Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di rilevare e identificare i batteri utilizzando sensori elettrochimici. Ciò si ottiene rilasciando prima l'RNA ribosomiale dai batteri per consentire l'ibridazione con la sonda del rivelatore fluorurato Come secondo passo, l'RNA ribosomiale legato alla sonda del rivelatore viene aggiunto all'elettrodo di lavoro, che consente l'ibridazione con la sonda di cattura sulla superficie del sensore. Successivamente, il coniugato perossidasi di rafano anti fluoresceina può legarsi alla sonda del rivelatore fluorurato.

Infine, nella corrente interferometrica, la cui intensità è correlata al numero di sonde di cattura ribosomiali, si possono ottenere complessi di sonde rivelatori di RNA sulla superficie del sensore. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi basati sulla coltura è che i batteri possono essere rilevati e identificati in circa 45 minuti, evitando il peso notturno. Per un batterio formare una colonia visibile su una piastra EDGAR L'applicazione di questa tecnica migliorerebbe la gestione delle malattie infettive.

Poiché la diagnosi precoce dei patogeni batterici è essenziale per una terapia antibiotica mirata e per migliorare i risultati clinici. Sebbene questo metodo sia utile per la diagnosi di malattie infettive, può essere applicato anche ad altri problemi diagnostici come l'immunodiagnosi. Iniziare incubando la sonda di cattura dilatata con esano di tiolo per 10 minuti a temperatura ambiente per assicurarsi che il gruppo tiolico sulla sonda di cattura sia ridotto, ottenendo risultati più coerenti.

Dopo l'incubazione, applicare un flusso di azoto per portare l'oro. 16 chip dell'array di sensori per cinque secondi per rimuovere l'umidità o il particolato, piccoli volumi di liquido devono essere applicati con cura all'elettrodo di lavoro nell'array di sensori. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale.

Poiché l'esecuzione corretta delle tecniche di pipettaggio, lavaggio e asciugatura riduce notevolmente la variabilità da truciolo a truciolo. Quindi, applicare sei microlitri della miscela di sonda a cattura dilatata HDT sull'elettrodo di lavoro di tutti i 16 sensori dell'array di sensori e conservare i chip del sensore in una capsula di Petri coperta a quattro gradi Celsius durante la notte del giorno successivo, lavare i chip del sensore con acqua deionizzata per due o tre secondi, quindi asciugare i chip sotto un flusso di azoto per cinque secondi. Applicare ora sei microlitri di acido cloridrico di sodio adottorato, soluzione EDTA MERCAPTOETANOLO all'elettrodo di lavoro di tutti i 16 sensori e incubare i sensori per 50 minuti in una capsula di Petri a temperatura ambiente.

Per preparare i campioni per il test del sensore elettrochimico. Trasferire un millilitro di coltura batterica nella fase logaritmica di crescita in una provetta da microcentrifuga, quindi centrifugare le cellule per cinque minuti a 16.000 g. Si prega di notare che i batteri patogeni devono essere maneggiati in una cappa di biosicurezza.

Dopo aver rimosso lo snat, applicare un puntale per pipetta contenente 10 microlitri di idrossido di sodio molare sul fondo della provetta per microcentrifuga e pipettare su e giù alcune volte per risospendere completamente il pellet. Dopo aver incubato la sospensione a temperatura ambiente per cinque minuti, aggiungere 50 microlitri di PBS contenente albumina sierica bovina o BSA e una sonda rivelatrice modificata con fluoresceina per neutralizzare il lisato batterico. Quindi incubare il lisato neutralizzato per 10 minuti a temperatura ambiente.

Iniziare questo passaggio lavando la soluzione di mercaptoetanolo da uno dei chip del sensore preparati con acqua deionizzata per due o tre secondi. Dopo aver asciugato il truciolo come appena dimostrato, applicare quattro microlitri di lisato batterico neutralizzato sugli elettrodi di lavoro. 14 dei sensori.

Quindi applicare quattro microlitri dell'oligonucleotide ponte nella sonda del rivelatore modificato PBS più BSA più fluoresceina ai due sensori di controllo positivo. Quindi, dopo aver incubato il lisato e i sensori di controllo positivo per 15 minuti, lavare e asciugare l'intero chip del sensore come prima. Ora applica quattro microlitri di perossidasi di rafano anti fluoresceina o HRP in PBS contenente caseina agli elettrodi di lavoro di tutti i 16 sensori.

Dopo un'incubazione di 15 minuti, lavare e asciugare il chip del sensore. Quindi, applicare un adesivo a pozzetto di pellicola sulla superficie del chip del sensore e caricare il chip nella pipetta per montaggio su chip del sensore 50 microlitri di substrato TMB su tutti i 16 sensori e chiudere il supporto del chip del sensore. Infine, utilizzare un lettore di chip Helios per ottenere misure di pirometria e telemetria ciclica per tutti i 16 sensori.

Il saggio elettrochimico appena descritto è strutturato in modo simile ad un sandwich, Eliza, come mostrato in questa figura l'ibridazione dell'RNA target ribosomiale con sonde di cattura e rivelatore è sviluppata da una reazione redox catalizzata da HRP coniugata a frammenti di anticorpi anti-fluoresceina che legano il legame della fluoresceina a tre pini sulla sonda rivelatrice. Un componente importante della sensibilità del saggio è la chimica di superficie dell'elettrodo d'oro. L'elettrodo d'oro è rivestito con mercaptoetanolo e hine ol ed è funzionalizzato mediante l'aggiunta di sonde di cattura dilatate.

L'ibridazione a sandwich dell'RNA ribosomiale bersaglio con la sonda di cattura e la sonda rivelatrice marcata con fluoresceina si traduce in un complesso che viene rilevato mediante l'aggiunta del coniugato perossidasi di rafano anti fluoresceina e del substrato TMB. La corrente parametrica M è generata dal ciclo redox che risulta dall'ossidazione del TMB da parte della perossidasi di rafano e dalla riduzione del TMB da parte degli elettroni dell'elettrodo. I saggi qui dimostrati impiegano un chip di array di sensori fluidici genici 16.

Ciascuno dei sensori dell'array contiene tre elettrodi, di riferimento funzionante e ausiliario, che hanno punti di contatto sul bordo del chip. Il lettore di chip è dotato di pogo pin che si collegano a ciascuno dei punti di contatto. Il lettore di chip funge da interfaccia per l'array di sensori con un potenziometro controllato da un algoritmo informatico.

Qui vengono mostrati esempi di flusso di corrente di un sensore elettrochimico. Il flusso di corrente nei sensori è artificialmente alto nei sensori durante i primi secondi dopo l'inizio delle misurazioni parametriche. A causa dell'accumulo di substrato ossidato durante il tempo che intercorre tra l'applicazione del TMB sulla superficie del sensore e l'avvio dell'algoritmo del lettore, il flusso di corrente raggiunge rapidamente uno stato stazionario e le letture accurate del sensore possono essere ottenute in modo affidabile entro 60 secondi.

La variabilità da sensore a sensore è relativamente costante, quindi è possibile eseguire 16 diversi saggi del sensore in parallelo sul chip dell'array di sensori fluidico genico 16 I controlli positivi e negativi sono essenziali come controllo positivo. In questo modo viene utilizzato un oligonucleotide sintetico di DNA a ponte che si ibrida sia con la sonda di cattura che con quella del rivelatore e funge da bersaglio sintetico di concentrazione nota. I risultati ottenuti utilizzando la funzione di oligonucleotide a ponte come controllo di calibrazione interno per ridurre al minimo la variazione da chip a chip.

Maggiore è la corrente negativa dell'elettrodo, maggiore è il segnale. Durante il test di sonde di acquisizione e rivelatore. Il limite di rilevazione deve essere determinato dalla diluizione seriale di un campione di concentrazione nota, come mostrato in questa figura, esiste una correlazione logaritmica lineare tra la concentrazione del campione e l'uscita del segnale nell'intervallo dinamico del saggio.

In questi grafici a barre, i risultati rappresentativi per i campioni contenenti esia coli e sigillo kleb e ammoniaca, che si trovano frequentemente nelle urine di pazienti con infezione del tratto urinario, vengono mostrati segnali per la maggior parte dei sensori saranno bassi e simili, e questi risultati negativi possono essere raggruppati poiché la reattività del segnale di fondo con la coppia di sonde KE distingue canon da e coli. L'oligonucleotide a ponte funge da standard di controllo positivo e di calibrazione interna. Questa tecnica può essere applicata al rilevamento di batteri resistenti agli antibiotici in campioni clinici misurando la risposta fenotipica dei batteri agli antibiotici.

Questa tecnica può essere utilizzata per determinare la terapia ottimale per un singolo paziente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare e identificare i batteri confrontando le correnti atriche nei diversi sensori specifici della specie nel chip.