Un metodo pratico e innovativo per estrarre il DNA genomico da kit di raccolta del sangue per Plasma Proteina Preservation

Questo video descriverà un metodo pratico e innovativo per estrarre il DNA genomico dal nuovo sistema di conservazione delle proteine plasmatiche BDP 100, noto come provette P 100 TNA. L'estrazione da siero e da provette contenenti plasma è stata un procedimento piuttosto comune in passato, ma la combinazione di questa nuova provetta P 100 e del metodo di estrazione qui presentato offre un approccio innovativo e più semplice per ottenere DNA di qualità superiore con molto meno sforzo. L'interno della provetta P 100 è rivestito con EDTA di potassio e inibitori della proteasi.

Questo impedisce la coagulazione e stabilizza le proteine plasmatiche. Il sangue viene raccolto in questi tubi allo scopo di ottenere il plasma per analisi dopo centrifugazione. Il sangue contenuto in un P 100 si separerà in strati in base alla densità: plasma nella parte superiore, globuli rossi in fondo e globuli bianchi.

Il buffy coat si trova tra questi due strati. Il recupero del plasma è generalmente l'uso principale di questi tubi. Diversi parametri vengono misurati utilizzando questo plasma, come i livelli di anticorpi e di proteine.

Il buffy coat viene generalmente scartato, ma, come mostrato in questo video, contiene quantità sufficienti di DNA per diverse analisi, tra cui sequenziamento, genotipizzazione, identificazione di biomarcatori e così via. I P one hundred sono composti da tre componenti principali: capsula, tubo e separatore. Il separatore meccanico migra appena sopra lo strato del buffy coat.

Per ottenere accesso al buffy coat, è necessario aumentare la distanza tra il separatore e il buffy coat. Questo si ottiene aggiungendo saccarosio al 17%. Normalmente il buffy coat viene scartato insieme al P 102, ma, come mostrato in questo video, è possibile recuperare facilmente una quantità sufficiente di DNA da questo strato per eseguire diverse analisi prima di prelevare i tubi P 100 dal congelatore a meno 80.

Riscaldare in anticipo un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, inserire ogni provetta P 100 nel bagno di acqua calda e incubare per circa cinque minuti per scongelare tutti i campioni. Una volta che tutti i campioni sono completamente scongelati, occorre rimuovere il siero residuo presente al di sopra del separatore. Successivamente, aggiungere 5 millilitri di saccarosio al 17% al di sopra del separatore; dopo l'aggiunta del saccarosio, centrifugare tutte le provette per 20 minuti a 2.500 ×g. Ora che il separatore si trova nella parte superiore della provetta ed è separato dal buffy coat, può essere rimosso facilmente.

Nebulizzare 70% di etanolo su un fazzoletto chimico e sterilizzare un uncino di graffetta pulendo accuratamente tutta la superficie. Tenere il tubo P100 ad un angolo di 45 gradi con l'uncino sterile. Iniziare a estrarre il separatore dal tubo tirando delicatamente sul bordo del separatore e guidandolo all'interno di un sacchetto per rifiuti biologici.

Con il separatore rimosso, eliminare la maggior parte possibile dello strato di saccarosio al 17%, senza disturbare lo strato del buffy coat o quello dei globuli rossi; il buffy coat dovrà ora essere lo strato più superficiale nel tubo. Trasferire questo strato in un nuovo vial conico da 15 millilitri opportunamente etichettato. Il volume di buffy coat prelevato da ogni tubo può variare, ma dovrà essere inferiore a tre millilitri.

Per normalizzare il volume di tutti i tubi, aggiungere quantità sufficiente di PBS (soluzione salina fosfato tampone) per portare il volume di ciascun tubo a tre millilitri. Ora che tutti i buffy coat sono sospesi in un volume uguale, qualsiasi globulo rosso residuo deve essere rimosso aggiungendo nove millilitri di soluzione per la lisi dei globuli rossi (RBC).

Successivamente, capovolgere più volte i tubi durante un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente per separare i globuli rossi lisati dal buffy coat. Centrifugare per cinque minuti a 2.500 G: la centrifugazione crea un pellet dal quale verrà estratto il DNA. Versare questo residuo da ciascun tubo in un contenitore per rifiuti liquidi pericolosi, lasciando un piccolo volume nel quale il pellet verrà risospeso. Vortexare il tubo per staccare e risospendere il pellet.

Aggiungere tre millilitri di soluzione per la lisi cellulare e vortexare vigorosamente per almeno 10 secondi. Dopo la lisi, le proteine e il DNA sono ora sospesi liberamente nella soluzione e devono essere separati; iniziare precipitando le proteine mediante l'aggiunta di un millilitro di soluzione precipitante per le proteine, e VORTEXARE ad alta velocità per almeno 15 secondi. Centrifugare quindi i tubi per cinque minuti a 2.500 ×g per formare il pellet proteico durante questa centrifugazione.

Eseguire il passaggio in modo appropriato. Etichettare un vial conico da 15 millilitri per ciascun campione da elaborare, inserendolo in ogni nuovo tubo. Trasferire tre millilitri di isopropanolo al 100%.

Dopo che le proteine sono state precipitate e centrifugate, ogni provetta dovrebbe presentare un pellet relativamente grande e un sopranatante trasparente e quasi privo di residui. Decantare il sopranatante contenente il DNA da ogni provetta nella corrispondente provetta di isopropanolo preparata durante l'ultima centrifugazione. L'isopropanolo provocherà la precipitazione del DNA in soluzione, formando sottili filamenti bianchi e lanuginosi. Invertire tutte le provette 50 volte per assicurare un'adeguata miscelazione. Successivamente, centrifugare tutte le provette per tre minuti a 2.500 ×g per formare un pellet di DNA, che di solito è visibile come un piccolo aggregato bianco sul fondo della provetta. Tuttavia, un basso rendimento di DNA potrebbe risultare invisibile ad occhio nudo. Proseguire con tutte le estrazioni finché non vengono misurate le concentrazioni.

Indipendentemente dalla presenza di un pellet di DNA, scartare il surnatante di isopropanolo. Lavare il DNA aggiungendo etanolo al 70%. Questo passaggio rimuoverà eventuali componenti residui indesiderati che potrebbero interferire con analisi successive; centrifugare per un minuto a 2.500 ×g. Per assicurarsi che il pellet di DNA sia ben aderente al fondo della provetta, scartare tutto l'etanolo al 70% dalle provette, quindi capovolgere queste ultime su un tovagliolo di carta pulito e lasciare asciugare all'aria per un'ora.

Non dovrebbe rimanere etanolo visibile nei tubi quando si prosegue con il protocollo. L'ultimo passaggio dell'estrazione consiste nel risospendere il DNA in una soluzione. Per la maggior parte delle estrazioni, sono opzioni adeguate sia la soluzione per l'idratazione del DNA che l'acqua.

Aggiungere 250 microlitri di soluzione di idratazione del DNA in meno per campioni che producono poche o nessuna visibile traccia o pellet di DNA; vortexare delicatamente e in modo incrementale il DNA per sospenderlo. Infine, trasferire tutto il DNA sospeso in una provetta da centrifuga. A questo punto, la concentrazione e la purezza del DNA possono essere misurate mediante NanoDrop o un altro spettrofotometro.

In generale, ci si aspetta che la purezza del DNA sia simile a quella del DNA estratto direttamente da sangue intero ottenuto da provette contenenti EDTA di potassio raccolte esclusivamente allo scopo di recuperare DNA. La concentrazione dipende dalla quantità di materiale iniziale, ma può variare da 50 nanogrammi per microlitro a quasi 1000 nanogrammi per microlitro, con una media nell'ordine dei 200 nanogrammi per microlitro. Il vantaggio dell'utilizzo di questo protocollo è duplice. Primo, consente ai clinici di utilizzare un singolo prelievo ematico per due test clinici anziché effettuare due prelievi separati.

In secondo luogo, semplifica il processo di ottenere accesso alle cellule contenenti DNA utilizzando moderne provette con separatore meccanico invece di generazioni precedenti. Nelle provette con gel separatore della generazione precedente, sia il gel separatore stesso sia il coagulo di sangue agivano come barriere per le cellule contenenti DNA. Con le provette P 100, il separatore meccanico viene facilmente rimosso mediante separazione per densità con saccarosio al 17%.

Questa è una schermata della lettura effettuata con il nano drop di un'estrazione media di DNA. Utilizzando questo metodo per il campione P 109, l'estrazione ha prodotto una soluzione di 250 microlitri con una concentrazione di 209 nanogrammi per microlitro di DNA. Il rendimento totale è stato di circa 52 microgrammi.

Il rapporto 260 su 280, la misura principale della purezza del DNA, è risultato compreso nel range ottimale di 1,8 a 1,9 con un valore di 1,88. Una misura secondaria della purezza del DNA, il rapporto 260 su 230, era vicino al range atteso di 2 a 2,2, con un valore di 2,35.

Questi sono risultati abbastanza tipici. In realtà, i rendimenti delle estrazioni varieranno in base alla qualità, a seconda del volume e dello stato del sangue prima dell'estrazione, utilizzando elettroforesi su gel standard con colorazione al bromuro di etidio. Ulteriori test di qualità mostrano che il DNA genomico estratto da tubi P 100 è integro quanto il DNA estratto da sangue intero.

Questo è evidente dalla banda spessa e intensa che appare nella parte superiore di ogni corsia contenente DNA genomico. L'utilizzo di questo protocollo al posto dei metodi precedenti presenta due vantaggi principali. In primo luogo, combina ciò che tipicamente richiederebbe due prelievi di sangue in un unico prelievo.

In secondo luogo, questo protocollo è più rapido e pulito rispetto a un protocollo che prevede l'utilizzo di comuni provette con gel separatore SST. Eliminando la necessità di frammentare regolarmente il sangue coagulato, i medici prelevano di routine due provette di sangue quando sono richiesti test genetici e sierologici. In generale, si utilizza una provetta con gel separatore SST, detta provetta con tappo dorato, e una provetta in EDTA con potassio, detta provetta con tappo viola; il siero viene prelevato dalla provetta SST e il DNA viene estratto dalla provetta con tappo viola. Con questo metodo, è necessario prelevare una singola provetta con tappo rosso P 100.

Sebbene alcune istituzioni familiari con il metodo di estrazione del DNA che utilizza il separatore a gel possano già prelevare un tubo sia per test sierologici che genetici, il metodo qui presentato rappresenta un miglioramento progressivo ma sostanziale rispetto a questi metodi esistenti con separatore a gel. Entrambi i metodi richiedono la rimozione di un qualche tipo di separatore, anche se il gel risulta generalmente più disordinato rispetto al separatore in plastica.

Le provette separatore richiedono che il sangue coagulato venga omogeneizzato attraverso una maglia metallica prima dell'estrazione del DNA. Questa omogeneizzazione può risultare disordinata ed estrazione del DNA risulta più difficoltosa quando sono presenti in quantità notevole globuli rossi, che non contengono DNA. Questo metodo di estrazione P 100 permette la separazione dei globuli bianchi, contenenti DNA, dall'ematocrito, lasciando pochi globuli rossi che possano interferire con l'estrazione del DNA.

Questo sistema di recupero del DNA da un tubo plasmatico P 100, invece dei tubi con separatore in gel della generazione precedente, presenta numerosi vantaggi. I tubi P 100 contengono EDTA, che inibisce l'endonucleasi dipendente dal magnesio e agisce come anticoagulante per prevenire la coagulazione del sangue. Il risultato finale è un'integrità del DNA maggiore e un protocollo di estrazione molto più semplice, in particolare grazie all'evitare la rottura e l'omogeneizzazione del sangue coagulato.

Inoltre, il sangue privato del plasma può essere conservato in provette P100, sottoposto a test illimitatamente fino a tre anni, fino al momento in cui si desidera l'estrazione del DNA. Inoltre, i clinici otterrebbero dati pazienti più utili con un numero ridotto di prelievi ematici e quindi con minor stress per i pazienti sottoposti alle procedure.