Produzione e utilizzo di Piggy-back Multibarrel Elettrodi per In vivo Manipolazioni farmacologiche di risposte neurali

Questa procedura ha lo scopo di applicare in modo ionoforetico agenti farmacologici a microcircuiti cerebrali mentre si registra contemporaneamente l'attività neurale. Per prima cosa, preparare un elettrodo di vetro a barile singolo per la registrazione da singola cellula e piegare la punta. Inoltre, preparare un elettrodo di vetro multibarile e frantumare la punta fino al diametro desiderato.

Procedere all'assemblaggio dei due elettrodi. L'elettrodo prodotto viene infine utilizzato per registrazioni extracellulari in vivo, in cui è possibile applicare farmacologicamente agenti per manipolare i microcircuiti neurali su richiesta. Ciao, mi chiamo Dr. Achim Klu e il nostro laboratorio vi mostrerà oggi come produrre elettrodi multibarile a cavalcioni.

Questi elettrodi possono essere utilizzati per ionoforesi agonisti e antagonisti neurali nell'ambiente microscopico di un neurone, e quindi per manipolare i circuiti neurali di un neurone in vivo. Salve, sono la dottoressa An Zillow. Sono ricercatrice postdottorato nel laboratorio del dottor Ah him Crow, e oggi illustrerò la procedura. Per un elettrodo a barile singolo, utilizzare una capillare di vetro a barile singolo con filamento e tirare la punta fino a un diametro di circa uno-due micrometri e una lunghezza dello stelo di 10-12 millimetri.

Verificare occasionalmente la resistenza dell'elettrodo tirato riempiendolo con cloruro di sodio 3 M e testandolo con un misuratore standard O in soluzione salina 0,9%. Una volta che l'elettrodo è riempito con la soluzione salina, la soluzione si asciuga rapidamente, rendendo l'elettrodo inutilizzabile. Pertanto, eseguire questo test solo quando necessario.

Premere su alcuni elettrodi che non verranno utilizzati per la produzione piggyback. Per creare un elettrodo multipipetta completo, tirare il vetro fino a ottenere una punta di pipetta con un diametro totale di circa 10 micrometri o inferiore. Un elettrodo con una punta correttamente tirata è fondamentale per il successo.

Oltre a essere lunga e sottile, la punta deve comunque essere rigida e deve potersi rompere facilmente al diametro desiderato. La punta verrà rotta al diametro corretto nel passaggio successivo. Pertanto, durante il processo di pooling, la dimensione esatta della punta è meno critica rispetto alla forma complessiva della punta dell'elettrodo, che deve essere lunga e relativamente sottile.

Ora, tenere l'elettrodo a barile singolo a circa 45 gradi, con la punta rivolta verso il basso, e muoverlo attraverso la fiamma relativamente in fretta. L'obiettivo è far sì che la fiamma fonda il vetro nella zona di transizione a circa 10 millimetri dalla punta dell'elettrodo, piegandolo di circa 20 gradi. Posizionare l'elettrodo a barili multipli su un letto di argilla modellabile su un vetrino, quindi inserirlo negli stadi del microscopio.

Portaoggetti Utilizzando i manipolatori XY della piastra del microscopio, spostare delicatamente la punta dell'elettrodo contro il pezzo di plexiglass. Osservare la rottura della punta attraverso gli oculari del microscopio. L'allestimento del montaggio dell'elettrodo è mostrato qui.

L'elettrodo multiplo è posizionato su un vetrino sul tavolo del microscopio. Mentre l'elettrodo monocollo viene tenuto da un manipolatore manuale multiasse che consente all'utente di abbassare con grande precisione la pipetta monocollo sull'elettrodo multiplo. Abbassare l'elettrodo monocollo direttamente nella scanalatura dell'elettrodo multiplo, formata dalla disposizione dei cinque colli, in modo che la sua punta sporga di circa cinque-dieci micrometri rispetto alla punta dell'elettrodo multiplo.

Incollare gli steli delle due elettrodi utilizzando cianoacrilato. Iniziare dalla posizione più distale rispetto alle punte e spostare lentamente un bastoncino di legno con una goccia di colla lungo gli steli degli elettrodi in direzione delle punte. Applicare la colla troppo vicino alle punte degli elettrodi ostruirebbe le stesse, rendendo l'elettrodo almeno parzialmente non funzionale.

Mescolare una piccola quantità di cemento dentale. Lasciare asciugare per circa 15 minuti. Quindi rimuovere con attenzione l'elettrodo piggyback completato.

Prima rimuovere dal supporto del micromanipolatore, quindi staccare dal vetrino. Immediatamente prima di utilizzare l'elettrodo, prepararsi a riempire retrogradamente ciascun canale con il relativo farmaco. Riempire i quattro canali esterni della configurazione a cinque canali con quattro farmaci a scelta e il canale centrale con cloruro di sodio 3 M come canale di bilanciamento.

Quindi riempire l'elettrodo di registrazione monobarile con cloruro di sodio a tre moli. Ora accendere i moduli della pompa di ionoforesi e testare tutti i barili. La funzione di test dell'elettrodo di ciascun modulo della pompa aiuterà a determinare se il barile dell'elettrodo è funzionante per le registrazioni cerebrali profonde.

Un elettrodo finito composto da cinque barili, assemblato insieme a un elettrodo registrante a singolo barile, ha un'asta lunga circa sette millimetri. Diversi agonisti e antagonisti sinaptici sono comunemente utilizzati con l'iontoforesi, bloccando l'inibizione mediata dalla glicina mediante farmaci come gli antagonisti del recettore della glicina. Il cloridrato di stricnina aumenta tipicamente la frequenza di scarica nei neuroni.

Questi dati campione misurano la frequenza di scarica di un neurone uditivo in funzione dell'intensità, mostrando le risposte a stimoli sonori sinusoidali di intensità crescente applicati alle orecchie dell'animale. Suoni più intensi hanno determinato frequenze di scarica più elevate prima dell'applicazione del rigoroso nove. La funzione di intensità della frequenza del neurone mostra basse frequenze di scarica.

L'applicazione di una corrente iniziale di iontoforesi a 15 nanoampere stimola un lieve aumento della corrente di espulsione. Correnti di espulsione progressivamente più elevate bloccano progressivamente un numero maggiore di recettori della glicina nel neurone, determinando frequenze di sparo progressivamente più elevate. A una corrente di 45 nanoampere, tutti i recettori della glicina di quel neurone sembrano essere bloccati dal cloruro di stricnina.

Un ulteriore aumento della corrente di espulsione e il rilascio di quantità ancora maggiori di noradrenalina non hanno determinato ulteriori modifiche. Il livello della frequenza di scarica dei neuroni dopo la fine dell'iontoforesi mostra una funzione di recupero completo delle risposte neurali al valore basale entro circa 25 minuti. Questo processo di recupero dipende dal tipo e dalla quantità di farmaco espulso.

È importante ricordare che il farmaco ferre diffonderà nelle vicinanze del sito di registrazione e potrebbe bloccare i recettori di neuroni adiacenti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come combinare un elettrodo di registrazione con un elettrodo multibarile per farmaci al fine di ottenere registrazioni cerebrali profonde a basso rumore, insieme a una somministrazione controllata nel tempo di fino a quattro agenti farmacologici.