Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio

Lo scopo di questa procedura è monitorare il comportamento della cultura del chiming meen cranico. In condizioni di coltura definite. Il primo passo è raccogliere le corna uterine da un topo gravido a tempo.

8,5 giorni dopo il coum. Una volta isolati, gli embrioni vengono rimossi dalla decidua e il sacco vitellino viene rimosso per la genotipizzazione. Successivamente, le piante di mechy cranio e la microdissezione e trasferite su piastre di coltura tissutale rivestite di matrice extracellulare.

Gli espianti di X possono attaccarsi e vengono coltivati per un massimo di 48 ore in presenza o assenza di agenti farmacologici definiti. Infine, vengono scattate immagini di explan per mostrare le differenze nella migrazione cellulare. Questo metodo è utile per rispondere a domande chiave come quali sono le vie di segnalazione e le proteine della matrice extracellulare coinvolte e controllare il comportamento del cran utilizzando il tipo durante l'elevazione della piega neuronale.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le fasi della microdissezione sono difficili da imparare e richiedono pazienza e pratica per essere padroneggiate Per iniziare, se verrà eseguita l'immunoistochimica, preparare i vetrini coprioggetti, altrimenti saltare questo passaggio e rivestire le piastre di coltura tissutale direttamente con vetrini circolari da 12 millimetri sterilizzati con ECM immergendoli nell'etanolo. Lasciali asciugare all'aria. Quindi posizionare un vetrino di copertura sterilizzato in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.

Lavorare in una cappa di laina a un millilitro di matrice extracellulare o ECM per rivestire i vetrini coprioggetto o il fondo di una piastra di coltura tissutale. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre ore dopo l'incubazione, aspirare la soluzione ECM e lavare tre volte in PBS. A questo punto, le lastre rivestite possono essere utilizzate immediatamente o avvolte e conservate a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane.

Ade nella visualizzazione dell'embrione traslucido. Vengono preparate piastre di protezione Syl con sfondi neri resistenti. Seguendo il protocollo del produttore.

Preparare gli strumenti di dissezione inserendo uno spillo minuzioso in un portaspilli. Usa un blocco per affilare le pinze quando tutto è pronto. Raccogliere l'utero da un topo gravido a tempo che è 8,5 giorni dopo quot.

Posizionare l'utero isolato in un piatto con PBS sterile e lavare. Una volta sotto un microscopio da dissezione, separare l'individuo deciduo usando le forbici con una pinza. Rimuovere il tessuto connettivo uterino con un movimento di lacerazione, facendo attenzione a non creare pressione e far uscire l'embrione dalla decidua.

Usa una pinza per strappare con cura il tessuto uterino sul lato opposto alla placenta. Per esporre l'embrione racchiuso nel sacco vitellino, usa la pinza per pizzicare l'embrione e il sacco vitellino dalla placenta e rimuovere il tessuto uterino dal piatto. Successivamente, usando una pinza per strappare delicatamente, rimuovi il sacco vitellino dall'embrione.

Posizionare il sacco vitellino in una provetta di Eppendorf per la genotipizzazione con una pipetta, una volta isolato mettere in scena l'embrione contando i somiti. Idealmente, l'embrione sarà compreso tra le sei e le dieci, quindi potrebbero essere le fasi. In questa fase, le pieghe neurali stanno appena iniziando ad elevarsi e la morfogenesi principale del mesenchima cranico non si è ancora verificata.

Una volta determinato lo stadio, trasferire l'embrione su una piastra di protezione cellulare nera contenente DMEM senza rosso fenolo. Per prima cosa sotto un microscopio da dissezione con il massimo ingrandimento possibile, mettere a fuoco la testa dell'embrione con un ago da dissezione in ciascuna mano, sezionare la testa anteriormente ai meri rmba. Quindi, taglia lungo la linea mediana per bi.

Sezionare la testa in due metà uguali con un ago da dissezione in ciascuna mano. Sezionare le frange esterne lungo il margine della testa dell'embrione e della linea mediana. Rimuovere le a necessarie per evitare di confondere l'explan desiderato con il tessuto indesiderato.

Explan conterrà la cresta neurale cranica in migrazione, il mesoderma parallelo e l'ectoderma di superficie per rimuovere le cellule attaccate in modo lasco. Pipettare con cura su e giù con un puntale per pipetta da 200 microlitri. E per Pepin, raccogli con cura l'explan con una punta per pipetta.

In circa 10 microlitri di DMEM posti al centro di una coltura tissutale rivestita, ben a 20 microlitri di DMEM caldo integrato con il 15% di FBS, la piastra di coltura può ora essere trasferita in un incubatore di coltura tissutale. Dopo circa una o due ore, l'explan viene allegato e possono essere aggiunti altri 250 microlitri di supporto. Dopo circa 24 ore, l'explan sarà saldamente attaccato al vetrino coprioggetto.

A questo punto, gli agenti farmacologici possono essere aggiunti al terreno dopo ulteriori 24 ore, le cellule migreranno da loro. Le immagini vengono in genere acquisite per documentare la distanza e il numero di cellule che migrano da esse. A questo punto, i poiché iniziano a mostrare segni di diminuzione della vitalità con incubazioni più lunghe.

Ecco alcuni esempi di cellule che migrano da piante craniche di me e chix. Dopo 48 ore in diversi substrati, dipendono sia la forma che le dimensioni delle cellule che migrano dall'explan. La migrazione del substrato è stata supportata da fibronectina, laminina, max gel, ECM e acido ialuronico.

Seguendo questa procedura, altri metodi come l'immunofluorescenza e l'imaging dal vivo possono essere utilizzati per sondare ulteriormente i percorsi che regolano il comportamento dell'inchiostrato cranico durante l'elevazione della piega neuronale.