Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere

L'obiettivo di questa procedura è monitorare in che modo la proteolisi della ciclina B regola l'inizio dell'anafase e l'uscita dalla mitosi. Questo viene ottenuto innanzitutto seminando cellule con reporter rapido della ciclina B su vetrini per microscopia. Il secondo passaggio consiste nell'etichettare la molecola chimera del reporter rapido della ciclina B con il substrato fluorescente TMR star.

Successivamente, le serie di immagini vengono acquisite presso una stazione microscopica. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare le cellule e nel calcolare nel tempo l'intensità della fluorescenza di TMR star, che riflette la proteolisi della ciclina B. In definitiva, la microscopia a immunofluorescenza di cellule reporter vive rivela la cinetica della proteolisi della ciclina B che avviene durante la mitosi.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il monitoraggio del BGFP ciclonico, è che il SNAP ciclonico B consente il monitoraggio del degrado del ciclonico B anziché dell'espressione dell'intera proteina. Per questo esperimento, alle cellule reporter SNAP viene inizialmente consentito di crescere in modo asincrono in fase logaritmica per almeno 48 ore. Per iniziare, la procedura per la semina della tripsina prevede l'uso di cellule reporter SNAP subconfluenti da seminare in camere microscopiche a otto pozzetti, garantendo una distribuzione costante su tutta la superficie della camera centrifuga.

10.000 cellule e Resus vengono sospesi in 350 microlitri di un mezzo di crescita normale privo di rosso fenolo. Trasferire la sospensione cellulare nella camera del microscopio per la semina delle cellule in camere microscopiche a otto pozzetti, con densità cellulare massima al centro della camera. Inizialmente, caricare la camera con 300 microlitri di mezzo di crescita normale privo di rosso fenolo.

Successivamente, aggiungere con attenzione 5.000 cellule al centro della camera del microscopio per la semina delle cellule in piastre da 96 pozzetti con ottiche speciali, garantendo una distribuzione costante su tutta la superficie del pozzetto. Centrifugare 5.000 cellule e risospendere in 300 microlitri di mezzo di crescita normale privo di rosso fenolo, in base al numero totale di pozzetti contenenti cellule richiesti. Regolare il numero di cellule e il volume totale del mezzo di sospensione.

Quindi trasferire la sospensione cellulare in una piastra a 96 pozzetti per la semina delle cellule su piastre ottiche speciali a 96 pozzetti con densità cellulare massima al centro del pozzetto. Aggiungere con attenzione 1.500 cellule in 15 microlitri di mezzo di crescita normale privo di rosso fenolo sotto forma di una piccola goccia al centro di ogni pozzetto.

Questo limiterà la crescita cellulare al centro del pozzetto. Lasciare crescere tutte le cellule seminate per almeno 18 ore in condizioni standard di coltura cellulare, 30 minuti prima dell'inizio della procedura di colorazione. Riscaldare le porzioni di mezzo di crescita normale senza rosso fenolo a 37 gradi Celsius.

Il substrato "snap" in questa dimostrazione è TMR star per una facile manipolazione; sciogliere TMR star in DMSO per ottenere una soluzione madre con una concentrazione di 400 micromolare; diluire 0,5 microlitri della soluzione madre di TMR star in 200 microlitri di mezzo di crescita normale senza fenolo rosso e riscaldato per ottenere una concentrazione finale di marcatura di un micromolare. Successivamente, rimuovere il mezzo di crescita normale dalle cellule in crescita asincrona e sostituirlo con il mezzo di marcatura; incubare le cellule nel mezzo di marcatura per 25 minuti in condizioni di coltura standard.

Dopo 25 minuti, rimuovere il mezzo di marcatura e lavare le cellule quattro volte con mezzo di crescita normale privo di rosso fenolo e tiepido. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare le cellule in 300 microlitri di mezzo di crescita normale privo di rosso fenolo e tiepido per 30 minuti prima di trasportarle al microscopio. Sostituire il mezzo con mezzo di crescita normale fresco, privo di rosso fenolo e tiepido, per rimuovere il substrato snaps non legato; trasportare le cellule al microscopio in una scatola di polistirolo su un blocco riscaldante preriscaldato a 37 gradi Celsius.

Per ridurre al minimo le variazioni di temperatura, due ore prima della misurazione dell'intensità di fluorescenza regolare la temperatura dell'aria nella camera climatica a 37 gradi Celsius in modalità asciutta, in modo da portare il microscopio e tutti i suoi componenti alla temperatura desiderata. Per evitare la condensa e i conseguenti danni al microscopio, è importante preriscaldare il sistema prima di impostare l'umidità.

Quando l'intero sistema del microscopio ha raggiunto i 37 gradi Celsius, regolare l'umidità dell'aria al 60% e l'anidride carbonica al 5%. Avviare il software di scansione o acquisizione e definire le impostazioni standard. Definire le posizioni delle pozzette da analizzare. Impostare il delta T o il tempo del ciclo di acquisizione e il numero assoluto di cicli di acquisizione.

In questa dimostrazione, l'autofocus hardware è preselezionato per l'analisi di un numero maggiore di pozzetti. Avviare l'acquisizione e supervisionare i primi due cicli di acquisizione.

Il microscopio si focalizzerà sul segnale GFP dell'istone H two, acquisendo successivamente un'immagine iniziale in quel canale, prima che il filtro venga cambiato e venga acquisita l'immagine corrispondente con TMR star. Questa procedura viene ripetuta per tutte le posizioni all'interno di una pozzetta e per ciascuna delle pozzette da esaminare, prima di passare al ciclo successivo. Per analizzare i profili proteolitici, avviare il software di analisi Scan R.

Analizzare le immagini con i nuclei cellulari visualizzati mediante istone H2 GFP, definiti come oggetto principale utilizzando una soglia basata sull'intensità del segnale e un algoritmo watershed per facilitare la separazione delle cellule adiacenti. Deve essere creato un sottoggetto costituito dal nucleo con citoplasma per l'analisi di TMR star. Le proprietà importanti dell'oggetto principale sono le posizioni X e Y, il tempo e le intensità massime e medie di GFP per l'oggetto principale e l'intensità totale divisa per l'area.

Per il sottoggetto stella TMR, passare alla modalità traccia per visualizzare l'intensità media della fluorescenza della stella TMR nel tempo o le tracce cellulari assegnate ai principali oggetti analizzati. L'analisi di un numero elevato di cellule consente una prima visione rappresentativa e oggettiva, ma il numero di cellule da esaminare può essere ridotto selezionando solo quelle misurazioni che durano almeno 140 cicli e presentano un'intensità massima elevata della GFP dell'istone H due. Selezionare una traccia cellulare di interesse per visualizzare simultaneamente, a livello singola cellula, la fluorescenza della GFP dell'istone H due e della stella TMR.

Utilizzando il pulsante destro del mouse, fare clic su una cella di interesse e generare un'immagine esportabile. Galleria per l'illustrazione di istone H due GFP e ciclina B snap TMR star per ogni singolo punto temporale. Passare alla modalità popolazione del software di analisi dello scanner e delimitare la regione in cui la cella di interesse è rappresentata sul dot blot.

Applicare una nuova finestra di grafico a dispersione alla regione selezionata e visualizzare l'intensità media della fluorescenza di TMR star nel tempo. Esportare i dati in Microsoft Excel per ulteriori calcoli. Le figure qui mostrano la cinetica della ciclina B rappresentata da una curva di intensità della fluorescenza di TMR star di una cellula che procede attraverso una mitosi regolare, senza segni di allineamento cromosomico errato al momento della compattazione del citoplasma successiva alla rottura dell'involucro nucleare o NEBD, come indicato dal triangolo rosso. L'intensità della fluorescenza di TMR staph mostra un aumento brusco fino al raggiungimento della finestra isomorfica.

Quando la cellula entra in prometafase, l'intensità della fluorescenza rimane a un livello stabile finché la cellula procede attraverso profase e metafase, per poi iniziare a diminuire rapidamente. Una volta che tutti i cromosomi hanno formato una piastra di metafase stabile, questa diminuzione precede la separazione dei cromosomi. Durante l'anafase, indicata dal punto blu sulla curva in tarda mitosi, la cromatina inizia a decondensarsi e la cellula assume la morfologia della fase finale.

Mentre la curva dell'intensità di fluorescenza si avvicina al plateau, che è inferiore al plateau precedente la mitosi dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della mitosi per esplorare l'equilibrio preciso tra ciclina, degradazione e sintesi che regola il progresso mitotico.