Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio

Lo scopo di questa procedura è monitorare il comportamento della coltura di meninge cranica. In condizioni di coltura definite. Il primo passo consiste nel prelevare le corna uterine da un topo gravido a tempo controllato.

8,5 giorni dopo il coito. Una volta isolati, gli embrioni vengono rimossi dal decidua e il sacco vitellino viene asportato per il genotipaggio. Successivamente, i mesenchimi cranici vengono microdissecati e trasferiti in piastre per colture cellulari rivestite con matrice extracellulare.

Si lascia che gli espianti X si attacchino e vengano coltivati fino a 48 ore in presenza o assenza di agenti farmacologici definiti. Infine, vengono acquisite immagini degli espianti per mostrare le differenze nella migrazione cellulare. Questo metodo è utile per rispondere a domande fondamentali, come quali sono le vie di segnalazione e le proteine della matrice extracellulare coinvolte e che controllano il comportamento del cran durante l'elevazione del solco neurale.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché i passaggi della microdissezione sono difficili da apprendere e richiedono pazienza e pratica per essere padroneggiati. Per iniziare, se si eseguirà un'immunocitochimica, preparare coprioggetti; altrimenti, saltare questo passaggio e rivestire direttamente le piastre per colture cellulari con coprioggetti circolari di vetro da 12 millimetri sterilizzati, immergendoli nell'etanolo. Lasciarli asciugare all'aria. Successivamente, posizionare un coprioggetto sterilizzato in ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.

Lavorare in una cappa a flusso laminare aggiungendo un millilitro di matrice extracellulare o ECM per rivestire i coverslip o il fondo di una piastra per colture cellulari. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre ore; al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione di ECM e lavare tre volte con PBS. A questo punto, le piastre rivestite possono essere utilizzate immediatamente oppure avvolte e conservate a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane.

Ade nel visualizzare l'embrione traslucido. Vengono preparate lastre di Syl con fondi neri resistenti. In base al protocollo del produttore.

Preparare gli strumenti per la dissezione inserendo un ago minutian in un supporto per aghi. Utilizzare una pietra per affilare le pinzette una volta che tutto è pronto. Raccogliere l'utero da un topo gravido al 8,5° giorno post quot.

Posizionare l'utero isolato in una piastra contenente PBS sterile e lavare. Una volta sotto un microscopio per dissezione, separare le singole decidue utilizzando forbici e pinzette. Rimuovere il tessuto connettivo uterino con un movimento di strappo, avendo cura di non esercitare pressione e di non far fuoriuscire l'embrione dalla decidua.

Utilizzare la pinzetta per strappare con attenzione il tessuto uterino sul lato opposto alla placenta. Per esporre l'embrione racchiuso nella sacca vitellina, utilizzare la pinzetta per afferrare l'embrione e la sacca vitellina dalla placenta e rimuovere il tessuto uterino dalla piastra. Successivamente, utilizzando la pinzetta per strappare delicatamente, rimuovere la sacca vitellina dall'embrione.

Posizionare il sacco vitellino in una provetta eppendorf per il genotipaggio utilizzando una pipetta; una volta isolato, determinare lo stadio dell'embrione contando i somiti. Idealmente, l'embrione dovrebbe trovarsi tra lo stadio sei e lo stadio dieci. A questo stadio, i ripiegamenti neurali stanno appena iniziando ad elevarsi e la principale morfogenesi del mesenchima cranico non si è ancora verificata.

Dopo aver determinato lo stadio, trasferire l'embrione su una piastra nera per cellule contenente DMEM senza rosso fenolo. Innanzitutto, utilizzando un microscopio stereoscopico con l'ingrandimento più elevato possibile, focalizzare la testa dell'embrione con un ago da dissezione in ciascuna mano e dissezionare la testa anteriormente rispetto alle rmba meres. Successivamente, tagliare lungo la linea mediana per ottenere bi.

Dividere la testa in due metà uguali utilizzando un ago da dissezione in ciascuna mano. Dissezionare i margini esterni lungo il bordo della testa dell'embrione e lungo la linea mediana. Rimuovere, se necessario, per evitare di confondere l'esplanato desiderato con tessuto indesiderato.

Il disco esplantato conterrà cresta neurale cranica migratoria, mesoderma parassiale ed ectoderma superficiale, al fine di rimuovere le cellule debolmente aderenti. Pipettare delicatamente su e giù con una punta da 200 microlitri. Per Pepin, raccogliere con attenzione l'esplantato con una punta di pipetta.

In circa 10 microlitri di DMEM posizionati al centro di una camera da coltura rivestita, aggiungere 20 microlitri di DMEM caldo integrato con il 15% di FBS; la piastra può ora essere trasferita nell'incubatore per colture cellulari. Dopo circa una o due ore, l'espianto si sarà attaccato e si potranno aggiungere ulteriori 250 microlitri di terreno. Dopo circa 24 ore, l'espianto sarà saldamente aderente al coverslip.

In questo momento, dopo ulteriori 24 ore, possono essere aggiunti agenti farmacologici al mezzo; le cellule migreranno dai tessuti. Di norma, vengono acquisite immagini per documentare la distanza e il numero di cellule che migrano dai tessuti. A questo punto, poiché i tessuti cominciano a mostrare segni di ridotta vitalità con incubazioni più lunghe.

Ecco alcuni esempi di cellule che migrano da preparati di mesoderma cranico e piante chix. Dopo 48 ore su diversi substrati, sia la forma che la dimensione delle cellule provenienti dall'espianto risultano dipendenti dal substrato. La migrazione è stata sostenuta su fibronectina, laminina, gel max, matrice extracellulare (ECM) e acido ialuronico.

Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come l'immunofluorescenza e l'imaging in tempo reale possono essere utilizzati per approfondire le vie che regolano il comportamento delle cellule della cresta neurale cranica durante l'elevazione del solco neurale.