Name: Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Impara la tecnica di alimentazione RNAi per identificare geni che regolano la crescita e le dimensioni corporee in C. elegans. Questo metodo consente screening genetico su larga scala attraverso la via di segnalazione DBL-1/TGF-β.

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Ringraziamo James Clark per la fornitura di figure di animali in vari momenti dello sviluppo. C. ceppi elegans in questo studio sono stati ottenuti dalla Genetics Caenorhabditis Center, che è supportato dal National Center for NIH Research (NCRR). Questo lavoro è stato sostenuto da CIRG 1817 della CUNY a JL e CSD, e dal NIH 1R15GM073678-01 e 1R15GM097692-01 al CSD Ringraziamo il Dott. William J. Rice, il dottor Nathalia Holtzman, e Melissa Silvestrini per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato svolto in adempimento parziale dei requisiti per un dottorato di ricerca del Graduate Center della City University di New York (S. Xiong).

1. Preparazione di piastre di alimentazione RNAi trasporto Gene sequenza bersaglio <ol><li> Se si utilizzano le librerie disponibili in commercio (ad esempio da RNAi LifeSciences Fonte BioScience), passare al punto 1.4. In alternativa, clonare sequenze di geni bersaglio in vettoriale L4440, un worm comunemente usato RNAi plasmide 8, dal protocollo standard di clonazione. </li><li> Trasformare il plasmide ricombinante in ceppo batterico HT115 (DE3), cultura loro su piastre di agar LB con 25 ug / ml carbenicillina e 12,5 ug / ml di tetraciclina, e scegliere un singolo clone per uso futuro. </li><li> Nel frattempo, trasformare la L4440 vettore vuoto nel ceppo batterico HT115 usare come controllo per gli esperimenti. </li><li> Cultura sia ricombinanti e vuoto L4440-trasportano batteri in 1 ml di brodo LB con 100 pg / ml ampicillina notte a 37 ° C. Tetraciclina non viene aggiunto a causa del fatto che essa diminuisce l&#39;efficienza RNAi. </li><li> Aggiungere un altro 5 ml di brodo LB con 100 pg / ml ampicillina nella notte culre, incubare per un altro 4-6 ore a 37 ° C. </li><li> Seed 0,5 ml ricombinante o vuoto L4440 porta-coltura batterica su piastre a vite senza fine le RNAi. Etichettare tutti i piatti con il nome del clone. </li><li> Contrassegnare le piastre ed incubare una notte a 37 ° C per crescere prato batterica, queste sono le piastre RNAi con o senza sequenza target gene. Almeno 2 piastre devono essere preparati per ogni condizione. </li></ol> 2. Worms cultura sui piatti che alimentano il RNAi <ol><li> Fiamma sterilizzare la punta di un pick verme filo di platino. Utilizzare il worm sceglie di prendere 6-10 quarto stadio larvale (L4) ermafrodite a ciascuna piastra micro-RNA che contiene o ricombinante o vuota L4440, gli animali si utilizzano i batteri come fonte di cibo. </li><li> Lasciate ermafroditi crescere a 20 ° C (condizione standard per la cultura C. elegans) durante la notte, diventeranno giovani adulti il giorno successivo. </li><li> Trasferimento 6-10 giovani adulti in una nuova piastra corrispondente etichettati e pronti RNAi. </li><li> Lasciate che iladulti depongono le uova per 4-6 ore, quindi rimuovere tutti gli adulti dalla piastra, questa fase è quello di sincronizzare la progenie. Una volta che le madri vengono rimossi, inizia il conteggio del tempo. Questo è il tempo zero. </li><li> Incubare le piastre a 20 ° C per far crescere gli animali a specifico stadio di sviluppo, in questo protocollo, abbiamo scelto i giovani adulti per l&#39;analisi fenotipica. Per abbattimenti che si sviluppano ad un ritmo normale, 72 ore di incubazione è sufficiente per gli animali di diventare giovani adulti. Tuttavia, vari geni influenzano sviluppo animale diverso. Se RNAi induce gli animali a crescere ad un ritmo diverso, i giovani adulti possono essere identificati come quelli che ora più di 24 passato L4 con completato lo sviluppo vulvare e 2-6 embrioni in utero (se fertile). Per identificare gli altri stadi di sviluppo, lo sperimentatore deve usare lo sviluppo delle gonadi e vulvare come guida. </li></ol> 3. Risultato Fenotipi Corpo di ampiezza degli RNAi trattati Worms <ol><li> Posizionare due strati di nastri etichette colorate su un vetrino. Rendono due deivetrini sé. Quindi, posizionare una nuova diapositiva di vetro tra le due slitte con nastro. Melt agarosio al 2% in acqua, applicare una goccia al centro del vetrino nuovo, premere la seconda slitta di vetro sopra per fare un sottile strato di agarosio al 2% come precedentemente descritto 9. </li><li> Una volta agarosio è solidificato, rimuovere la slitta superiore in vetro, il vetrino con agarosio pad è pronto a caricare i vermi. Diapositiva Etichetta con nome clone. </li><li> Aggiungere 10 microlitri 25 mM NaN 3 al pad agarosio; raccogliere animali 30-40 nella soluzione 3 NaN fermarli, poi mettere coprioggetto sulla parte superiore, sia per la ripetizione ricombinante e vuoto L4440-contabile RNAi animali trattati. </li><li> Immagine i vermi sotto microscopio da dissezione con lente 2.5x obiettivo; qui usiamo Leica fotocamera digitale con supporto Qcapture software. </li><li> Per la calibrazione, prima di catturare l&#39;immagine di un sovrano micrometro standard. Quindi aprire l&#39;immagine in Image-Pro, cliccare su &quot;misura&quot; e scegliere &quot;calibrazione&quot; e poi scegliere&quot;Wizard calibrazione spaziale&quot;. Con &quot;calibrare l&#39;immagine attiva&quot; selezionato, fare clic su &quot;Avanti&quot;. Immettere il nome per la calibrazione e garantire che le unità spaziali di riferimento sono impostate micrometro. Quindi, selezionare la casella &quot;creare una calibrazione di riferimento&quot; e fare clic su &quot;Avanti&quot;. Clicca su &quot;Linea di pareggio&quot;. Una barra di scala di riferimento verrà visualizzata. Riposizionare la barra di scala per unire le due estremità del micrometro, quindi indicare che il riferimento indica 1.000 unità. Fare clic su &quot;OK&quot;, &quot;Avanti&quot; e &quot;Fine&quot;. </li><li> Una volta che il software è stato calibrato, aprire un&#39;immagine verme. Quindi, selezionare nel menu &quot;misura&quot;, selezionare &quot;Calibrazione&quot; quindi cliccare su &quot;select spaziale&quot;. Nel menu a discesa, selezionare il nome del file creato per la calibrazione micrometro. Poi, sotto il menu &quot;misura&quot;, selezionare &quot;misure&quot;. Nella finestra che si apre, selezionare la free-disegnare strumento e tracciare una linea attraverso il centro del corpo animale dalla testa alla coda con il mouse del computer (Figura 1). La lunghezza sarà riportato nella finestra. Oraci sono due gruppi di dati: lunghezza corpo di animali trattati con gene target RNAi e animali di controllo trattati con vuoto L4440 vettore. </li><li> Esportare le misure di lunghezza di un file di Microsoft Excel o altri software statistico adeguato. Analizzare i dati calcolando la media e la deviazione standard per ciascun campione. Quindi confrontare i campioni utilizzando Student t-test. </li></ol>

<ol><li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li>
<li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA%3A+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li>
<li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+movement+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li>
<li>Shim, M. S., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+targeted+delivery+of+siRNA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Febs.+J%22%5BJournal%5D)">Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo.</a> Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).</li>
<li>Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+chemically+synthesized+siRNA+and+vector-mediated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi.</a> FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
<li>Savage-Dunn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFb+pathway+components%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li>
<li>Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+TGF%CE%B2+signal+transducers+in+the+hypodermis+regulates+body+size+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans.</a> Development. 129, 4989-4998 (2002).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130, 6453-6464 (2003).</li>
<li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling.</a> WormBook. , 1-12 (2005).</li>
<li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li>
<li>De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evo-devo%3A+variations+on+ancestral+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evo-devo: variations on ancestral themes.</a> Cell. 132, 185-195 (2008).</li>
<li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo protocollo, si descrive il nostro metodo per l&#39;identificazione di mutanti difettosi delle dimensioni del corpo C. elegans di alimentazione RNAi. Questo metodo è applicabile alla identificazione di TGF-β componenti segnalazione. Dal momento che tali componenti sono altamente conservati nel corso dell&#39;evoluzione 15 schermi che abbiano una connessione a chiarire i meccanismi molecolari di TGF-β segnalazione in tutti i metazoi. Una considerazione importante nel progettare tale schermata...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> RNAi vermi piatti 17,7 g Worm Mix Media 60 g Agar Aggiungi H 2 O a 3 litri. Autoclave. Aggiungere 3 ml 1M IPTG (sterile) e 3 ml 25 mg / ml Carbenicillin (sterile), poi versare in piastre di Petri da 60 mm. Worm piastre 17,7 g Worm Mix Media 0,6 g streptomicina solfato 60 g Agar Aggiungi H 2 O a 3 litri. Autoclave. Versare in piastre Petri da 60 mm. Worm Media Mix 55 g di Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto peptone 800 mg Colesterolo 200 g NaCl Agitare bene e essere sicuri di evitare blocchi, questa miscela in polvere può essere conservato per molti mesi prima dell&#39;uso. 2% agarosio 0,5 g di agarosio Annunciod 25 ml dH 2 O. Il calore nel forno a microonde fino a completa dissoluzione. 1M isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) 2 g IPTG Sciogliere IN10 ml dH 2 O 1M NaN 3 6,5 g NaN 3 Aggiungi dH 2 O a 100 ml 25 mM NaN 3 2,5 ml 1M NaN 3 Aggiungi dH 2 O a 100 ml Caenorhabditis elegans di Caenorhabditis Genetica Centro L4440 plasmide (porta ampicillina gene per la resistenza) Batteri ceppo HT115 (DE3) (contiene IPTG inducibile T7 polimerasi, carente per RNAsi III gene (a dsRNAse) che porta anche tetraciclina gene per la resistenza) 16 60 millimetri Petri piatti 100 millimetri Petri piatti 14 ml a fondo tondo Falcon cultura tubi diapositive di vetro vetro coprioggetti 1-20 microlitri pipetta 20-200 microlitri pipetta 200-1000 microlitripipetta 1-200 puntali ul 200-1000 puntali ul 1,5 ml provette Eppendorf filo di platino scelta vite senza fine </td></tr></tbody></table>

utilizzo di rna-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione dimensione del corpo nel nematode<em&gt; c. elegans</em

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Doppio filamento di RNA-mediata interferenza (RNAi) è una strategia efficace per abbattere l&#39;espressione del gene bersaglio 1-3. Esso è stato applicato a sistemi modello molti tra piante, invertebrati e vertebrati. Ci sono vari metodi per raggiungere RNAi in vivo 4,5. Ad esempio, il gene bersaglio può essere trasformato in un vettore RNAi, e quindi permanentemente o transitoriamente trasformati in linee cellulari o cellule primarie per ottenere effetti atterramento gene; alternativamente sintetizzati oligonucleotidi a doppio filamento da geni specifici (oligo RNAi) può essere transitoriamente trasformati in linee cellulari o cellule primarie per mettere a tacere i geni bersaglio, o di sintesi del doppio filamento molecole di RNA possono essere microiniettato in un organismo. Poiché il nematode C. elegans utilizza batteri come fonte di cibo, nutrire gli animali con i batteri che esprime a doppio filamento di RNA contro geni bersaglio fornisce una strategia sostenibile 6. Qui vi presentiamo una alimentazione RNAimetodo per segnare dimensioni fenotipo corpo. Taglia corpo in C. elegans è regolato principalmente dal TGF-β - come ligando DBL-1, quindi questo saggio è appropriato per l&#39;identificazione dei componenti di segnalazione TGF-β 7. Abbiamo usato diversi ceppi tra due ceppi ipersensibili RNAi per ripetere gli esperimenti di alimentazione RNAi. I nostri risultati hanno dimostrato che RRF-3 ceppo ci ha dato il miglior fenotipo atteso RNAi. Il metodo è di facile esecuzione, riproducibile e facilmente quantificato. Inoltre, il nostro protocollo minimizza l&#39;uso di attrezzature specializzate, quindi è adatto per piccoli laboratori o quelli a istituzioni prevalentemente universitari.

Nella nostra ricerca, ci concentriamo sulla regolamentazione dimensioni del corpo attraverso la via DBL-1/TGF-β. La perdita di funzione delle DBL-1 risultati della via in dimensioni contenute, tra cui una lunghezza del corpo più breve rispetto a wild-type animali 7,10,11. Così, protezioni per C. elegans mutanti dimensioni del corpo sono in grado di identificare TGF-β componenti di segnalazione e modificatori. DBL-1 segnalazione è mediata da una conservata TGF-β pathway di trasduzione del segnale che ...

Abbiamo dimostrato come utilizzare la tecnica di alimentazione RNAi per abbattere i geni bersaglio e corpo fenotipo punteggio dimensione in<em&gt; C. elegans</em&gt;. Questo metodo può essere utilizzato per uno schermo grande scala per identificare potenziali componenti genetiche di interesse, come quelli coinvolti nella regolazione dimensioni del corpo tramite segnalazione DBL-1/TGF-β.

Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode<em&gt; C. elegans</em

L'interferenza dell'RNA (RNAi) mediata da RNA a doppio filamento è una strategia efficace per il silenziamento dell'espressione di geni bersaglio1-3. È stata applicata a molti sistemi modello...

Questo video illustra una procedura per identificare i geni che regolano la crescita di *C. elegans* e le dimensioni corporee. Utilizzando l'interferenza dell'RNA o RNAi per inattivare geni candidati, si preparano prima piastre contenenti batteri che esprimono RNA a doppio filamento, mirati ai geni di interesse. Larve di quarta fase vengono trasferite su piastre RNAi.Una volta raggiunta la fase di giovane adulto, vengono trasferiti su nuove piastre RNAi per la deposizione delle uova. Dopo diverse ore, vengono rimossi, lasciando popolazioni sincronizzate di embrioni. Allo stadio di sviluppo desiderato, la prole viene raccolta e montata su vetrini.Infine, vengono acquisite immagini al microscopio dei vermi. L'analisi dell'immagine mostra modifiche nelle dimensioni corporee causate dall'inattivazione genica. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per identificare regolatori della via di segnalazione TGF beta, può anche essere applicato ad altre vie che regolano lo sviluppo post-embrionale in *C. elegans*, come la via di segnalazione dell'insulina.Iniziare questa procedura clonando le sequenze del gene bersaglio nel vettore L 4 4 4 0 A, un plasmide comunemente utilizzato per l'RNAi in vermi; trasformare il plasmide ricombinante nella ceppa batterica HT one 15 DE three. Coltivare i batteri trasformati su piastre di agar LB contenenti 25 microgrammi per millilitro di carbenicillina e 12,5 microgrammi per millilitro di tetraciclina, quindi selezionare una singola colonia per l'uso futuro.Nel frattempo, trasformare il vettore vuoto L 4 4 4 0 nella ceppa batterica HT one 15. Utilizzare come controllo per la coltura sperimentale i batteri trasformati in un millilitro di brodo LB con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina, incubati tutta la notte a 37 gradi Celsius.La tetraciclina non viene aggiunta perché riduce l'efficienza dell'RNAI. Aggiungere altri cinque millilitri di brodo LB contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina alla coltura notturna, quindi incubare per altre quattro-sei ore a 37 gradi Celsius. Una volta che la coltura è pronta, seminare 0,5 millilitri di batteri sperimentali o di controllo sulle piastre di vermi RNAI etichettate con il nome del clone appropriato.Per ogni condizione devono essere preparate almeno due piastre. Incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo.Deve essere presente un tappeto batterico che esprime RNAi con o senza la sequenza del gene bersaglio. Gli animali utilizzeranno i batteri come fonte alimentare. Una volta pronti i piatti per l'alimentazione con RNAi, sterilizzare la punta di un filo di platino alla fiamma.Quindi utilizzare il filo di platino per trasferire da sei a dieci larve di quarto stadio o stadio L4 di C. elegans ermafroditi su ciascuna piastra RNAi. Lasciare crescere gli ermafroditi a 20 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno successivo, gli animali saranno giovani adulti.Trasferirli in una nuova piastra RNAi opportunamente etichettata e preparata. Incubare le piastre a 20 gradi Celsius per quattro-sei ore per consentire agli adulti di deporre le uova. Al termine dell'incubazione, rimuovere tutti gli adulti dalla piastra per sincronizzare la prole.Una volta rimossi gli adulti, iniziare a contare il tempo. Questo è il tempo zero. Incubare le piastre a 20 gradi Celsius per permettere agli animali di svilupparsi fino allo stadio di interesse.Qui verranno selezionati giovani adulti per l'analisi fenotipica. Per gli abbattimenti genici che si sviluppano a un ritmo normale, è richiesta un'incubazione di 72 ore. Tieni presente che diversi geni influenzano lo sviluppo dell'animale in modo differente, quindi i tempi di incubazione potrebbero necessitare di essere aggiustati.Se l'RNAi causa un tasso di crescita diverso negli animali, gli adulti giovani possono essere identificati come quelli non oltre 24 ore dopo lo stadio L4 con sviluppo VUL completato e da due a sei embrioni nell'utero, come mostrato qui. Per identificare altri stadi di sviluppo, lo sperimentatore deve utilizzare lo sviluppo gonadico e VUL come riferimento. Una volta che gli animali sono cresciuti fino allo stadio appropriato, prepararsi a valutare i fenotipi della dimensione corporea nei vermi trattati con RNAi.Successivamente, posizionare due strati di nastro adesivo colorato su un vetrino in vetro dello spessore di un millimetro, come mostrato qui. Preparare due di questi vetrini. Quindi inserire un nuovo vetrino tra i due vetrini con il nastro e applicare una goccia di Agros al 2% fuso in acqua.Al centro del nuovo vetrino, premere un secondo vetrino sopra per creare un tampone di agar sottile. Una volta che l'agar si è solidificato, rimuovere il vetrino superiore. Il vetrino con il tampone di agar è pronto per essere caricato con i vermi.Etichettare il vetrino con il nome del clone. Aggiungere 10 microlitri di azide di sodio 25 millimolare al tampone aros. Quindi, utilizzando un filo di platino come in precedenza, trasferire da 30 a 40 animali nella soluzione di azide di sodio.Per immobilizzarli, posizionare un coprivetrino sulla parte superiore. Eseguire questa operazione sia per gli animali ricombinanti che per quelli privi di L 4 4 4 0 trasfettati con RNAi. Successivamente, posizionare il vetrino graduato sotto il microscopio stereoscopico con un obiettivo da 2,5 x.Utilizzando Q Capture o un software simile, acquisire un'immagine del righello micrometrico e salvarla. Successivamente, posizionare i vermi sotto la lente e acquisire le immagini. Per misurare innanzitutto la lunghezza del corpo, aprire l'immagine del righello micrometrico nel software Image Pro.Quindi fare clic su "measure" e scegliere "calibration". Successivamente, selezionare la procedura guidata di calibrazione spaziale con l'opzione "calibrate the active image" attivata. Fare clic su "next".Inserire il nome per la calibrazione e assicurarsi che le unità di riferimento spaziale siano impostate su micron. Quindi selezionare la casella Crea una calibrazione di riferimento e fare clic su Avanti. Fare clic su disegna linea di riferimento.Apparirà una barra di scala di riferimento. Riposizionare la barra di scala in modo che corrisponda alle estremità del micrometro. Quindi indicare che il riferimento corrisponde a 1000 unità.Fare clic su OK. Avanti e fine. Una volta calibrato il software, aprire un'immagine di un verme.Quindi, nel menu misura, selezionare calibrazione e successivamente fare clic su seleziona spaziale. Nel menu a discesa, selezionare il nome del file creato per la calibrazione del micrometro. Quindi, nel menu misura, selezionare misurazioni nella finestra che si apre.Selezionare lo strumento di disegno libero e, utilizzando il mouse del computer, tracciare una linea attraverso il centro del corpo dell'animale dalla testa alla coda. La lunghezza verrà riportata nella finestra. Ripetere questo procedimento per tutti gli animali nel campo visivo.Esportare le misurazioni della lunghezza in un file di Microsoft Excel o in un altro software statistico appropriato. Analizzare i dati calcolando la media e la deviazione standard per ogni campione. Successivamente, confrontare i risultati per ciascun gruppo utilizzando un test T di Student.La proteina DBL uno della superfamiglia del fattore di crescita trasformante beta o TGF beta è necessaria per l'attivazione della via del TGF beta. In risposta all'attivazione del segnale, i trasduttori del segnale intracellulari di tipo smad si traslocano nel nucleo e avviano la trascrizione genica. I vermi eleganti in cui la via del TGF beta è interrotta presentano una taglia corporea ridotta, con una lunghezza del corpo più corta rispetto agli animali di tipo selvatico.Pertanto, schermate per Caenorhabditis elegans. Mutanti per la dimensione del corpo sono in grado di identificare componenti e modificatori della via di segnalazione TGF beta e di verificare l'efficacia dell'RNAi mediante alimentazione per l'identificazione di mutanti per la dimensione del corpo. L'RNAi è stato utilizzato per ridurre l'espressione dei componenti della via DBL-1, SMA-3 e SMA-6, in quattro ceppi diversi di Caenorhabditis elegans.I ceppi di C. elegans testati includevano due ceppi ipersensibili all'RNAi, A uno, Lin 15 B e RF tre, oltre al ceppo selvatico standard N due e al ceppo LIN 36, la cui sensibilità all'RNAi è simile a quella di N due, come mostrato qui. Quando l'espressione di SMA tre o SMA sei è stata interrotta, gli animali hanno mostrato una dimensione corporea significativamente più ridotta rispetto agli animali di controllo, ad eccezione dell'RNAi per SMA sei in Lin 36. Sfondo in RF tre.Le lunghezze del corpo degli adulti giovani dopo il trattamento con RNAi erano dall'84 al 95% rispetto al vettore controllo. In un ceppo Lin-15B, le lunghezze del corpo degli adulti giovani dopo l'RNAi erano dal 68 all'86% rispetto agli animali di controllo. Tuttavia, il ceppo lin-15B produce pochi prole.Questo li rende inadatti per schermate su larga scala. Pertanto, si consiglia l'uso del ceppo RF a tre ceppi per queste tecniche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare i geni che regolano la crescita e le dimensioni corporee utilizzando la tecnica di interferenza RNI.

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Quantitative e automatica High-throughput Genome-wide Schermi RNAi in C. elegans</em

RNAi è un potente strumento genetico a disposizione dei ricercatori di C. elegans. Questo video presenta un metodo per trattare più vermi con RNAi rispetto all'alimentazione su piastra utilizzando condizioni di coltura liquida.

Alimentazione dell'RNAi in coltura liquida: un metodo ad alto rendimento per abbattere l'espressione genica in C. elegans

Mentre dsRNA alimentazione in C. elegans è un potente strumento per valutare la funzione del gene, i protocolli attuali schermi di alimentazione su larga scala producono efficienze atterramento variabili. Descriviamo un protocollo migliorato per eseguire larga scala RNAi schermi alimentazione che si traduce in knockdown altamente efficace e riproducibile di espressione genica.

Su larga scala Knockdown Gene in<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizzo di librerie di alimentazione dsRNA per generare fenotipi Robusti Perdita di funzione

C. elegans è emerso come un nuovo modello genetico per studiare le interazioni ospite-patogeno. Qui si descrive un protocollo per infettare C. elegans con Salmonella typhimurium accoppiato con la tecnica RNAi doppio filamento interferenze per esaminare il ruolo dei geni ospitanti in difesa contro le infezioni da Salmonella.

Un protocollo Infettare<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Con<em&gt; Salmonella typhimurium</em

Qui dettagliamo i protocolli specificamente progettati per monitorare i difetti morfogenici che si verificano durante le fasi precoci e tardive dell'allungamento embrionale del nematode Caenorhabditis elegans. In definitiva, questi protocolli sono progettati per identificare i geni che regolano queste fasi e per caratterizzare i loro requisiti differenziali lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione.

Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Questo protocollo viene illustrato come monitorare una traslocazione nucleare della proteina sotto stress da calore utilizzando una proteina di fusione di fluorescenza verde protein (GFP) come indicatore e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) colorazione. Il protocollo di colorazione DAPI è veloce e preserva i segnali di localizzazione sottocellulare della proteina e GFP.

Rilevamento di localizzazione sottocellulare della proteina di verde fluorescenza della proteina Tagging e 4', 6-Diamidino-2-phenylindole macchiatura in Caenorhabditis elegans

Per studiare le interazioni chaperone-chaperone e chaperone-substrato, eseguiamo screening di interazione sintetica in Caenorhabditis elegans utilizzando l'interferenza dell'RNA in combinazione con mutazioni lievi o sovraespressione di chaperoni e monitoriamo la disfunzione proteica tessuto-specifica a livello di organismo.

Utilizzo di Caenorhabditis elegans per lo screening delle interazioni chaperone tessuto-specifiche

Caenorhabditis elegans funge da eccellente sistema modello con metodi robusti e a basso costo per il rilevamento della durata della salute, della durata della vita e della resilienza allo stress.

Rilevamento di metodi a basso costo per misurare la durata della vita e la durata della salute in Caenorhabditis elegans

Impara la tecnica di alimentazione RNAi per identificare geni che regolano la crescita e le dimensioni corporee in C. elegans. Questo metodo consente screening genetico su larga scala attraverso la via di segnalazione DBL-1/TGF-β.

Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode C. elegans (Video) | JoVE Journal

Utilizzo di RNA-mediata strategia di alimentazione di interferenza secondo schermo per geni coinvolti nella regolazione Dimensione del corpo nel nematode

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