Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode C. elegans

Questo video mostra una procedura per identificare i geni che regolano, vedi la crescita dell'elgan e le dimensioni del corpo. Utilizzando l'interferenza dell'RNA o l'occhio dell'RNA per inattivare i geni candidati, vengono preparate le prime piastre contenenti batteri che esprimono RNA a doppio filamento, che hanno come bersaglio i geni di interesse. Gli ermafroditi del quarto stadio larvale vengono trasferiti alle piastre RNAi.

Una volta raggiunto lo stadio di giovane adulto, vengono trasferiti su nuove piastre RNAI per deporre le uova. Dopo diverse ore, vengono rimossi lasciando popolazioni sincronizzate di embrioni. Allo stadio di sviluppo desiderato, la progenie si raccoglieva e montava su vetrini.

Infine, vengono acquisite immagini microscopiche dei vermi. L'analisi dell'immagine dimostra i cambiamenti nelle dimensioni corporee causati dall'inattivazione genica. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per identificare i regolatori della via di segnalazione del TGF beta, può anche essere applicato ad altre vie che regolano lo sviluppo post-embrionale in mare, come la via di segnalazione dell'insulina.

Iniziare questa procedura clonando le sequenze del gene bersaglio nel vettore L 4 4 4 0 Un plasmide RNAi di verme comunemente usato trasforma il plasmide ricombinante nel ceppo batterico. HT uno 15 DE tre cultura. I batteri trasformati su piastre di agar LB con 25 microgrammi per millilitro di tetraciclina carbonica e 12,5 microgrammi per millilitro di tetraciclina, quindi scelgono un singolo clone per un uso futuro.

Nel frattempo, trasformare il vettore vuoto L 4 4 4 0 nel ceppo batterico. HT uno 15. Da utilizzare come controllo per gli esperimenti coltura, i batteri trasformati in un millilitro di brodo LB con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina durante la notte a 37 gradi Celsius.

La tetraciclina non viene aggiunta perché diminuisce l'efficienza dell'RNAI. Aggiungere altri cinque millilitri di brodo LB con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina alla coltura durante la notte, quindi incubare per altre quattro-sei ore a 37 gradi Celsius. Una volta che la coltura è pronta, seminare 0,5 millilitri di batteri sperimentali o di controllo sulle piastre per vermi RNAI etichettate con il nome del clone appropriato.

Almeno due piastre dovrebbero essere preparate per ogni condizione. Incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo.

Dovrebbe essere presente un prato di batteri che esprimono RNAi con o senza la sequenza genica bersaglio. Gli animali useranno i batteri come fonte di cibo. Una volta che le piastre di alimentazione RNAI sono pronte, le fiamme sterilizzano la punta di un filo di platino.

Quindi utilizzare il filo di platino per trasferire da sei a dieci ermafroditi del quarto stadio larvale o L quattro ermafroditi elgani C su ciascuna piastra RNAi. Lascia che gli ermafroditi crescano a 20 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, gli animali saranno giovani adulti.

Trasferirli su una nuova piastra RNAI adeguatamente etichettata e preparata. Incubare le piastre a 20 gradi Celsius per quattro-sei ore per consentire agli adulti di deporre le uova. Dopo l'incubazione, rimuovere tutti gli adulti dalla piastra per sincronizzare la prole.

Una volta rimossi gli adulti, inizia a contare il tempo. Questo è il tempo zero. Incubare le piastre a 20 gradi Celsius per consentire agli animali di crescere fino allo stadio di sviluppo di interesse.

Qui, i giovani adulti saranno scelti per l'analisi fenotipica. Per i knockdown che si sviluppano a un ritmo normale, è necessaria un'incubazione di 72 ore. Tieni presente che vari geni influenzano lo sviluppo animale in modo diverso, quindi potrebbe essere necessario regolare i tempi di incubazione.

Se l'RNAi fa crescere gli animali a una velocità diversa, i giovani adulti possono essere identificati come quelli che non hanno più di 24 ore dopo L quattro con sviluppo VUL completato e da due a sei embrioni nell'utero, come mostrato qui. Per identificare altre fasi dello sviluppo, lo sperimentatore dovrebbe utilizzare lo sviluppo delle gonadiche e della VUL come guida. Una volta che gli animali sono cresciuti allo stadio appropriato, preparati a segnare i fenotipi delle dimensioni corporee dei vermi trattati con RNAi.

Quindi posizionare due strati di nastro adesivo colorato su un vetrino di vetro, spesso un millimetro, come mostrato qui. Crea due di questi vetrini. Quindi posizionare un nuovo vetrino tra i due vetrini con il nastro adesivo e applicare una goccia di 2% di Agros sciolto in acqua.

Al centro del nuovo vetrino, premere un secondo vetrino sulla parte superiore per ottenere un sottile agrospad. Una volta che l'agros si è solidificato, rimuovere il vetro superiore. Far scorrere la diapositiva con il pad agros è pronto per caricare i vermi.

Etichettare la diapositiva con il nome del clone. Aggiungere 10 microlitri di azoturo di sodio da 25 millimolari al tampone aros. Quindi, utilizzando un filo di platino come prima, trasferire da 30 a 40 animali nella soluzione di sodio azi.

Per immobilizzarli, metti un vetrino coprioggetti sulla parte superiore. Eseguire questa operazione sia per gli animali ricombinanti che per quelli vuoti che trasportano L 4 4 4 0 trattati con RNAi. Quindi, posizionare il vetrino micrometrico sotto il microscopio da dissezione con una lente obiettivo 2,5x.

Utilizzando Q Capture o un software simile, acquisire un'immagine del righello micrometrico e salvarla. Quindi posiziona i vermi sotto il cannocchiale e cattura le immagini. Per misurare prima la lunghezza del corpo, aprire l'immagine del righello micrometrico nel software Image Pro.

Quindi fare clic su misura e scegliere la calibrazione. Quindi scegli la procedura guidata di calibrazione spaziale con calibrare l'immagine attiva selezionata. Fare clic su Avanti.

Inserire il nome per la calibrazione e assicurarsi che le unità di riferimento spaziale siano impostate su micron. Quindi selezionare il pulsante Crea una calibrazione di riferimento e fare clic su Avanti. Fare clic su disegna linea di riferimento.

Apparirà una barra della scala di riferimento. Riposizionare la barra della scala in modo che corrisponda alle estremità del micrometro. Quindi indicare che il riferimento indica 1000 unità.

Fare clic su OK. Avanti e fine. Una volta calibrato il software, aprire un'immagine del worm.

Quindi, nel menu di misurazione, selezionare calibrazione, quindi fare clic su seleziona spaziale. Nel menu a discesa, selezionare il nome del file creato per la calibrazione del micrometro. Quindi, nel menu delle misure, seleziona le misure nella finestra che si apre.

Seleziona lo strumento di disegno libero e usando il mouse del computer traccia una linea attraverso il centro del corpo dell'animale dalla testa alla coda. La lunghezza verrà riportata nella finestra. Ripeti questo processo per tutti gli animali sul campo.

Esporta le misure di lunghezza in un file Microsoft Excel o in un altro software statistico adatto. Analizza i dati calcolando la media e la deviazione standard per ogni campione. Quindi confronta i risultati per ogni gruppo utilizzando il test T di uno studente.

Il fattore di crescita trasformante beta o TGF beta SUPERFAMILY protein DBL one è necessario per l'attivazione della via del TGF beta. In risposta all'attivazione del segnale, i trasduttori intracellulari del segnale smad traslocano nel nucleo e avviano la trascrizione genica. Vedi l'eleganza in cui la via beta del TGF viene interrotta hanno una dimensione corporea più piccola, inclusa una lunghezza corporea più corta rispetto agli animali di tipo selvatico.

Così schermi per l'eleganza del mare. I mutanti di dimensioni corporee sono in grado di identificare i componenti e i modificatori di segnalazione del TGF beta per testare l'efficacia dell'RNAi alimentandosi per l'identificazione di mutanti di dimensioni corporee. L'RNAi è stato utilizzato per abbattere i componenti del percorso DBL uno, SMA tre a SMA sei, in quattro diversi ceppi di eleganza marina.

I ceppi C elegance testati includevano due che sono RN AI ipersensibili A uno, Lin 15 B e RF tre, così come il ceppo standard wild type N due e il ceppo LIN 36, la cui sensibilità RNAi è simile a N due come mostrato qui. Quando l'espressione di SMA 3 o SMA 6 è stata interrotta, gli animali hanno mostrato una dimensione corporea significativamente più corta rispetto agli animali di controllo, ad eccezione di SMA sei RNAi in Lin 36. Sfondo in RF tre.

Le lunghezze corporee di fondo dei giovani adulti dopo il trattamento con RNAi erano dall'84 al 95% del solo vettore. In un Lin 15 B le lunghezze corporee dei giovani adulti dopo RNAi erano dal 68 all'86% degli animali di controllo. Tuttavia, il ceppo A one lin 15 B produce una progenie da vista.

Questo li rende inadatti per la proiezione su larga scala. Pertanto, per queste tecniche si suggerisce l'uso del ceppo RF three. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare i geni che regolano la crescita e le dimensioni del corpo utilizzando la tecnica di interferenza RNI.