo. Successivamente, incubare i campioni per altri 15 minuti sul ghiaccio al buio.

Centrifugare le cellule a 350 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone per la colorazione cellulare al buio. Quindi vortexare brevemente.

Successivamente, eseguire la citometria a flusso sui campioni di sangue e di midollo osseo immuno marcato. Selezionare FZ per rappresentare l'allele selvaggio CD 45.1 e PE per rappresentare l'allele knockout CD 45.2. Analizzare i risultati della citometria a flusso utilizzando il software di Flo Joe.

Calcola il rapporto tra fit E e rapporto PE oppure tra PE e rapporto fit e per determinare se il genotipo del donatore è un genotipo dominante nel sangue e nel midollo osseo. Questa immagine mostra esempi di immagini ematossilina ed eosina (h e e) di colon con istologia normale e colite da DSS. Le immagini istologiche vengono valutate in base al danno del tessuto mucosale e all'infiltrazione di neutrofili nei tessuti mucosali e sottomucosali.

Pertanto, un punteggio istologico più alto indica una colite più grave, al fine di verificare se lyin svolge un ruolo nella prevenzione della colite. Il midollo osseo è stato scambiato tra topi di tipo selvaggio e topi knockout come descritto in questo video. L'istologia è stata quindi valutata e punteggiata come mostrato qui.

I punteggi istologici sono aumentati in modo significativo quando il midollo osseo di topi knockout è stato introdotto in topi selvatici irradiati. Al contrario, i punteggi sono diminuiti in modo significativo quando il midollo osseo di topi selvatici è stato introdotto in topi knockout. Questi dati indicano che la proteina C endogena derivante da cellule del midollo osseo ha effetti antinfiammatori e attenua la colite, confermando che il trapianto è stato eseguito con successo in questi topi.

È stata inoltre eseguita la citometria a flusso su midollo osseo e sangue dei topi dopo il trapianto. Il midollo osseo di tipo selvaggio mostra una marcatura intensa per Fitz CD 45.1 ma non per pe, CD 45.2 come mostrato qui; il midollo osseo knockout mostra una marcatura intensa per PE ma non per Fitz come mostrato qui. Tuttavia, dopo il trapianto, sia il midollo osseo che il sangue di topi di tipo selvaggio che avevano ricevuto midollo osseo knockout risultavano marcati intensamente per PE ma non per Fitz, indicando che la popolazione predominante di cellule marcate proveniva dal donatore.

Analogamente, il midollo osseo e il sangue provenienti da topi knock-out che avevano ricevuto midollo osseo di tipo selvaggio mostravano una marcatura intensa per fitzy ma non per pe, confermando nuovamente che le popolazioni marcate prevalentemente erano di origine donatrice. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di eseguire un esperimento di trapianto di midollo osseo e di modificare la colite mediante cellule derivate dal midollo osseo.