Name: Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Scopri il rilevamento batterico rapido con sensori elettrochimici funzionalizzati con sonde DNA. Questo metodo identifica i batteri in circa 45 minuti tramite l'ibridazione dell'RNA ribosomiale e la misura della corrente amperometrica.

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Questo studio è stato sostenuto da Cooperativa accordo Award AI075565 (a DAH) presso l&#39;Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive e da Wendy e Ken Fondo Rubino per l&#39;Eccellenza in Pediatric Urology Research. BMC è la Giuditta e Robert Winston Cattedra di Urologia Pediatrica.

1. Funzionalizzazione di Sensori elettrochimici <ol><li> Preparare la sonda di cattura tiolato ad una concentrazione di 0,05 pM a 300 pM 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA e incubare al buio a temperatura ambiente per 10 min . Incubazione della sonda di cattura tiolato con HDT assicura che il gruppo tiolo sulla sonda di cattura è ridotto, con conseguente risultati più coerenti. </li><li> Applicare una corrente di azoto a nudo oro 16 chip di array di sensori (s) per 5 secondi per rimuovere l&#39;umidità e / o particolati. </li><li> Applicare 6 microlitri della HDT-tiolato mix sonda di cattura per l&#39;elettrodo di lavoro di tutti i 16 sensori della matrice di sensori e memorizzare il chip sensore (s) in una capsula di Petri coperta a 4 ° C durante la notte. Sonde di cattura tiolati legano direttamente l&#39;elettrodo d&#39;oro nudo e la HDT atti a prevenire addensamento delle sonde di cattura e di tenerli in una conformazione estesa che promuove l&#39;ibridazione con il target. </li><li> Glidopo giorno, lavare il chip sensore con H 2 O deionizzata per 2-3 secondi e secco sotto flusso di azoto per 5 sec. </li><li> Applicare 6 pl di 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM 6-mercapto-1-esanolo (MCH) per l&#39;elettrodo di lavoro di tutti i sensori 16 e incubare per 50 min. Questa e tutte le successive fasi di incubazione chip del sensore vengono eseguiti in una capsula di Petri coperto a temperatura ambiente. MCH agisce come un agente bloccante, riempiendo tutti gli spazi in cui la sonda di cattura o tiolato HDT non è presente sulla superficie dell&#39;elettrodo. </li></ol> 2. Preparazione del campione <ol><li> Trasferire 1 ml di coltura batterica in fase logaritmica di crescita (OD 600 ≈ 0,1) in una provetta e centrifugare a 16.000 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante cultura. Il pellet batterico può essere elaborata immediatamente o conservato a -80 ° C per un uso successivo. </li><li> Accuratamente risospendere il pellet batterico in 10 ml di 1 M di NaOH applicando la punta della pipetta al bottom della provetta e pipettando su e giù diverse volte. Incubare la sospensione a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Neutralizzare il lisato batterico aggiungendo 50 ml di 1 M di tampone fosfato, pH 7,2, contenente 2,5% di sieroalbumina bovina (BSA) e 0,25 mM di una sonda rivelatore fluoresceina modificata. Incubare il lisato neutralizzato per 10 min a temperatura ambiente. Sonde rivelatore fluoresceina modificati ibridano con rRNA batterici molecole bersaglio. </li></ol> 3. Sensore elettrochimico Assay <ol><li> Lavare il MCH dal chip sensore con H 2 O deionizzata per 2-3 secondi e secco sotto flusso di azoto per 5 sec. </li><li> Applicare 4 microlitri di lisato batterico neutralizzato per l&#39;elettrodo di lavoro di ciascuno dei 14 sensori e incubare per 15 min. Obiettivo-detector complessi sonda ibridano per sonde di cattura tiolati immobilizzati. </li><li> Applicare 4 microlitri di 1 nm ponte oligonucleotide in 1 M tampone fosfato, pH 7.2, contenente 2.5% BSA e 0.25 &amp;mu, M sonda rivelatore fluoresceina-modificato a 2 sensori di controllo positivo (utilizzati per la normalizzazione del segnale) e incubare per 15 min. </li><li> Lavare il chip sensore con H 2 O deionizzata per 2-3 secondi e secco sotto flusso di azoto per 5 sec. </li><li> Applicare 4 pl di 0,5 U / ml di anti-fluoresceina-HRP 1 M in tampone fosfato, pH 7,2, contenente 0,5% di caseina per l&#39;elettrodo di lavoro di tutti i sensori 16 e incubare per 15 min. L&#39;anti-fluoresceina-HRP si lega alle sonde rivelatore fluoresceina modificati immobilizzati. </li><li> Lavare il chip sensore con H 2 O deionizzata per 2-3 secondi e secco sotto flusso di azoto per 5 sec. </li><li> Applicare un film ben adesivo alla superficie del chip del sensore e del carico nel supporto chip del sensore. Pipettare 50 ml di substrato TMB su tutti i 16 sensori e chiudere il monte chip del sensore. </li><li> Ottenere amperometria e misure di voltammetria ciclica per tutti i 16 sensori che utilizzano la Helios Reader Chip. Corrente amperometrica è proporzionale al tasso di TMB reduction sulla superficie del sensore (vedi Figura 1). </li></ol>

<ol><li>Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ternary+Surface+Monolayers+for+Ultrasensitive+%28Zeptomole%29+Amperometric+Detection+of+Nucleic+Acid+Hybridization+without+Signal+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification.</a> Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).</li>
<li>Halford, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Antimicrobial+Susceptibility+Testing+by+Sensitive+Detection+of+Precursor+Ribosomal+RNA+Using+a+Novel+Electrochemical+Biosensing+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).</li>
<li>Campuzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ternary+monolayers+as+DNA+recognition+interfaces+for+direct+and+sensitive+electrochemical+detection+in+untreated+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples.</a> Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).</li>
<li>Gau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+molecular+analysis+without+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification.</a> Methods. 37, 73-83 (2005).</li>
<li>Patel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+Specific+Capture+Enhances+Sensitivity+of+Electrochemical+Detection+of+Bacterial+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).</li>
<li>Mastali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+probe+length+and+target+location+for+electrochemical+detection+of+selected+uropathogens+at+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature.</a> J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).</li>
<li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electrochemical+DNA+biosensors+for+rapid+molecular+identification+of+uropathogens+in+clinical+urine+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).</li>
<li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+advanced+electrochemical+DNA+biosensor+for+bacterial+pathogen+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection.</a> J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).</li>
<li>Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroanalytical+sensors+and+devices+for+multiplexed+detection+of+foodborne+pathogen+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms.</a> Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).</li>
<li>Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+disposable+nucleic+acid+biosensors+for+direct+bioelectronic+detection+in+raw+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples.</a> Talanta. 85, 1330-1337 (2011).</li>
<li>Ecker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibis+T5000%3A+a+universal+biosensor+approach+for+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).</li>
<li>Casalta, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+LightCycler+SeptiFast+test+in+the+rapid+etiologic+diagnostic+of+infectious+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).</li>
</ol>

Tutti gli autori sono gli inventori di brevetti relativi ai metodi descritti. Uno di questi brevetti è stato concesso in licenza a Qvella Corporation. BMC e DAH hanno partecipazione in Qvella Corporation. VG è il Presidente della GeneFluidics, che è il produttore del chip matrice di sensori elettrochimici, montaggio di chip, e lettore di chip descritto in questo articolo.

Il test del sensore elettrochimico qui descritto consente una rapida individuazione di obiettivi di acidi nucleici. Sensibilità e specificità dipendono in parte l&#39;energia libera di ibridazione sonda-bersaglio, che a sua volta dipende dalla lunghezza e il contenuto di GC della cattura e sonde rivelatore. Noi di solito eseguire i passaggi di ibridazione a temperatura ambiente (~ 20 ° C) 5, 6. Tuttavia, la procedura di ibridazione (3.2 e 3.3) possono essere eseguite anche a temperature più elevate in un forn...

Usando rRNA come molecola bersaglio per il rilevamento e l&#39;identificazione batterica ha una serie di vantaggi. L&#39;abbondanza di rRNA in cellule batteriche prevede un limite di sensibilità a partire da 250 batteri per ml senza la necessità di amplificazione del target 1. RRNA batterico contiene uniche sequenze specie-specifici che sono accessibili a ibridazione con sonde di DNA. Di conseguenza, un array di sensori elettrochimici può essere utilizzato per identificare batteri sconosciuti, dove ogni sensore è funzionalizzato con un diverso sonda di cattura specie-specifica. Sensori di controlli positivi devono essere inclusi per un target oligonucleotide sintetico che &quot;ponti&quot; la cattura e sonde rivelatore per creare un segnale di calibrazione interno. Sensori elettrochimici hanno una vasta gamma di applicazioni di ricerca di base e traslazionale. Per esempio, il saggio qui descritto è stato usato per misurare con precisione l&#39;effetto di E. coli fase di crescita su RRNA e numero di copie pre-rRNA, che è di grande interesse per i ricercatori interessati alla fisiologia dei batteri 2. La sensibilità del saggio sensore elettrochimico è determinato dal rapporto segnale-rumore. Una varietà di amplificazione del segnale e di metodi di riduzione del rumore sono stati esplorati. Troviamo che migliorando la chimica della superficie del sensore è fondamentale per ridurre il legame non specifico della sonda rivelatore e / o enzima HRP. In particolare, un monostrato misto di alkanedithiols e mercaptohexanol è stato trovato per ridurre sfondo coprendo la superficie dell&#39;elettrodo più completamente mantenendo accessibilità della sonda di cattura per bersaglio ibridazione 3. Questi trattamenti chimici superficiali sono particolarmente importanti per saggi con campioni biologici complessi.

<table><tbody><tr><td>6-mercapto-1-esanolo (MCH)</td><td>Sigma</td><td>451088</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>1,6-esaneditiolo (HDT)</td><td>Sigma</td><td>H-12005</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Probe di cattura tiolate</td><td>Operon</td><td>N/A</td><td>Conservare a 100 &amp;mu;M in 0,1x TE a -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Probe di rilevamento modificate con fluoresceina</td><td>Operon</td><td>N/A</td><td>Conservare a 100 &amp;mu;M in 0,1x TE a -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Oligonucleotide ponte</td><td>Operon</td><td>N/A</td><td>Conservare a 100 &amp;mu;M in 0,1x TE a -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Anti-fluoresceina-HRP, frammenti Fab</td><td>Roche</td><td>11 426 346 910</td><td>Conservare a 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Helios Chip Reader</td><td>GeneFluidics</td><td>GFR-2009</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per chip sensore</td><td>GeneFluidics</td><td>GFR-003</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo per pozzetti in pellicola</td><td>GeneFluidics</td><td></td><td>Spedito insieme ai chip sensori</td></tr><tr><td>Chip con array di 16 sensori in oro nudo</td><td>GeneFluidics</td><td>SC1000-16X-B</td><td>Conservare in N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; al 100% a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Conservare a 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Tampone fosfato 1 M, pH 7,2</td><td></td><td></td><td>0,35 M NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0,65 M K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, aggiustato a pH 7,2</td></tr><tr><td>Blocker Casein in PBS</td><td>Pierce</td><td>37528</td><td>Diluire con volume equale di tampone fosfato 1 M, pH 7,2, conservare a 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabella 1. Reagenti e attrezzature.&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

rilevamento e identificazione batterica utilizzando sensori elettrochimici

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Sensori elettrochimici sono ampiamente utilizzati per la misurazione rapida e accurata del glucosio nel sangue e possono essere adattati per il rilevamento di una grande varietà di analiti. Sensori elettrochimici operano trasducendo un evento di riconoscimento biologico in un segnale elettrico utile. Trasduzione del segnale avviene accoppiando l&#39;attività di un enzima redox a un elettrodo amperometrico. Sensore specificità è o una caratteristica inerente l&#39;enzima, glucosio ossidasi nel caso di un sensore di glucosio, o un prodotto di legame tra l&#39;enzima ed un anticorpo o sonda. Qui, descriviamo un metodo di saggio sensore elettrochimico per rilevare direttamente e identificare i batteri. In ogni caso, le sonde descritte qui sono oligonucleotidi di DNA. Questo metodo si basa sul panino ibridazione di catturare ed identificare sonde con bersaglio RNA ribosomiale (rRNA). La sonda di cattura è ancorata alla superficie del sensore, mentre la sonda rivelatore è legata horseradish perossidasi (HRP). Quando un substrato quale 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB) è aggiunto ad un elettrodo con complessi di cattura-target-rivelatore legati alla sua superficie, il substrato viene ossidato da HRP e ridotto l&#39;elettrodo di lavoro. Questo redox ciclo sono presenti spola di elettroni da parte del substrato dall&#39;elettrodo a HRP, producendo flusso di corrente nel dell&#39;elettrodo.

Descriviamo un saggio elettrochimico che è strutturato in modo simile a un sandwich ELISA. Come mostrato in Figura 1, l&#39;RNA bersaglio ribosomiale (rRNA) ibridazione con sonde di cattura e rivelatore è sviluppato da una reazione redox catalizzata dalla HRP coniugato frammenti anticorpali anti-fluoresceina che legano il collegamento 3 &#39;fluoresceina sulla sonda rivelatore. Una componente importante di sensibilità del test è la chimica di superficie dell&#39;elettrodo oro. Abbiamo trovato che un mon...

Descriviamo un metodo di analisi sensore elettrochimico per la rilevazione rapida di batteri e di identificazione. Il saggio comporta una serie di sensori funzionalizzato con DNA oligonucleotide sonde di cattura per RNA ribosomiale (rRNA) sequenze specie-specifici. Sandwich ibridazione del target rRNA con la sonda di cattura e di una perossidasi-coniugati DNA sonda rivelatore oligonucleotide rafano produce una corrente amperometrico misurabile.

Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

I sensori elettrochimici sono ampiamente utilizzati per la misurazione rapida e accurata del glucosio nel sangue e possono essere adattati per il rilevamento di un'ampia varietà di...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare e identificare batteri mediante sensori elettrochimici. Questo viene ottenuto innanzitutto rilasciando l'RNA ribosomiale dai batteri, consentendo l'ibridazione con la sonda fluorurata di rilevamento; come secondo passaggio, l'RNA ribosomiale legato alla sonda di rilevamento viene aggiunto all'elettrodo di lavoro, permettendo l'ibridazione con la sonda di cattura sulla superficie del sensore. Successivamente, si permette al coniugato di anti-fluoresceina perossidasi da ravanello affoglio di legarsi alla sonda di rilevamento fluorurata.Infine, nella corrente interferometrica, l'intensità, che è correlata al numero di complessi tra sonde di cattura ribosomiali e sonde rivelatrici di RNA sulla superficie del sensore, può essere ottenuta. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi basati sulla coltura è che i batteri possono essere rilevati e identificati in circa 45 minuti, evitando l'attesa notturna necessaria affinché un batterio formi una colonia visibile su una piastra EDGAR. L'applicazione di questa tecnica migliorerebbe la gestione delle malattie infettive.La rilevazione precoce dei patogeni batterici è es

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