Name: Ex coltura vivo di Whole, in via di sviluppo Brains Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Impara la coltura ex vivo di cervelli di Drosophila in sviluppo per studiare la neurobiologia del corpo fungoide. Questa tecnica consente analisi ad alta risoluzione dei processi di sviluppo neuronale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vorremmo ringraziare tutti i membri del nostro laboratorio per i loro consigli, utili discussioni e commenti sul manoscritto. Vorremmo inoltre particolarmente ringraziare Marta Koch e Bassem Hassan per il suggerimento eccellente che aspettiamo fino a 1,5 ore APF prima sezionare il cervello per la coltura in esperimenti di rimodellamento. Ringraziamo anche la possibilità di imaging NHGRI per l&#39;utilizzo del loro microscopio confocale. Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma Neuroscienze di base del Programma di NINDS ricerca intramurale, NIH (NS003106 Z01).

A. Preparazione di Media <ol><li> Preparare mezzi completi da filtro sterilizzante Schneider Drosophila mezzo supplementato con 10% siero fetale bovino e 1% di penicillina / streptomicina. </li><li> Supporto deve essere preparato fresco ogni volta. In alternativa, una nuova aliquota di pre-congelati i media possono essere scongelati prima di ogni utilizzo. </li><li> Prima di coltura, aggiungere 10 mg / ml di insulina e 2 mg / ml ecdisone ai media. I farmaci sono stati preparati come scorte concentrati e congelata in piccole aliquote. Aliquote non erano scongelati ricongelato. </li><li> Tutte le soluzioni di lavoro deve essere mantenuta a 25 ° C. </li></ol> La coltivazione di cervelli larvali 1. Selezione e dissezione di cervelli larvali <ol><li> Aggiungere 500 microlitri di media per un inserto di 12 millimetri coltura cellulare Millicell. I cervelli sezionati saranno inseriti in questi inserti per facilitare immunostaining facile. </li><li> Aggiungere una piccola quantità di supporti preparati per un vetro da orologio dissezione. </li><li> Ucantare una piccola spatola, raccogliere vagare larve terzo stadio e metterli in vetro di orologio. (Si presume che il metodo di coltura ex vivo si applica altrettanto bene al primo o al secondo stadio le larve, ma non abbiamo testato questo.) </li><li> Tenendo l&#39;estremità posteriore della larva con una coppia di pinze, accuratamente aprire l&#39;estremità anteriore con una seconda coppia di pinze # 5. </li><li> Rapidamente sezionare il cervello, mantenendo il cordone nervoso ventrale intatta. </li></ol> 2. Ex vivo di coltura sezionati cervelli larvali <ol><li> Utilizzando pre-bagnato puntali, trasferire il cervello con cura in inserti di coltura cellulare, le pre-riempite con i media. </li><li> Cervelli di trasferimento, in media, a un incubatore a 25 ° C fino al punto temporale desiderato viene raggiunto. Questo metodo funziona in modo efficiente per un massimo di 48 ore nella cultura. </li><li> Sostituire il supporto a 8 ore. Oltre a ciò, sostituire la metà dei mezzi di ogni 5-6 ore. </li></ol> 3. La manipolazione farmacologica dellaBrains larvali Questo metodo di coltura ex vivo può essere utilizzato per corroborare farmacologicamente interazioni genetiche precedentemente dimostrato nel nostro laboratorio 1. <ol><li> Aggiungere 100 roscovitine uM e 100 micron a olomoucine supporti preparati. </li><li> Trasferimento cervelli sezionati a questo media. </li><li> Cervelli cultura a 25 ° C per 24 ore. </li><li> Sostituire il supporto a 8 ore. Oltre a questo, sostituire la metà dei media (con farmaci) ogni 5-6 ore. </li></ol> La coltivazione di Brains pupa 1. Selezione di Pupae per dissezione <ol><li> Segna pupe bianco su bottiglie / flaconi. </li><li> Scegliere solo pupe che sono completamente bianchi. Pupe con qualsiasi tipo di colorazione non dovrebbe essere incluso. </li><li> Questa fase è 0 ore dopo la formazione pupario (APF). </li><li> Questi pupe sarà pronto per dissezione 1,5 ore dopo la marcatura. Questo passo è fondamentale per assicurare che la potatura di sviluppo avviene in ex vivo </em&gt; cultura. </li></ol> 2. Dissezione di Pupae <ol><li> Aggiungere 500 microlitri di media per un inserto di 12 millimetri coltura cellulare Millicell. (I cervelli sezionati saranno inseriti in questi inserti per facilitare immunostaining facile). </li><li> Una volta che il desiderato punto temporale è stato raggiunto, aggiungere una piccola quantità di supporti preparati per un vetro da orologio dissezione. </li><li> Utilizzando una piccola spatola bagnata, pick up pupe precedentemente segnato per la dissezione e metterli in vetro di orologio. </li><li> Tenendo l&#39;estremità posteriore del pupe con una coppia di pinze, accuratamente aprire l&#39;estremità anteriore del caso pupa con una seconda coppia di pinze # 5. </li><li> Rapidamente sezionare il cervello, mantenendo il cordone nervoso ventrale intatta e allegato. </li></ol> 3. Coltura ex vivo di sezionati Brains pupa <ol><li> Trasferire il cervello con cura in inserti di coltura cellulare, le pre-riempite con i media. </li><li> Cervelli di trasferimento, in media, ad un incubatore a 25 ° C fino alla desiderata time-point viene raggiunto. Abbiamo usato questo metodo per un massimo di 10 ore in coltura per l&#39;esperimento illustrato, ma può essere esteso a lunghi periodi di osservazione e di trattamento, se necessario. </li><li> Per i punti temporali più di 8 ore APF, sostituire i supporti ogni 5-6 ore. </li></ol> Da questo passo, il protocollo rimane invariato sia per larve e pupe. B. Fissaggio Brains sezionati <ol><li> Una volta che il desiderato punto temporale viene raggiunto, rimuovere i supporti e aggiungere 500 microlitri del 4% formaldeide in PBS 1x con 0,5% Triton X-100 (PBST) per 30 minuti, sostituendo con formaldeide fresco dopo 15 minuti. </li><li> Assicurarsi di non permettere il cervello per asciugare durante la sostituzione media con fissativo. </li><li> Lavare formaldeide con quattro lavaggi 10 minuti di 1x PBS con 0,5% Triton X-100 (PBST). </li></ol> C. colorazione Brains fissi <ol><li> Dopo formaldeide è stato lavato via, blocco cervello per 1 ora in una soluzione bloccante di 1x PBS con 1% normaleSiero di capra e l&#39;1% albumina di siero bovino. </li><li> Aggiungi anticorpi primari realizzati con la stessa soluzione bloccante. </li><li> Cervelli Incubare per una notte a 4 ° C. </li><li> La mattina dopo, lavare gli anticorpi primari con quattro lavaggi 10 minuti di PBST. </li><li> Aggiungere anticorpi secondari costituiti in soluzione bloccante. </li><li> Lasciare a temperatura ambiente per 4 ore. </li><li> Lavare anticorpi secondari con quattro lavaggi 10 minuti di PBST. </li></ol> D. Montaggio Brains fissate e colorate per la microscopia <ol><li> Equilibrare il cervello nei media Vectashield di montaggio per 1 ora. </li><li> Montare il cervello su vetrini utilizzando i mezzi di comunicazione Vectashield di montaggio. </li><li> Posizionare chip vetro su entrambi i lati del cervello prima di montare il vetrino coprioggetto. Ciò impedisce ai cervelli di essere schiacciato, mantenendo campione abbastanza sottile per analizzare tutti i piani focali con un microscopio confocale. Cervelli sono stati circa orientati su di montaggio per facilitare la visualizzazione delle caratteristiche di interesse. Se necessario,immagini del cervello erano alternate con il software Imaris per fornire una visione ottimale per la documentazione e la misurazione. </li><li> Guarnizione del coperchio scivola con smalto trasparente. </li><li> Conservare scivola al riparo dalla luce. </li></ol> E. rappresentativi Risultati La figura 1 mostra un pannello di cervelli larvali terzo instar di (A) wild-type mosche e (B) mosche che esprimono una posizione dominante-negativo derivato del Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000). Entrambi esprimono actina-GFP (green) nei neuroni gamma MB. Come descritto in precedenza (Trunova et al., 2011), c&#39;è una regione negli assoni prossimali di wild-type neuroni gamma che non riesce ad accumulare actina-GFP, mostrando quindi come una &quot;zona chiara&quot; (A, staffa), e fasciclin due proteine ​​(rosso) si accumula nelle assoni solo fino al confine di questa zona ventrale (linea bianca orizzontale). La linea tratteggiata nel terzo pannello di figura 1 (A) indica la posizione del MB, evidenziando l&#39;attoin &quot;zona chiara&quot; e il suo margine ventrale. In mosche esprimono Cdk5DN, la zona chiara actina è assente (B) e Fasciclin 2 (FasII) immunoreattività dorsalmente diffonde attraverso quella regione. (Si noti che un numero variabile di FasII positivo progetto di assoni in orizzontale tutta la MB, queste non sono rilevanti per il fenotipo). Barra della scala rappresenta 20 micron. Utilizzando il nostro metodo di coltura ex vivo, abbiamo trattato wild-type mosche con una combinazione di roscovitine e olomoucine, inibitori farmacologici di Cdk5 attività. La figura 2 mostra un pannello di cittadini di instar cervelli larvali di controllo (A) e farmaco-trattata (B wild-type) mosche. Simile a mosche che esprimono un dominante negativo Cdk5 costrutto, cervelli trattati con inibitori Cdk5 per 24 ore, mostrano la perdita caratteristica della zona di actina chiaro e spostamento di confine FasII (parentesi quadre). Linee bianche indicano la posizione di wild-type confine FasII. Barra della scala rappresenta 20 micron. Figusull&#39;articolo 3, mostra una serie rappresentante degli enti di funghi Drosophila da 0-10 ore APF, etichettati con membrana mirati mCD8-GFP (verde). Parentesi indicano il calice, cioè, le proiezioni dendritiche del MB. Prima della metamorfosi, si possono vedere gli assoni MB scorrono dorso-ventrale in grossi fasci, così come una &#39;nebbia&#39; del segnale fluorescente derivante dalla dendritica arbor densa (staffa). Un pannello spettacoli cervelli sezionati al momento indicato. Si noti la potatura dei dendriti nella regione indicata dalle parentesi, in modo tale che entro 6-8 ore APF, la foschia del segnale dendritica è andato (anche se il segnale assonale è invariato). Brains nel pannello B sono stati sezionati a 0 ore APF, prima interna ecdisone spike (Truman e Riddiford, 2002), e coltivate ex vivo come indicato. Questi mostrano nessuna potatura di sviluppo dei dendriti, ma piuttosto il segnale dendritica persiste a 10 ore APF. Per ovviare a questo, le pupe sono contrassegnati APF a 0 ore, ma sezionato a 1,5 ore APF e colta. Vetrol C mostra una serie rappresentante degli enti di funghi queste Drosophila APF da 0-10 ore. Come nei non-coltura di campioni, il segnale dendritica non è rilevabile da 8 ore APF. Barra della scala rappresenta 20 micron.

<ol><li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li>
<li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li>
<li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5%3A+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li>
<li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+in+Drosophila%3A+behavior%2C+genetics%2C+and+neural+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li>
<li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis%3A+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li>
<li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+requirement+of+the+USP%2FEcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li>
<li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li>
<li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li>
<li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li>
<li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

<html> Croniche manipolazioni genetiche di struttura del tessuto e funzione, tra cui le mutazioni ed espressione dei transgeni, in genere producono una combinazione di effetti immediati e tardivi conseguenze indirette che possono essere molto difficili da separare. Integrare i metodi genetici con la farmacologia può facilitare l&#39;interrogatorio del corso tempo dietro un fenotipo. Ad esempio, questo è un approccio efficace per sezionare i contributi dei vari componenti citoscheletrici durante la spermatogenesi in D...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> Schneider Drosophila media </td><td> Invitrogen </td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td> Siero bovino fetale (inattivato al calore) </td><td> Invitrogen </td><td> 10082-147 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Invitrogen </td><td> 12585-014 </td><td> 10μg/ml </td></tr><tr><td> Ecdisone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td> Roscovitine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7772 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td> Olomoucine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0886 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td> Siero di capra normale </td><td> Invitrogen </td><td> 50062Z </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Fisher Scientific </td><td> M9501 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Formaldeide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4551 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP151 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H1000 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Millicell colture cellulari Inserti </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multidish, 4 e </td><td> Thermo Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinze </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Vetrini </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro di copertura </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

ex coltura vivo di whole, in via di sviluppo brains drosophila

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Noi descriviamo un metodo per la coltura ex vivo di interi cervelli Drosophila. Questo può essere usato come un contrappunto al croniche manipolazioni genetiche per lo studio della biologia cellulare e dello sviluppo delle strutture cerebrali centrali, consentendo acuti interventi farmacologici e immagini dal vivo di processi cellulari. Come esempio della tecnica, prima lavorare dal nostro laboratorio 1 ha dimostrato che un vano precedentemente non subcellulare compreso tra i vani assonale e somatodendritic di assoni del cervello Drosophila centrale. Lo sviluppo di questo vano, indicato come il segmento assone iniziale (AIS) 2, è stato dimostrato geneticamente dipendere dalla chinasi neurone-specifica ciclina-dipendente, Cdk5. Mostriamo qui che il trattamento ex vivo delle wild-type cervelli larvali di Drosophila con la Cdk5-inibitori farmacologici specifici roscovitine e olomoucine 3 produce modifiche acute nell&#39;organizzazione actina enella localizzazione della proteina Fasciclin superficie cellulare 2, che imitano i cambiamenti visti in mutanti che mancano Cdk5 attività geneticamente. Un secondo esempio di tecnica di coltura ex vivo è previsto per il rimodellamento dei collegamenti del corpo fungo embrionale (MB) neuroni gamma durante la metamorfosi da larva ad adulto. Il corpo fungo è il centro di apprendimento e la memoria olfattiva in volo 4, e questi neuroni gamma potare i rami assonali e dendritiche durante lo sviluppo pupale e poi ri-rami si estendono in un timepoint tardi per stabilire il modello di adulto innervazione 5. Potatura di questi neuroni del MB è stato verificato tramite degenerazione locale di rami neuriti 6, da un meccanismo che viene attivato da ecdisone, un ormone steroideo, agendo sul recettore B1 ecdisone 7, e che dipende dall&#39;attività del sistema ubiquitina-proteasoma 6. Il nostro metodo di coltura ex vivo possono be utilizzato per interrogare ulteriormente il meccanismo di rimodellamento sviluppo. Abbiamo trovato che l&#39;impostazione in coltura ex vivo, neuroni gamma di MB ricapitolato il processo di potatura di sviluppo con un percorso simile a quello che in vivo. È essenziale, tuttavia, attendere 1,5 ore dopo la formazione pupario prima espianto il tessuto affinché le cellule ad impegnarsi irreversibilmente a metamorfosi; dissezione degli animali durante l&#39;insorgenza di pupariation portato a metamorfosi poco o nessun in coltura. Così, con opportune modifiche, l&#39;approccio coltura ex vivo può essere applicato allo studio dinamico così come aspetti allo stato stazionario di biologia cervello centrale.

Questo articolo descrive un metodo con il quale si può imitare<em&gt; In vivo</em&gt; Sviluppo del<em&gt; Drosophila</em&gt; Corpo funghi in un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema di coltura.

Ex coltura vivo di Whole, in via di sviluppo Brains Drosophila

Descriviamo un metodo per la coltura ex vivo di cervelli interi di Drosophila. Tale procedura può essere utilizzata come alternativa alle manipolazioni genetiche croniche per...

L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare interi cervelli di drosophila in via di sviluppo, di larve e di pupe, in un contesto ex vivo. Questo viene ottenuto innanzitutto identificando le drosophila, le larve e le pupe allo stadio appropriato. Successivamente, i cervelli vengono rapidamente dissezionati.Successivamente, i cervelli vengono coltivati per il periodo di tempo richiesto a 25 gradi Celsius. Infine, i cervelli coltivati vengono fissati, colorati, montati e analizzati mediante imaging. In definitiva, i risultati dimostrano che è possibile riprodurre lo sviluppo in vivo del corpo fungiforme di oph attraverso una tecnica di coltura ex vivo.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che ora possiamo emulare fenotipi in vivo nel corpo fungiforme di drosophila in un contesto di coltura ex vivo, permettendo un'analisi ad alta risoluzione della dinamica del processo di sviluppo. Per coltivare cervelli di larve, dopo aver preparato il mezzo completo fresco con insulina, aggiungere Dyson a 500 microlitri in una piastra per colture cellulari da 12 millimetri con inserto per il trattamento farmacologico. Preparare il mezzo completo con 100 micromolar di ciascuno Rosco battin e oli moin.Aggiungere una piccola quantità di mezzo a una vetrina da dissezione. Con una spatolina, raccogliere le larve di terzo stadio in movimento e collocarle nella vetrina. Successivamente, utilizzando pinzette, afferrare l'estremità posteriore della larva.Quindi, con il numero cinque, pinzette, aprire con cura l'estremit&agrave; anteriore ed estrarre rapidamente il cervello mantenendo intatto il cordone nervoso ventrale. Utilizzando punte di pipetta pre-umidificate, trasferire con attenzione il cervello nella piastra per colture cellulari precedentemente preparata. Successivamente, creare una camera umida e posizionare la piastra all'interno della camera.Incubare il cervello a 25 gradi Celsius per un massimo di 48 ore per coltivare i cervelli degli embrioni. Iniziare marcatando con un punto bianco le provette. Registrare questa fase come zero ore dopo la formazione dell'ER o come PF a 1,5 ore.PF Aggiungere 500 microlitri di mezzo completo in una piastra per coltura cellulare da 12 millimetri con inserto. Aggiungere una piccola quantità di mezzo preparato in una capsula di Petri per dissezione. Successivamente, utilizzando una spatola piccola e bagnata, prelevare il PPE precedentemente marcato per dissezione e posizionarlo nella capsula di Petri.Il pupa bianca a sinistra rappresenta il punto zero del tempo, mentre a destra è mostrata la PF a 1,5 ore. Successivamente, tenendo l'estremità posteriore della pupa con una pinzetta, utilizzare una pinzetta numero cinque per aprire con attenzione l'estremità anteriore del foro pupale. Quindi rimuovere rapidamente il cervello mantenendo il cordone nervoso ventrale intatto e attaccato. Dopo aver tagliato la parte superiore di una punta di plastica da 20 microlitri, inumidire la punta della pipetta e utilizzarla per trasferire con cura i cervelli delle pupa alle capsule contenenti il mezzo.Incubarli a 25 gradi Celsius per il tempo desiderato. Dopo che i cervelli larvali o dei pupi sono stati incubati per il tempo desiderato, rimuovere il mezzo e aggiungere 500 microlitri di formaldeide al 4% in tampone PBST. Incubare per 15 minuti, quindi sostituire con formaldeide al 4% fresca in tampone e incubare per ulteriori 15 minuti.Utilizzare un XPBS con Triton X-100 al 0,5% per lavare i cervelli quattro volte, per 10 minuti ciascuno. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare i campioni per un'ora in soluzione bloccante.Aggiungere gli anticorpi primari nella soluzione di blocco e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, lavare i campioni con PBST quattro volte per 10 minuti ciascuna. Successivamente, incubare con gli anticorpi secondari a temperatura ambiente per quattro ore.Ripetere i passaggi di lavaggio per montare i cervelli su vetrini per microscopia. Iniziare equilibrando i campioni e il mezzo di montaggio per un'ora, quindi montarli su vetrini di vetro per evitare di schiacciare i campioni. Posizionare dei frammenti di vetro su entrambi i lati.Quindi applicare i coprioggetti dopo averli sigillati con smalto per unghie. Conservare i vetrini al buio. Questa figura mostra un pannello di cervelli di larve di terzo stadio di moscerini di tipo selvaggio e di moscerini che esprimono una forma dominante negativa della CDK5 o CDK5-dn, entrambi esprimenti actina GFP nei neuroni del corpo fungiforme o neuroni gamma MB come descritto in precedenza; esiste una regione negli assoni prossimali dei neuroni gamma di tipo selvaggio in cui l'actina GFP non si accumula, mostrandosi quindi come una zona chiara, e fascicolmente la proteina si accumula negli assoni solo fino al confine ventrale di questa zona.Le linee tratteggiate indicano la posizione del MB, che evidenzia la zona chiara attiva e il suo confine ventrale. In mosche che esprimono CDK5 dn, la zona chiara dell'actina è assente e l'immunoreattività per fascicolina-2 o fascicolina-2 si estende dorsalmente attraverso quella regione. Utilizzando il metodo qui presentato, i cervelli di mosche di tipo selvatico coltivati ex vivo sono stati trattati con una combinazione di inibitori farmacologici dell'attività di CDK5, ROS cottina ed ene.Qui è mostrato un pannello di cervelli di larve di terzo stadio di moscerini di tipo selvatico trattati con farmaci e di controllo, simili a moscerini che esprimono un costrutto dominante negativo di CDK5. I cervelli trattati con inibitori di CDK5 per 24 ore mostrano la caratteristica perdita della zona chiara di actina e uno spostamento del complesso fast. Due linee bianche indicano la posizione del complesso fast di tipo selvatico. Qui mostrato è una serie rappresentativa di corpi fungiformi di Drosophila da zero a 10 ore.Un PF etichettato con membrana mirata. Otto parentesi GFP MCD indicano le proiezioni dendritiche del corpo mushroom (MB), chiamate calice prima della metamorfosi. Gli assoni del MB decorrono in senso dorso-ventrale in fasci spessi e un segnale fluorescente proviene dall'arborizzazione dendritica densa.Questa colonna mostra cervelli dissecati al tempo indicato. Si noti il rimodellamento dei dendriti nella regione indicata dalle parentesi, tale per cui tra le sei e le otto ore dopo il PF, il segnale dendritico diffuso è scomparso. I cervelli di questa colonna sono stati dissecati a zero ore dopo il PF, prima dell'atto interno.Spike di Dyson e colture x vivo ai tempi indicati mostrano assenza di potatura dendritica nello sviluppo. Piuttosto, il segnale dendritico persiste a 10 ore a PF per aggirare questo PPR marcato a zero ore EPF, ma dissezionato a 1,5 ore a PF e coltivato. Questa colonna mostra una serie rappresentativa di questi corpi a fungo DLA da zero a 10 ore.Un PF come nei campioni non coltivati, il segnale dendritico è irriconoscibile dopo otto ore PF. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come coltivare ex vivo i cervelli di Drosophila. Si dovrebbe essere in grado di isolare i cervelli da larve in fase avanzata o da prepupi bianchi, sia prima che dopo il picco ormonale che avvia la metamorfosi. A quel punto, si dovrebbe poter analizzare il materiale fissato mediante microscopia oppure utilizzare i cervelli come materiale iniziale per l'imaging in tempo reale.

ex-vivo-culturing-of-whole-developing-drosophila-brains

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo video dimostra la preparazione di colture primarie neuronali dal cervello di fine tappa Drosophila pupe. Visto di culture live show crescita dei neuriti e l'imaging di livelli di calcio con Fura-2.

Culture primarie neuronale dal cervello di tardo fase Drosophila Pupae

Questo video mostra la procedura per isolare il cervello tutto da adulto Drosophila, in preparazione per la registrazione di singoli neuroni utilizzando tecnologia standard a cellula intera. Esso comprende le immagini di cellule GFP etichettati e neuroni visualizzati durante la registrazione.

Registrazioni cella intero cervello di adulti Drosophila

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l&#39;imaging dal vivo

Descriviamo la procedura per preparare in...

Visualizzazione del sistema nervoso embrionale in Whole-mount Drosophila Embrioni

Questo video dimostra un protocollo per identificare i fattori esogeni che avviano la riattivazione delle cellule staminali neurali cerebrali di Drosophila dal loro stato quiescente. Le larve appena nate vengono sezionate per isolare il loro cervello, che viene poi coltivato in terreni con o senza un ormone di prova per valutare il potenziale dell'ormone di indurre la riattivazione e la proliferazione delle cellule staminali neurali.

Analisi della riattivazione delle cellule staminali neurali negli espianti cerebrali di Drosophila in coltura

Fonte: Ishimoto, H. et. Al., Imaging del calcio ex vivo per la visualizzazione delle risposte cerebrali alla segnalazione endocrina in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Questo video dimostra l'imaging del calcio da studiareDrosophila risposte cerebrali ai neuropeptidi. I neuroni che esprimono un indicatore fluorescente di calcio rivelano la dinamica intracellulare del calcio e le risposte funzionali alle molecole di segnalazione.

Imaging ex vivo del calcio per studiare le risposte cerebrali della Drosophila ai neuropeptidi

Dettagli Questo protocollo un metodo semplificato utilizzato per condurre cellule vive nel contesto di un cervello larvale intatto. Approcci di imaging cellulare dal vivo hanno un valore inestimabile per lo studio delle divisioni asimmetriche di cellule staminali neurali così come altri processi neurogena e di sviluppo, in coerenza scoprendo i meccanismi che sono stati precedentemente trascurato.

Immagini dal vivo di<em&gt; Drosophila</em&gt; larvali neuroblasti

L'adulto Drosophila cervello è un sistema utile per studiare circuiti neuronali, le funzioni cerebrali superiori, e malattie complesse. Un metodo efficace per sezionare intero tessuto cerebrale dalla testa piccola mosca faciliterà gli studi del cervello-based. Qui si descrive un semplice, one-step protocollo dissezione del cervello adulto con ben conservato morfologia.

Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

L'obiettivo del presente protocollo è quello di stabilire ex vivo Drosophila cultura larvale cervello ottimizzato per monitorare i ritmi circadiani molecolari con formazione immagine di time-lapse fluorescenza a lungo termine. L'applicazione di questo metodo a dosaggi farmacologici inoltre è discussa.

Cella singola risoluzione fluorescenza Live Imaging di Drosophila orologi circadiani nel cervello larvale cultura

Questo articolo descrive un protocollo per l'ex vivo imaging del calcio del cervello di Drosophila . In questo metodo, composti naturali o sintetiche possono essere applicati il buffer per testare la loro capacità di attivare particolari neuroni nel cervello.

Ex Vivo Calcio Imaging per visualizzare le risposte del cervello alla segnalazione endocrina in Drosophila

È stato stabilito un metodo per riattivare le cellule staminali neurali quiescenti negli espianti cerebrali di Drosophila in coltura. Utilizzando questo metodo, il ruolo dei segnali sistemici può essere disaccoppiato dai segnali intrinseci del tessuto nella regolazione della quiescenza, dell'ingresso e dell'uscita delle cellule staminali neurali.

Riattivazione delle cellule staminali neurali negli espianti cerebrali di Drosophila in coltura

Impara la coltura ex vivo di cervelli di Drosophila in sviluppo per studiare la neurobiologia del corpo fungoide. Questa tecnica consente analisi ad alta risoluzione dei processi di sviluppo neuronale.

Ex coltura vivo di Whole, in via di sviluppo Brains Drosophila

Esplora altri video