Modelli di metastasi ossee

L'obiettivo generale di questa procedura è iniettare cellule tumorali in modo da indurre la crescita delle cellule tumorali nell'osso e la conseguente distruzione ossea. Questo viene ottenuto prima ri-sospendendo le cellule tumorali in PBS freddo e ponendole sul ghiaccio. Successivamente, un numero appropriato di cellule viene iniettato nel ventricolo cardiaco sinistro o nella tibia di un topo anestetizzato.

Successivamente, la crescita del tumore osseo e i parametri ossei vengono monitorati longitudinalmente mediante diverse tecniche di imaging. Infine, viene effettuata la quantificazione finale dei parametri del tumore e dell'osso. In definitiva, si utilizza una combinazione di fluorescenza o luminescenza in vivo e ex vivo, radiografia 2D e tomografia 3D.

Micro CT e istologia vengono utilizzati per mostrare la crescita tumorale e i cambiamenti nell'ambiente microscopico osseo a livello cellulare e strutturale della crescita. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della metastasi tumorale, come ad esempio quali fattori presenti nell'osso favoriscono la colonizzazione metastatica dei tumori del seno e della prostata. A dimostrare la preparazione delle cellule sarà Alisa Merkel, assistente di ricerca nel mio laboratorio; mantenere le cellule per meno di una settimana.

Che ospitano la linea cellulare M-D-A-M-B 2 3 1 marcata con GFP in DMEM contenente 10% di FBS e 0,1 milligrammo per millilitro di penicillina-streptomicina, a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5-8%. Passare le cellule al raggiungimento di una confluenza dell'80-90% effettuando un'impiego da 1 a 10. Per preparare le cellule all'inoculo, trattarle con tripsina-EDTA 0,15% al raggiungimento di una confluenza dell'80-90%, utilizzando 10 millilitri.

DMEM ghiacciato con 10% di FBS, trasferire immediatamente le cellule in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugare per cinque minuti. Risospendere il pellet in un tubo conico da 50 millilitri con 25 millilitri di PBS ghiacciato senza calcio e magnesio e contare le cellule; eliminare il PBS e risospendere le cellule in PBS ghiacciato a una concentrazione di 10⁶ cellule per millilitro per inoculazione intracardiaca e 250.000 cellule per millilitro per iniezione intratibiale.

Si utilizzano topi femmine immunodepressi di quattro-sei settimane di età che sono stati alimentati con una dieta Tela 29 20 x per cinque-dieci giorni prima dell'iniezione. Dopo aver anestetizzato il topo in una camera con il 2,5% di isoflurano, spostare il topo sotto una cappa ventilata verso un cono nasale e posizionarlo in posizione supina. Utilizzare una soluzione al 10% di iodopovidone per lavare il torace, seguita da etanolo al 70%.

Segnare il torace del topo per l'iniezione a metà strada tra la scollatura sternale e la parte superiore del processo xifoideo e leggermente a sinistra dello sterno. Successivamente, utilizzando una siringa per insulina da 300 microlitri, calibro 28, lunghezza mezza pollice, aspirare una piccola bolla d'aria per creare uno spazio tra lo stantuffo e il menisco ed aspirare 100 microlitri di cellule tenendo la pelle del topo tesa con una mano.

Mantenere l'ago in posizione verticale ed inserirlo; un'inserzione corretta nel ventricolo cardiaco sinistro dovrebbe produrre un chiaro impulso di sangue di colore rosso brillante nella siringa. A questa profondità, premere con attenzione lo stantuffo della siringa senza movimenti significativi dell'ago, per evitare di perforare il cuore o di versare cellule nella cavità toracica. Per ridurre il gocciolamento di cellule nella cavità toracica, tirare leggermente lo stantuffo verso l'alto per creare una piccola quantità di pressione negativa.

Quindi estrarre direttamente l'ago dal torace avendo cura di evitare di inclinarlo durante la rimozione, poiché ciò potrebbe lacerare il rivestimento del cuore e causare sanguinamento. Applicare una leggera pressione sulla sede di iniezione per ridurre il sanguinamento per circa un minuto. Durante la rimozione del cono nasale, spostare il topo su un tappetino riscaldante finché non riprende completamente conoscenza.

Immediatamente prima della procedura intra-tibiale, iniettare nel topo bup printex. Dopo aver anestetizzato il topo e posizionato nella cono nasale, pulire entrambe le zampe con iodopovidone al 10%, seguito da etanolo, utilizzando quattro dita e il pollice.

Afferrare delicatamente il malleolo laterale, il malleolo mediale e la metà inferiore della tibia. Poi piegare la gamba in modo che il ginocchio risulti visibile e accessibile. Utilizzando etanolo al 70%, inumidire la pelle per aumentare la visibilità del legamento rotuleo sottostante, che dovrebbe apparire come una linea bianca spessa e distinta mentre si tiene saldamente la caviglia.

Inserire un ago da mezzo pollice con calibro 28 al di sotto della rotula, attraverso il centro del legamento rotuleo e nella zona intercondilare anteriore in corrispondenza della sommità della tibia. Applicare una pressione ferma e costante con un leggero movimento a trapano per guidare con attenzione l'ago attraverso la piastra di accrescimento. Una volta superata la piastra di accrescimento tibiale, l'ago incontrerà una resistenza notevolmente ridotta.

Utilizzare un movimento laterale delicato dell'ago per assicurarsi che sia posizionato nella tibia e oltre la piastra di accrescimento. Il movimento sarà limitato se l'ago si trova nella posizione corretta all'interno della tibia. Premere lentamente lo stantuffo per iniettare 10 microlitri di soluzione cellulare.

In questo momento non si dovrebbe avvertire alcuna resistenza o quasi. Quindi estrarre lentamente l'ago. Rimuovere il topo dall'anestesia e mantenerlo su un tappetino riscaldante fino al suo risveglio.

Monitorare il topo due o tre volte alla settimana. Su topi anestetizzati vengono eseguite diverse tecniche di imaging, come la luciferasi, la fluorescenza GFP e i raggi X. La fluorescenza indica le aree di tumore.

Una scansione estron viene utilizzata per localizzare le lesioni. Le lesioni si correlano con le immagini di fluorescenza. Ulteriori dettagli sulle tecniche di imaging sono disponibili nella parte scritta di questo protocollo.

Da 21 a 35 giorni dopo l'iniezione. Sacrificare i topi utilizzando un metodo approvato dal comitato iacuc e conservare le ossa in formalina al 4%. Eseguire l'analisi ex vivo mediante micro-TC e istomorfometria con colorazione ematina e DSN sulle ossa isolate. Ulteriori dettagli sono disponibili nel protocollo scritto successivamente all'inoculazione intracardiaca o intratibiale di cellule tumorali.

I topi vengono monitorati settimanalmente mediante radiografia e fluorescenza o luminescenza. Le lesioni diventano normalmente evidenti tramite raggi X tra la seconda e la terza settimana. Sebbene possano essere visibili mediante fluorescenza e luminescenza già a partire dalla seconda settimana, a seconda del modello qui mostrato, le lesioni appaiono come fori scuri nell'osso e possono diventare più evidenti nel tempo. Le lesioni sono state quantificate mediante analisi con Metamorph delle radiografie e della fluorescenza.

Sono stati quantificati utilizzando il software di acquisizione e analisi delle immagini Maestro. In questa figura, la perdita ossea è quantificata mediante analisi con micro-TC. I dati strutturali e minerali dell'osso ottenuti tramite misurazioni con micro-TC sono rappresentati come immagini tridimensionali di osso sano e di osso con tumore, in cui le aree di distruzione ossea sono mostrate come zone vuote.

È stata quindi eseguita l'analisi istomorfogeometrica sui campioni per determinare il carico tumorale e il volume osseo rispetto al volume del tessuto. Durante l'esecuzione di queste procedure, è importante essere pazienti e posizionare con attenzione ogni topo, monitorando gli animali da vicino. Se iniziano a morire, è probabile che ciò sia dovuto all'aggregazione cellulare e si dovrebbero preparare immediatamente nuove cellule.

La cosa peggiore che si possa fare è affrettare le procedure o lasciarsi prendere dalla frustrazione. Ricordate che, con maggiore pratica e nel tempo, migliorerete e diventerete più veloci dopo il loro sviluppo. Queste tecniche hanno aperto la strada ai ricercatori del cancro per studiare la metastasi ossea in vivo.