Imaging pHluorin-tagged inserimento recettore alla membrana plasmatica nella Primaria neuroni mouse coltivate

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare i recettori neuronali mentre vengono inseriti nella membrana plasmatica di neuroni primari murini coltivati. A tale scopo, i GL murini vengono ottenuti dalla corteccia cerebrale di topi embrionali o neonati e coltivati su inserti per coltura rivestiti di collagene e semipermeabili. Le colture gliali vengono sospese sopra neuroni ippocampali embrionali primari posti su coprioggetti.

Successivamente, dopo sette giorni di condizionamento, i neuroni vengono trasfettati con un recettore della dopamina D2 etichettato con una fluorina super eclittica. Il recettore marcato si localizza nei vescicoli intracellulari, ma rimane non fluorescente nell'ambiente acido dei vescicoli. Tuttavia, quando il vescicolo si fonde con la membrana plasmatica, la fluorina viene esposta al pH neutro dell'ambiente extracellulare e diventa fortemente fluorescente, permettendone la rilevazione mediante microscopia a fluorescenza con riflessione totale.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo del traffico delle proteine di membrana, permettendoci di visualizzare il traffico di qualsiasi proteina di membrana che possa essere marcata con fluorocromo, come i recettori del glutammato e i recettori accoppiati a proteine G. A dimostrazione della procedura insieme a me oggi saranno presenti Breeding Dry e, e noi uno, due altri membri del nostro gruppo di ricerca. Il giorno precedente la procedura di dissezione, riempire fiasche T75 con soluzione di collagene, posizionare le fiasche in posizione verticale e lasciarle asciugare tutta la notte. Il giorno della coltura di cellule gliali, riscaldare il mezzo per le cellule gliali per almeno 30 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius; dopo l'eutanasia, dissezionare le cortici cerebrali di topi embrionali o neonati al microscopio stereoscopico.

Posizionare le cortecce rimosse in un tubo conico da 15 millilitri riempito con liquido cerebrospinale artificiale freddo di ghiaccio, o LCR. Successivamente, rimuovere tutto il liquido tranne due millilitri di LCR e aggiungere 100 microlitri di soluzione di pepasina e 20 microlitri di DNAsi al 1%. Porre il tubo in un bagno termocontrollo a 37 gradi Celsius e lasciare digerire il tessuto per 20 minuti.

Dopo la digestione, lavare attentamente i tessuti cerebrali rimuovendo con cura la soluzione di proteasi e aggiungendo 10 millilitri di mezzo gliale preriscaldato. Quindi, avendo cura di non disturbare il tessuto, rimuovere quanta più parte possibile del mezzo gliale.

Aggiungere due millilitri di mezzo gliale fresco e, utilizzando una pipetta di vetro liscia ottenuta con la fiamma, pipettare fino a quando il tessuto non è più visibile. Evitare la formazione di bolle una volta che il tessuto è completamente dissociato. Aggiungere altri otto millilitri di mezzo gliale fresco e pipettare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 70 micron.

Raccogliere il flusso in un tubo conico da 50 millilitri. Trasferire le cellule dissociate da due a tre embrioni in una fiasca T75 rivestita di collagene e coltivare a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari durante la notte; il giorno successivo aspirare il mezzo. Lavare le cellule una volta con 10 millilitri di PBS.

Quindi aggiungere da 10 a 15 millilitri di mezzo gliale fresco a ciascun flacone. Incubare le colture per 10-12 giorni, sostituendo il mezzo ogni tre o quattro giorni. Una volta raggiunta la confluenza, risciacquare le cellule gliali con PBS.

Quindi aggiungere cinque millimetri di tripsina 0,05% nel flacone e lasciare che le cellule si distacchino per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione breve, aggiungere il mezzo per cellule gliali e pipettare per staccare le cellule GL dal fondo del flacone. Suddividere le cellule in due nuovi flaconi T75 rivestiti di collagene.

Una volta raggiunta la confluenza, trattare con tripsina come in precedenza e seminare il contenuto di ogni fiala in piastre a sei pozzetti contenenti inserti per colture rivestiti con collagene. Posizionare gli inserti sopra due millilitri di mezzo di coltura per cellule gliali e coltivare le cellule per uno a sette giorni. Questi inserti con colture gliali verranno utilizzati per condizionare le colture neuronali.

Aggiungere quattro millilitri di mezzo di semina in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente coverslip rivestiti con polilisina puliti e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Questo passaggio aumenta la probabilità di sopravvivenza neuronale, probabilmente rimuovendo la polilisina residua il giorno successivo. Rimuovere il mezzo di semina e sostituirlo con due millilitri di mezzo di semina fresco.

Mezzo contenente il 2% del mezzo. Intintura B 27 per la coltura di neuroni ippocampali. Sotto un microscopio stereoscopico, dissezionare gli ippocampi dal tessuto cerebrale di quattro topi embrionali da E 15 a 18. Posizionare gli ippocampi in un tubo conico da 15 millilitri con tampone di dissezione freddo su ghiaccio.

Successivamente, dissezionare il corpo striato dal tessuto cerebrale di tre topi embrionali E15-E18 e posizionarli in un tubo conico separato da 15 millilitri contenente buffer di dissezione freddo di ghiaccio. Digestire il tessuto con pepaina come in precedenza. Quindi utilizzare un emocitometro.

Determinare il numero di cellule in ciascuna sospensione neuronale e seminare. Ogni coprislip con 0,4 volte 10 alla sesta cellule e coltivare in un incubatore a 37 gradi Celsius durante la notte. Per preparare gli inserti di coltura gliale per la condizionatura delle colture neuronali, aspirare il mezzo dagli inserti di coltura gliale e dalla piastra, e sostituirlo con due millilitri di mezzo fresco.

Il giorno successivo, posizionare i coverslip con i neuroni in ciascun pozzetto della piastra al di sotto degli inserti con colture gliali. Continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius, sostituendo ogni tre o quattro giorni la metà del mezzo con mezzo di alimentazione fresco, preriscaldato, contenente B 27, fino a quando non saranno pronti per esperimenti di trasfezione e di imaging.

I neuroni verranno trasfettati al settimo giorno e osservati al microscopio all'ottavo giorno di coltura. Una coltura neuronale costante è fondamentale per esperimenti di imaging vitale di successo. Questa figura mostra neuroni ippocampali di topo coltivati con questo protocollo da 11 giorni in vitro fino a 18 giorni in vitro.

È evidente dalle immagini che i neuroni hanno sviluppato processi estesi e che i processi dendritici sono densamente ricoperti da spine dendritiche. Indicazioni che questi neuroni sono sani in coltura per ogni coltura neuronale. Combinare due microlitri di lipezione in 2001 microgrammi di DNA e codificare il recettore della dopamina D2 marcato con florina super eclittica.

Mescolare e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, rimuovere e trasferire un millilitro di mezzo da sotto e un millilitro dall'interno di ciascun inserto di coltura gliale nello stesso tubo conico. Successivamente, aggiungere lo stesso volume di mezzo di alimentazione contenente B 27 al mezzo conservato e incubare a 37 gradi Celsius.

Questo mezzo verrà utilizzato per la coltura neuronale successivamente alla trasfezione, dopo l'incubazione momentanea del DNA per 20 minuti con l'effetto lip. Rimuovere gli inserti della coltura gliale dalle piastre a sei pozzetti. Aggiungere la miscela di DNA lipectomica da 200 microlitri a ciascun coverslip con neuroni.

Evitare la formazione di bolle sotto la membrana della coltura. Sostituire gli inserti per coltura gliale e incubare a 37 gradi Celsius per due o quattro ore. Al termine dell'incubazione, rimuovere nuovamente gli inserti gliali ed aspirare la soluzione di trasfezione da ogni pozzetto, quindi aggiungere i due millilitri di mezzo precedentemente conservati ai neuroni e reinserire gli inserti per coltura gliale.

Infine, rimuovere il mezzo gliale da ogni inserto e aggiungere due millilitri del mezzo conservato a ciascuna coltura. Lasciare le cellule per ulteriori 24-72 ore per consentire l'espressione del CD NA transfettato. Il sistema di imaging TIRF utilizzato in questo video è un allestimento personalizzato dotato di un laser ciano da 100 milliwatt per l'eccitazione e una telecamera CCD a moltiplicazione elettronica come rivelatore. Trenta minuti prima dell'inizio dell'imaging, riscaldare l'ACSf a 37 gradi Celsius in un bagno termocontrollato. Accendere inoltre il laser, la telecamera e l'inserto riscaldante, quindi posizionare l'inserto riscaldante sul palchetto del microscopio.

Posizionare un vetrino con neuroni trasfettati in una camera per imaging in vivo e aggiungere rapidamente A CSF preriscaldato. Posizionare la camera sull'inserto riscaldante del palchetto del microscopio in modalità di imaging epi fluorescente, identificare i neuroni trasfettati. Quindi, in modalità di imaging TIRF, effettuare il fotobiancamento dei neuroni per un minuto per eliminare qualsiasi fluorescenza preesistente del fluorocromo sulla membrana plasmatica.

Successivamente, impostare il guadagno del moltiplicatore elettronico sulla camera E-M-C-C-D al valore massimo e iniziare ad acquisire immagini per un minuto a 10 hertz. Ogni registrazione conterrà 600 immagini una volta completata l'acquisizione. Analizzare i dati utilizzando Image J per determinare l'inserzione nella membrana del recettore della dopamina D due.

Un neurone medio-spinoso di topo è stato trasfettato con il recettore della dopamina D2 marcatore super eclittico Florin. È stata quindi eseguita un'immagine TIRF in tempo reale, acquisendo 600 immagini a una frequenza di un'immagine ogni 100 millisecondi. Questa immagine mostra la proiezione dell'intensità massima della registrazione in time-lapse; la freccia bianca indica i punti in cui singole vescicole contenenti pH DD2 si sono fuse con la membrana plasmatica.

Questa immagine mostra la proiezione di intensità massima YT in cui lo stack XYT è ruotato di 90 gradi attorno all'asse Y e il pixel massimo su ciascuna linea dell'asse X viene proiettato su un singolo pixel dell'asse y. Per fornire informazioni sulla cronologia dell'inserzione, questi dati dimostrano che questo metodo può essere impiegato con successo per esaminare la regolazione dell'inserzione nella membrana plasmatica dei recettori nei neuroni murini in coltura dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del traffico dei recettori neuronali per esplorare la regolazione di altri recettori, canali e trasportatori della membrana plasmatica neuronale.