Name: Progenitore di derivazione Sistema Cultura Oligodendrocyte dal cervello umano fetale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Scopri il protocollo per differenziare progenitori neurali fetali umani in oligodendrociti in vitro. Questo metodo genera popolazioni pure senza cellule di supporto, ideale per studiare biologia e malattie della mielina.

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Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale presso il National Institutes of Health, NINDS. Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del Laboratorio di Medicina Molecolare e Neuroscienze, Rick Dreyfuss per aiutare con la microscopia e Pamela Vagliatura C. per l&#39;aiuto con la redazione.

Nota: per la coltura di routine di progenitrici neurali e cellule della linea oligodendrocitario, incubazione avviene a 37 ° C in un umidificata al 5% di CO 2 nell&#39;atmosfera. Ogni 2 giorni, il mezzo viene sostituito con 50 a 100% di mezzo fresco se la cultura è 40-70% confluenti. Al momento della confluenza vicino, le colture sono diversi passaggi a 2-2.5e6/T75 pallone di solito su una pianificazione settimanale. 1. Preparazione del Flask Coated <ol><li> Per preparare fiasche rivestite diluire 5 mg di poli-D-lisina (PDL) in 100 ml di acqua deionizzata (DI-acqua), poi cappotto fiasche T75 con 50 ug / ml di PDL a temperatura ambiente (RT) al buio. Dopo 1 ½ ora, aspirare il Pdl e risciacquare i palloni una volta con acqua demineralizzata. Lasciate le fiasche secco prima della semina delle cellule (Tabella 1). </li></ol> 2. Avvio di differenziazione delle cellule progenitrici neurali in oligodendrociti progenitrici derivate (DOP) Il protocollo èOlate cellule progenitrici del SNC è descritto in una precedente pubblicazione e non è parte di questo protocollo 1. Le cellule progenitrici del sistema nervoso centrale sono stati isolati dal telencefalo di un 8 settimane di gestazione il cervello del feto, ottenuto in accordo con le linee guida NIH. <ol><li> Crescere multipotenziale popolazione di cellule progenitrici neurali sul PDL fiasche rivestite in media Neurobasal supplementato con 25 ng / ml di bFGF e 20 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF) (Figura 1A). Non usarli se maggiore di passaggio 11 (p11). </li><li> Iniziare a differenziare le cellule progenitrici neurali, quando la cultura è di circa il 70% confluenti. </li><li> Rendere terreno completo differenziazione oligodendrociti utilizzando DMEM privo di siero / PROSCIUTTI F12 medie 01:01 supplementato con albumina di siero bovino, L-glutammina, gentamicina, componenti N2, T3, Shh, NT-3, bFGF e PDGF-AA (Tabella 1) . Questo terreno sarà definita come supporto oligo con fattori di crescita (oligo media + GF). </li><li> Rimuovere Progensupporto Itor dai fiaschi, lavare le cellule una volta con tampone fosfato salino (PBS), quindi aggiungere mezzo di oligo + GF (dettagli descritti al punto 2.3) per avviare la differenziazione degli oligodendrociti. Solo le cellule impegnate nella stirpe oligodendrocitario crescerà (Figura 1B). Cultura le cellule in questo mezzo per 3 settimane. </li><li> Ogni settimana, quando le cellule sono a 90-95% di confluenza, passaggio usando tripsina (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml per una beuta T75). Trasferire il mezzo intero dalle cellule da diversi passaggi in una provetta da 50 ml; questo mezzo condizionato viene utilizzata per estinguere la tripsina. Assicurarsi di non asciugare le cellule. Quindi aggiungere tripsina. </li><li> Incubare le cellule in tripsina per 5 min a RT, delicatamente la beuta volte per aiutare distacco cellulare. </li><li> Quench la tripsina con l&#39;aggiunta di 4-5 mL di terreno condizionato al pallone con le cellule distaccate. </li><li> Trasferire il mezzo e le cellule allo stesso tubo da 50 ml. Centrifugare il mezzo e le cellule a 1.200 giri al minuto (~300 xg) per 5 min a RT. </li><li> Aspirare il surnatante, risospendere il pellet cellulare, con delicatezza ribaltare il tubo, e quindi aggiungere fresche medie oligo + GF. Delicatamente medie pipetta e cellule su e giù per fare una sospensione uniforme cella. </li><li> Contare le cellule, e 2.5e6 trasferimento in ogni nuovo PDL rivestita T75 pallone. </li></ol> 3. Fase finale nella differenziazione degli oligodendrociti <ol><li> Dopo 3 settimane di coltura in oligo media + GF, quando le cellule sono a 70-80% di confluenza, avviare il processo finale di differenziazione (Figura 1C). </li><li> Preparare media nello stesso modo come il mezzo oligo + GF ma senza aggiungere il quattro GF: Shh, NT-3, bFGF e PDGF-AA. Questo mezzo senza il GF quattro saranno definita come supporto di oligo - GF. </li><li> Aspirare il mezzo oligo + GF dal pallone, sciacquare una volta con PBS e quindi aggiungere un volume totale di 16 ml di terreno, di cui ¾ (12 ml) è oligo medio - GF e ¼ (4 ml) è medio PDN condizionato, per 6-10 Giorni). L&#39;uso di mezzo condizionato da PDN non è critico per il processo di differenziazione o la sopravvivenza delle cellule. Abbiamo infatti osservato che solo il contatto diretto con le cellule di PDO PDN in esperimenti di co-coltura ha avuto un effetto sulla durata della sopravvivenza DOP. Il tempo di sopravvivenza medio di oligo - GF poteva essere prolungata per due o tre settimane se le cellule DOP sono co-coltura con cellule PDN. Il protocollo di differenziare cellule progenitrici neurali in PDN è descritto in una precedente pubblicazione e non è parte di questo protocollo 1. La crescita fattore di ritiro dai risultati medi di coltura della cultura progressivamente differenziate di cellule con processi multipli (Figura 1D). </li></ol> 4. Citometria a Flusso del test Il saggio citofluorimetria confronta l&#39;acquisizione di marcatori oligodendrociti durante il processo di differenziazione in rapporto con quelli della popolazione parentale. <ol><li> Usa pro neuralegenitors il controllo. Seme cellule DOP a 2.5x10 6 celle in due palloni T75 rivestite con poli-D-lisina in oligo medie + GF. </li><li> Una settimana dopo, sostituire media con fresca media oligo + GF in fusti come una cultura di controllo per la vitalità delle cellule, mentre altri contenitori avuto oligo medio - GF. </li><li> Dissociare cellule DOP in entrambi i mezzi utilizzare 20 U / ml di papaina e non tripsina. Questo perché papaina ha un effetto più delicato sulle cellule durante la dissociazione preservare la morfologia cellulare. </li><li> Aggiungere 5 ml di soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS) in una fiala papaina. Posizionare il flacone a 37 ° C per 10 minuti o fino a quando la papaina è completamente sciolto e la soluzione appare chiara. Questa è la soluzione di papaina utilizzata per dissociare le cellule. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di EBSS ad un Deoxyribonuclease I (DNasi) flaconcino (Tabella 1). Mescolare delicatamente. Aggiungere 0,25 ml di questa soluzione nel flacone di papaina disciolto. Questo preparato contiene una concentrazione finale di circa 20 U / ml di papaina e 00,005% DNasi. </li><li> Soluzione luogo papaina (come descritto sopra) sulle cellule e incubare a 37 ° C per 15-30 min, monitorare il distacco delle cellule usando un microscopio. Interrompere la reazione con 5 ml di terreno con o senza GF e centrifugare a 1200 rpm per 7 min. </li><li> Trasferire pellet cellulari da entrambi flaconi in due differenti 5 ml provette di polipropilene e lavarli con normale media fisiologica (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, Hepes 10 mM e 10 mM di glucosio) supplementato con 1 mg / ml albumina di siero bovino (BSA NPM +). </li><li> Eseguire superficie immunocolorazione a 4 ° C per 20 minuti usando anticorpi primari specifici e adeguatamente titolata per A2B5, O4, GALC (Tabella 2). </li><li> Lavare le cellule con NPM + BSA a 4 ° C per 5 minuti e incubare con specifici anticorpi secondari a 4 ° C per 20 min (Tabella 2). </li><li> Per macchia antigeni intracellulari tra cui nestina, proteina acida fibrillare gliale (GFAP), classe III e essereta,-tubulina, e la proteina basica della mielina (MBP) (Tabella 2), fissare le cellule in 2% paraformaldeide (PFA) per 20 minuti a RT e permeabilize freddo con etanolo al 70% per 15 min a -20 ° C. </li><li> Lavare le cellule con PBS 1x e incubare con specifici anticorpi secondari (Tabella 2). </li><li> Per discriminare tra cellule intatte e detriti subcellulare durante l&#39;analisi di citometria a flusso, colora le cellule con 4,6-Diamidino-2-phenyllindole, cloridrato (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> In ottimizzare il protocollo di cui sopra, abbiamo eseguito tutti gli esperimenti di controllo necessarie per confermare la specificità di ogni immunoreagenti. Brevemente, per gli anticorpi marcati direttamente, il controllo appropriato negativo era un anticorpo direttamente coniugato della stessa classe isotipo di immunoglobuline (o sottoclasse) e coniugato con fluorocromo come anticorpo primario (cioè il controllo di isotipo). Per immunostaining indiretto di anticorpi primari, l&#39;appropriato controllo negativo wcome anticorpo secondario coniugato con il fluorocromo di interesse che specificamente mirato alla classe di immunoglobuline (o sottoclasse) del ospite in cui è stato generato l&#39;anticorpo primario. Quando gli anticorpi primari da più host (topo, coniglio, pollo) sono stati utilizzati insieme, abbiamo utilizzato l&#39;anticorpo secondario di mira l&#39;anticorpo primario di ogni host e ogni anticorpo secondario utilizzato è stato in genere cross-adsorbito contro le immunoglobuline dagli altri host per ridurre al minimo cross- ospitare immunoreattività. I controlli positivi inclusi immunostaining diretta o indiretta di preparazioni cellulari note per esprimere gli antigeni di interesse utilizzando sia immunoreazioni diretto o indiretto con gli anticorpi primari specifici per questi antigeni. I metodi di ottimizzazione sopra sono state eseguite una volta per ogni tipo di immunocolorazione esperimenti. Immunoreazioni di controllo ha evidenziato alcuna significativa cross-epitopo immunoreattività tra gli anticorpi primari e secondari. Citometria di flusso è stata eseguita su uniformementesospesi cellule contrassegnati in modo fluorescente utilizzando una cella FACVantage SE sorter (BD Biosciences, San Jose, CA) dotato di tre laser, che forniscono lunghezze d&#39;onda di eccitazione 488 nm sintonizzate, 647 nm, e un ampio UV (351-364 nm) (Figura 2) . </li></ol> 5. Test di immunofluorescenza Nota: Per gli esperimenti di immunofluorescenza, DOP sono placcati in oligo media + GF o oligo medio - GF a 2.5e5 in piastre da 6 pozzetti rivestiti con PDL. Le cellule vengono fissate in 2% PFA in vari momenti dopo il prelievo di fattori di crescita. L&#39;anticorpo macchia viene eseguita su piastre da 6 pozzetti di plastica anziché coprioggetto. <ol><li> Rimuovere il supporto e aggiungere il 2% PFA. Incubare per 10 minuti a RT. Eliminare PFA. Lavare le cellule per 3 volte con PBS, 5 min ciascuna volta. Fare attenzione a non asciugare le cellule. </li><li> Permeabilize cellule per marcatori intracellulari mediante soluzione di Triton 0,25% in PBS per 10 minuti a RT. </li><li> Per prevenire il legame non specifico, cellule blocco fo 10 min con HHG (1 mM tampone HEPES, 2% siero di cavallo, e siero di capra 10% in soluzione salina bilanciata di Hanks &#39;). Diluire specifici anticorpi primari (Tabella 2) per una predeterminata concentrazione HHG. Posizionare anticorpi diluiti su cellule. Incubare per 1 ora a RT l&#39;agitatore o a 4 ° C per una notte. </li><li> Lavare le cellule per 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta. Diluire appropriati anticorpi secondari (Tabella 2) accoppiato con un fluorocromo ad una predeterminata concentrazione HHG. Mettere la miscela di anticorpi secondari diluiti su cellule. Incubare per 1 ora a RT su un agitatore nel buio. </li><li> Lavare le cellule per 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta. </li><li> Per evitare la fotodecolorazione aggiungere 10 ml di prolungare oro con DAPI per le cellule e mettere un coprioggetto di vetro su di essi. Visualizzare le cellule marcate usando un microscopio a fluorescenza Axiovert 200M (Zeiss, Thornwood, NY) (Figura 3). </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo descrive come oligodendrociti fetali derivare da cellule primarie umane progenitrici neurali e caratterizzare il loro fenotipo utilizzando sia citometria di flusso e colorazione di immunofluorescenza. L&#39;espansione e la crescita dei progenitori neurali fetali da CNS è stata molto ben descritta 1-4. Tuttavia, ottenere sufficienti oligodendrociti umani per la sperimentazione in vitro resta difficile, anche se è possibile identificare e isolare precursori gliali da materiale umano a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> DME / PROSCIUTTI F12 01:01 </td><td> Omega Scientist </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Albumina bovina </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Qualità Biologicals </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> Qualità Biologicals </td><td> 118-084-061 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> T3 </td><td> Sigma </td><td> T2877 </td><td> 3 Nm </td></tr><tr><td> N2 Componenti </td><td> Gibco BRL </td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> Peprotech Inc </td><td> 450-03 </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> Shh </td><td> R &amp; D System </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Peprotech Inc </td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> Peprotech Inc </td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> PDL </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td><td> 50 ug / m </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 15712 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Qualità Biologicals </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> Papaina </td><td> Worthington </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ml </td></tr><tr><td> DNasi fiale </td><td> Worthington </td><td> LK003172 </td><td> 0,005% </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> Worthington </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> Prolong Oro conDAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Reagenti. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Primaria Abs (tutti a 1 pg / ml) </td><td></td><td> Specie Isotype </td><td> Fonte </td><td> Secondaria Abs </td></tr><tr><td colspan="5"> Citometria a Flusso </td></tr><tr><td> A2B5-Biotina </td><td> Mouse </td><td> IgM </td><td> Regalo J. Nielson </td><td> Streptavidina PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> Mouse </td><td> IgM </td><td> Regalo da J. Nielson </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Mouse </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> Mouse </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GALC </td><td> Mouse </td><td> IgG 3 </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG 3-PE, Southern Biotech, AL </td></tr><tr><td> MBP </td><td> Pollo </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> Mouse </td><td> IgG 1 </td><td> Messam et al. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Coniglio </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA </td></tr><tr><td> βIII tubulina </td><td> Mouse </td><td> IgG 2 </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2 a-PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> Immunocitochimica </td></tr><tr><td> βIII tubulina (1:1,500) </td><td> Mouse </td><td> IgG 2a </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> Coniglio </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1:50) </td><td> Pollo </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> Mouse </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GALC (1:10) </td><td> Coniglio </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> Anticorpi Tabella 2 (Abs) utilizzati per la citometria a flusso e saggi di immunocitochimica coniugati per l&#39;anticorpo: PE, ficoeritrina, PETR, ficoeritrina Texas Red, AMCA, ammino-metil-cumarina-acetato, Cy, cianinico, FITC, isotiocianato di fluorescina Ig:.. Immunoglobuline. . AF: Alexa Fluor; gαm: capra anti-topo; gαrb: capra anti-coniglio; dαck: asino anti-pollo. </td></tr></tbody></table>

progenitore di derivazione sistema cultura oligodendrocyte dal cervello umano fetale

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

La differenziazione dei progenitori neurali umane in tipi di cellule neuronali e gliali offre un modello da studiare e confrontare regolazione molecolare dello sviluppo neurale linea cellulare. Espansione in vitro di progenitori neurali da tessuto fetale CNS è stato ben caratterizzato. Nonostante l&#39;identificazione e l&#39;isolamento di progenitori gliali da umano adulto sub-corticale della sostanza bianca e lo sviluppo delle diverse condizioni di coltura per la differenziazione diretta di progenitori neurali fetali in oligodendrociti che producono mielina, l&#39;acquisizione di sufficienti oligodendrociti umani per la sperimentazione in vitro rimane difficile. Differenziazione dei galactocerebroside + (GALC) e O4 + precursori degli oligodendrociti o cellule progenitrici (OPC) da cellule precursori neurali è stato segnalato con secondo cervello fetale trimestre. Tuttavia, queste cellule non proliferano in assenza di cellule di supporto tra astrociti e neuroni, e si perdono rapidamente nel tempo in cultura. Rimane la necessità di un sistema di coltura per produrre cellule della linea oligodendrocyte adatto per la sperimentazione in vitro. Cultura di oligodendrociti primari umani potrebbe, per esempio, essere un modello utile per studiare la patogenesi di neurotropici agenti infettivi come il poliomavirus umano, JCV, che in vivo infetta le cellule. Queste cellule coltivate potrebbe anche fornire modelli di altre malattie demielinizzanti del sistema nervoso centrale (CNS). Primaria, fetale umano derivato dal cervello, le cellule progenitrici multipotenti neurali proliferano in vitro, pur mantenendo la capacità di differenziarsi in neuroni (cellule progenitrici derivate da neuroni, PDN) e astrociti (cellule progenitrici derivate da astrociti, PDA) Questo studio mostra che progenitori neurali può essere indotta a differenziare attraverso molte delle fasi di sviluppo lignaggio oligodendrocitario (progenitrici derivate oligodendrociti, DOP). Noi cellule progenitrici neurali in coltura DMEM-F12 senza siero dei media suptegrato con fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), il fattore di crescita derivato piastrine (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), fattore neurotrofico 3 (NT-3), N-2 e triiodotironina (T3). Le cellule coltivate sono diversi passaggi in cellule 2.5e6 per fiaschi 75 centimetri circa ogni sette giorni. Utilizzando tali condizioni, la maggior parte delle cellule in coltura mantenere una morfologia caratterizzata da alcuni processi e marcatori espresse del pre-cellule oligodendrociti, come A2B5 e O-4. Quando rimuoviamo i quattro fattori di crescita (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) e aggiungere mezzo condizionato da PDN, le cellule iniziano ad acquisire più processi e indicatori esprimono specifici di differenziazione degli oligodendrociti, come GALC e la mielina proteina basica (MBP). Abbiamo eseguito la caratterizzazione fenotipica in citometria a flusso multicolore di identificare indicatori unici di oligodendrociti.

E &#39;molto importante per avviare il processo di differenziazione da un 70% -80% coltura confluente di cellule progenitrici neurali (Figura 1A). Molte cellule si estinguerà dopo aver cambiato il mezzo di coltura da capostipite a medio oligo poiché include fattori di crescita specifici. Questo indica che la crescita di cellule progenitrici neurali non impegnati ad un fenotipo oligodendrocitario non sarà supportato dal nuovo mezzo (Figura 1B). Incubazione in mezzo oligo + GF per una set...

Primaria, umani fetali di derivazione cerebrale, le cellule progenitrici multipotenti proliferano<em&gt; In vitro</em&gt; Pur mantenendo la capacità di differenziarsi in neuroni e astrociti. Questo lavoro dimostra che progenitori neurali possono essere indotte a differenziarsi attraverso le fasi della linea oligodendrocitario dal condizionamento con fattori di crescita selezionati.

Progenitore di derivazione Sistema Cultura Oligodendrocyte dal cervello umano fetale

La differenziazione dei progenitori neurali umani in tipi cellulari neuronali e gliali offre un modello per studiare e confrontare la regolazione molecolare dello sviluppo delle linee cellulari neurali. L'espansione in vitro di progenitori neurali derivanti da tessuto fetale del SNC è stata ampiamente caratterizzata. Nonostante l'identificazione e l'isolamento di progenitori gliali dalla sostanza bianca sottocorticale umana adulta e lo sviluppo di varie condizioni di coltura per indirizzare la differenziazione dei progenitori neurali fetali in oligodendrociti produttori di mielina, l'acquisizione di un numero sufficiente di oligodendrociti umani per la sperimentazione in vitro rimane difficile. È stata riportata la differenziazione di cellule precursori o progenitrici degli oligodendrociti (OPC) GalC+ (galattocerebroside+) e O4+ a partire da cellule precursori neurali utilizzando cervello fetale del secondo trimestre. Tuttavia, tali cellule non proliferano in assenza di cellule di supporto, tra cui astrociti e neuroni, e vengono rapidamente perse nel tempo in coltura. Permane dunque la necessità di un sistema di coltura per produrre cellule della linea oligodendrocitaria idonee alla sperimentazione in vitro. La coltura di oligodendrociti umani primari potrebbe, ad esempio, essere un modello utile per studiare la patogenesi di agenti infettivi neurotropi come il poliomavirus umano, JCV, che in vivo infetta tali cellule. Queste cellule coltivate potrebbero inoltre fornire modelli per altre malattie demielinizzanti del sistema nervoso centrale (SNC). Le cellule progenitrici neurali multipotenziali primarie, derivate da cervello fetale umano, proliferano in vitro mantenendo la capacità di differenziarsi in neuroni (neuroni derivati da progenitori, PDN) e astrociti (astrociti derivati da progenitori, PDA). Questo studio dimostra che i progenitori neurali possono essere indotti a differenziarsi attraverso molte delle fasi dello sviluppo della linea oligodendrocitaria (oligodendrociti derivati da progenitori, PDO). Coltiviamo le cellule progenitrici neurali in terreno DMEM-F12 privo di siero, integrato con fattore di crescita dei fibroblasti basico (bFGF), fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), fattore neurotrofico 3 (NT-3), N-2 e triiodotironina (T3). Le cellule coltivate vengono passate a una densità di 2,5e6 cellule per flacon da 75 cm circa ogni sette giorni. Utilizzando queste condizioni, la maggior parte delle cellule in coltura mantiene una morfologia caratterizzata da pochi processi ed esprime marcatori di cellule pre-oligodendrocitarie, come A2B5 e O-4. Quando rimuoviamo i quattro fattori di crescita (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) e aggiungiamo terreno condizionato da PDN, le cellule iniziano ad acquisire più processi ed esprimono marcatori specifici della differenziazione oligodendrocitaria, come GalC e proteina basica della mielina (MBP). Abbiamo effettuato la caratterizzazione fenotipica mediante citometria a flusso multicolore per identificare i marcatori univoci degli oligodendrociti.

Questo video illustra un metodo per la differenziazione di cellule progenitrici neurali primarie fetali umane in oligodendrociti. Innanzitutto, le cellule progenitrici neurali vengono coltivate in un mezzo per progenitori fino a raggiungere una confluenza quasi completa. Il mezzo per progenitori viene quindi sostituito con un mezzo per oligodendrociti, integrato con fattori di crescita che promuovono il processo di differenziazione. Le cellule vengono successivamente coltivate ed espanse per tre settimane.Il mezzo per oligodendrociti integrato con fattori di crescita viene quindi sostituito con mezzo per oligodendrociti privo di fattori di crescita, e le cellule vengono coltivate per ulteriori sei-dieci giorni fino a quando non si osservano cambiamenti fenotipici mediante microscopia. La differenziazione viene successivamente confermata mediante microscopia a fluorescenza e citometria a flusso, utilizzando anticorpi specifici per la linea degli oligodendrociti. Infine, gli oligodendrociti differenziati con successo possono essere utilizzati per studi in vitro sulla biologia degli oligodendrociti e sulle loro interazioni con agenti infettivi come il poliomavirus umano JCV.Uno dei veri vantaggi della tecnica che abbiamo sviluppato in questo laboratorio, rispetto a quanto già presente nella letteratura scientifica, è che nel nostro sistema gli oligodendrociti possono essere coltivati e differenziati senza la necessità di cellule di supporto come astrociti e neuroni. Un altro vantaggio del nostro protocollo, secondo noi, è che consente di coltivare un elevato numero di questi precursori di oligodendrociti che esprimono marcatori come OH4 e che possono essere mantenuti in coltura per molte settimane, espandendosi in popolazioni cellulari numerose pur mantenendo il loro fenotipo. Il risultato finale della differenziazione ci fornisce quasi una popolazione pura di oligodendrociti.Abbiamo concepito per la prima volta l'idea di questo metodo leggendo la vasta letteratura sulla differenziazione in vitro di oligodendrociti in cellule di ratto e mie. Altri ricercatori stavano inoltre rimuovendo i fattori di crescita da colture ristrette al fine di completare la differenziazione cellulare. Questa procedura sarà dimostrata secondo il nostro protocollo da Alexa Bandon, una studentessa universitaria del nostro laboratorio qui presso il N-I-N-D-S.In previsione della differenziazione, coltivare una popolazione multipotente di cellule progenitrici neurali in fiaschi rivestiti con polilisina, utilizzando un mezzo basale neurale integrato con BFGF ed EGF, scartando tutte le cellule non utilizzate. Dopo 11 giorni, quando la coltura raggiunge una confluenza approssimativa del 70-80%, avviare la differenziazione. A tale scopo, aspirare il mezzo di coltura progenitore dai fiaschi.Lavare le cellule una volta con PBS e quindi aggiungere 12 millilitri di mezzo oligo con fattori di crescita. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un'incubatrice umidificata con anidride carbonica al 5%. Dopo una settimana, le cellule rimanenti mostreranno una morfologia bipolare stretta.Una volta che le cellule differenziate raggiungono almeno il 70% di confluenza, rimuovere il mezzo e trasferirlo in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Mettere da parte il mezzo condizionato conservato per un uso successivo. Quindi aggiungere rapidamente quattro millilitri di tripsina 0,05%, EDTA 0,1% alle cellule e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.Battere leggermente il pallone diverse volte per favorire il distacco delle cellule. Al termine dell'incubazione, arrestare la tripsinizzazione aggiungendo quattro o cinque millilitri del mezzo condizionato salvato al pallone. Successivamente, trasferire il mezzo e le cellule nel tubo conico da 50 millilitri.Quindi centrifugare il mezzo e le cellule a 310 RCF per sette minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, aspirare il sopranatante. Ri-sospendere il pellet cellulare agitando delicatamente il tubo e quindi aggiungere mezzo oligo fresco con fattori di crescita.Pipettare delicatamente su e giù il mezzo e le cellule per ottenere una sospensione cellulare uniforme. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Successivamente, trasferire 2,5 milioni di cellule in nuove fiale T75 rivestite di polilisina e coltivare in incubatore; dopo tre settimane, quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80-85%, aspirare il mezzo oligo contenente i fattori di crescita dalla fiala.Risciacquare una volta con PBS, quindi aggiungere 12 millilitri di mezzo con oligo senza fattori di crescita e 4 millilitri di mezzo non condizionato derivato da progenitori neuronali. Mantenere le cellule in questo mezzo per 6-10 giorni a giorni alterni. Esaminare le cellule mediante microscopia a contrasto di fase per valutare la differenziazione e la confluenza e sostituire almeno il 50% del mezzo dopo la rimozione dei fattori di crescita; le cellule svilupperanno progressivamente numerosi prolungamenti, indicando una corretta differenziazione in oligodendrociti derivati da progenitori.A questo punto, gli oligodendrociti derivati dai progenitori possono essere utilizzati per esperimenti di citometria a flusso o di immunofluorescenza come descritto nelle prossime sezioni di questo video. Il saggio di citometria a flusso confronta l'acquisizione di marcatori specifici degli oligodendrociti durante il processo di differenziazione in relazione a quelli della popolazione parentale. Le cellule progenitrici neurali umane vengono utilizzate come controllo C. 2,5 milioni di cellule oligodendrocitiche derivate da progenitori in ciascuno di due fiaschi T 75 rivestiti con poli-d-lisina, coltivati nel mezzo oligo con fattori di crescita, incubati a 37 gradi Celsius. Una settimana dopo, sostituire il mezzo in un fiasco con mezzo oligo fresco contenente fattori di crescita come controllo per la vitalità cellulare.Sostituire il mezzo nel secondo flacone con mezzo oligo fresco senza fattori di crescita. Coltivare queste cellule fino a 10 giorni; da tre a nove giorni dopo la rimozione dei fattori di crescita, le cellule inizieranno ad acquisire processi più tipici di un fenotipo di oligodendrocita. Per dissociare le cellule oligodendrocitarie derivate da progenitori, aspirare il mezzo e aggiungere 5,25 millilitri di soluzione perian a ciascun flacone.Perian viene utilizzato al posto della tripsina perché ha un effetto più delicato sulle cellule durante la dissociazione. Per preservare la morfologia cellulare, incubare a 37 gradi Celsius per 15-30 minuti. Controllare periodicamente il distacco delle cellule utilizzando un microscopio.Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere cinque millilitri di mezzo con o senza fattori di crescita per arrestare la reazione. Successivamente, trasferire il contenuto di ogni fiasca in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare le provette a 310 RCF per sette minuti a temperatura ambiente; al termine della centrifugazione, aspirare il sopranatante e risospendere i pellet cellulari in quattro millilitri di mezzo fisiologico normale, integrato con un milligrammo per millilitro di albumina sierica bovina o NPM più BSA.Quindi contare le cellule come in precedenza e, per ogni condizione di immunomarcatura, sospenderne 1 milione in un tubo in polipropilene da cinque millilitri. Assicurarsi di includere tutti i controlli appropriati per confermare la specificità di ciascun reagente immunitario. Successivamente, per eseguire l'immunomarcatura, le cellule vengono prima incubate con anticorpi diretti contro le proteine di superficie A2B5, O4 e GalC. Le cellule vengono quindi lavate per rimuovere gli anticorpi primari non legati e incubate con gli opportuni anticorpi secondari marcati con fluorocromo.Le cellule vengono quindi lavate nuovamente per rimuovere gli anticorpi secondari. Fissate con paraformaldeide al 2% e permeabilizzate con etanolo freddo al 70%, le cellule vengono successivamente lavate e incubate con anticorpi contro nestina, proteina acida fibrillare gliale, tubulina beta classe III e proteina basica della mielina. Dopo il lavaggio degli anticorpi primari non legati.Le cellule vengono incubate con gli opportuni anticorpi secondari marcati con fluorocromo. Infine, al fine di discriminare tra cellule integre e frammenti subcellulari durante l'analisi di citometria a flusso, le cellule vengono sottoposte a quattro sei DIA medino. Due fenolo Lind diidrocloruro o dappy eseguono la citometria a flusso su uno strumento dotato di tre laser, che forniscono lunghezze d'onda di eccitazione regolate a 488 nanometri, 647 nanometri e una luce UV ampia. In preparazione alla microscopia a immunofluorescenza, preparare sei rivestimenti di poli-D-lisina.Piastre a sei pozzetti con 250.000 cellule di oligodendrociti derivati da progenitori per pozzetto. Sono necessarie due piastre per ogni punto temporale. Una viene coltivata con fattori di crescita e una senza, quando le cellule raggiungono una confluenza del 70-80%.Aspirare il mezzo contenente i fattori di crescita dalla piastra. Sciacquare una volta con PBS e quindi aggiungere 12 millilitri di mezzo privo di fattori di crescita. Eseguire la colorazione immunoistochimica a cinque e nove giorni dall'eliminazione dei fattori di crescita come segue: prima di tutto, fissare le cellule con PFA al 2% per 10 minuti a temperatura ambiente.Successivamente, scartare la PFA e lavare le cellule tre volte con PBS per cinque minuti ogni volta. Quindi trattare le cellule con tritone 0,25% e successivamente bloccare le cellule con siero di cavallo al 2% e siero di capra al 10% per prevenire il legame non specifico. Dopo il blocco, incubare le cellule con anticorpi diretti contro la beta tre tubulina, G-F-A-P-M-V-P oh quattro e gal C. Lavare quindi gli anticorpi non legati dalle cellule e incubare le cellule con gli opportuni anticorpi secondari marcati con fluorocromo.Lavare gli anticorpi secondari non legati dalle cellule e quindi evitare il fotoblecamento e la distinzione. Montare il nucleo. Coprire con un cover slip utilizzando 10 microlitri di prolungato gold con dpi.Visualizzare le cellule marcate utilizzando un microscopio a fluorescenza con il set di filtri appropriato per determinare se le cellule progenitrici neurali primarie umane potessero differenziarsi in oligodendrociti. Le cellule progenitrici neurali multipotenti sono state coltivate come descritto in questo video. I cambiamenti fenotipici sono stati quindi monitorati mediante citometria a flusso e microscopia a immunofluorescenza.Come si può vedere qui, la maggior parte dei progenitori neurali esprime il marcatore delle cellule staminali neuroepiteliali nesting, mentre solo piccole sottopopolazioni esprimono marcatori specifici per linea, come il marcatore degli astrociti GFAP, il marcatore neuronale beta-tubulina di classe tre o il marcatore degli oligodendrociti oh four. Quando il mezzo di coltura è stato sostituito con mezzo oligo aggiunto di fattori di crescita e le cellule sono state coltivate per una settimana, dopo due settimane si è osservata una riduzione dell'espressione di nesting e un aumento dell'espressione di A two B five.L'espressione di Nesting è ulteriormente diminuita e l'espressione del marcatore del precursore neurogliale A due B cinque è aumentata; anche l'espressione di un altro marcatore dell'oligodendrocita oh quattro è aumentata due giorni dopo la rimozione del fattore di crescita. L'espressione di oh quattro e quella di GAL C, un marcatore tardivo dell'oligodendrocita, sono aumentate sei giorni dopo la rimozione del fattore di crescita. La co-espressione di oh quattro e gal C è aumentata ed è risultata paragonabile alla co-espressione di gal C e MBP.La colorazione immunoistochimica multiepitopo rivela che il 72% delle cellule in coltura esprimeva MBP. Un'ulteriore evidenza della differenziazione degli oligodendrociti derivati dai precursori è stata ottenuta mediante un saggio di immunofluorescenza. Due giorni dopo la rimozione dei fattori di crescita, è stata rilevata l'espressione di MVP, mostrata in verde.Questo valore è aumentato al quinto giorno ed è ulteriormente aumentato al nono giorno. È evidente la localizzazione di MVP negli oligodendrociti differenziati. Nel complesso, questi dati indicano che colture di cellule progenitrici neurali fetali umane, ottenute con il metodo descritto, sono in grado di proliferare in vitro mantenendo la capacità di differenziarsi attraverso le fasi della linea oligodendrogliale.Successivamente allo sviluppo di questo protocollo, la tecnica consente effettivamente ai ricercatori nei campi della biologia dello sviluppo, neuroscienze e virologia di studiare la biologia del cervello umano e le malattie che colpiscono il cervello umano, in particolare quelle che provocano malattie della sostanza bianca.

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