Name: Imaging pHluorin-tagged inserimento recettore alla membrana plasmatica nella Primaria neuroni mouse coltivate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Impara a visualizzare l'inserimento del recettore D2 dopaminergico nella membrana plasmatica di neuroni primari di topo coltivati. Questo metodo consente l'osservazione in tempo reale del traffico recettoriale mediante microscopia TIRF.

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Questo lavoro è sostenuto da fondi di avvio di The Jackson Laboratory.

1. Preparazione Glia Cultura del mouse per Condizionamento Cultura neuronale <ol><li> T75 beute sono rivestiti con una soluzione di collagene (1:3 diluizione Purecol in DDH 2 O). Le beute sono in posizione verticale e lasciato asciugare per una notte in una cappa di coltura tissutale. </li><li> Dissezione buffer (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 30 mM glucosio, 25 mM HEPES, pH 7,4, senza calcio) e supporti glia (DMEM supplementato con 10% FBS, 10 unità / ml di penicillina, 10 ug / ml di streptomicina, e Glutamax) sono preparati e conservati a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Il giorno della cultura glia, i media glia viene riscaldato per almeno 30 minuti in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C prima della dissezione del cervello di topo. Topi embrionali o neonatale sono sacrificati per decapitazione rapida. Cortecce cerebrali sono sezionato sotto un microscopio dissezione. </li><li> Tessuti cerebrali sezionati vengono digeriti in soluzione di papaina (100 ml papaina e 20 microlitri DNasi I 1% in 2 ml di tampone dissezione) a 37 ° C for 20 min. </li><li> Dopo la digestione papaina, tessuti cerebrali vengono sciacquati con 10 ml di pre-riscaldate supporti glia. Supporti glia freschi (2 ml) viene quindi aggiunta ai tessuti cerebrali digeriti, ei tessuti vengono triturato con un fuoco lucidato vetro pipetta Pasteur. </li><li> Supporti glia freschi (8 ml) viene aggiunto ai tessuti dissociate. A 70 micron cella-filtro viene utilizzato per filtrare la sospensione dissociato tessuto. Le cellule vengono quindi seminate in fiasche T75 (solitamente 2-3 embrioni possono seme uno beuta T75) e posta in un 37 ° C incubatore per colture cellulari. </li><li> Il giorno dopo, i media dei palloni T75 viene aspirato. Le beute vengono risciacquati con 10 ml di PBS. Supporti glia fresco (10-15 ml) viene poi aggiunto a ciascun contenitore. </li><li> Entro 10-12 giorni, glia nelle T75 flaconi devono essere confluenti. Cellule gliali sono lavate con PBS, e 5 ml di 0,05% tripsina viene aggiunto a ciascuna beuta T75. </li><li> Dopo incubazione tripsina a 37 ° C per 5 minuti, le cellule gliali sono cellule dissociate e gliali da ciascuna beuta T75 sono divisi in duediversi collagene rivestite T75 palloni. </li><li> Inserti Cultura (Millipore PICM03050) sono preparati ponendoli in piastre da 6 pozzetti, rivestimento con collagene, e aria di essiccazione durante la notte. Supporti glia (2 ml ciascuna) si trova sotto ogni inserto cultura. </li><li> Glia da confluenti T75 recipienti vengono tripsinizzate e seminate su gli inserti culturali (uno T75 pallone per piastra da 6 pozzetti, 2 ml ogni inserto). Questi inserti glia cultura saranno utilizzati per il condizionamento delle colture neuronali. </li></ol> 2. Cultura neuronale <ol><li> I vetrini per colture neuronali vengono puliti mediante immersione nel 70% HNO3 almeno una notte. Vetrini vengono quindi lavati con DDH 2 O almeno 3 volte, ed essiccato in un forno Isotemp (&gt; 200 ° C) per una notte. </li><li> Coprioggetti puliti sono posti in una piastra da 6 pozzetti, uno coprioggetto per pozzetto. Coprioggetti sono rivestite con poli-L-lisina soluzione (2 ml, 0,1% in 100 mM di acido borico, pH = 8,5) durante la notte in un incubatore a 37 ° C. </li><li> Ilpoli-L-lisina soluzione viene rimossa dai vetrini coprioggetto e vengono lavate 3 volte con autoclavato DDH 2 O. Coprioggetti vengono poi incubate a 37 ° C per una notte in terreni in piastra (Neurobasal supplementato con 5% di siero siero di cavallo, 10 unità / ml di penicillina, 10 mg / ml di streptomicina, Glutamax incubatore; 2% B27 supplemento viene aggiunto al mezzo di placcatura il giorno in cui viene utilizzato). </li><li> Il giorno seguente, i mezzi di placcatura viene rimosso e 2 ml di terreni in piastra freschi con B-27 viene aggiunto a ciascun pozzetto che ha un vetrino coprioggetto. </li><li> Topi in gravidanza (E15-18) sono sacrificati con CO 2, e topi embrionali sono eutanasia per decapitazione. L&#39;ippocampo o striato è sezionato dal tessuto cerebrale e posta in un tubo da 15 ml con tampone ghiacciato dissezione, per la coltura di neuroni ippocampali o neuroni striatali medium spiny, rispettivamente. </li><li> Tessuti cerebrali sezionati sono dissociate con papaina come descritto ai punti 1.4) e 1.5). </li><li> Fopo dissociazione, il numero di cellule in ciascuna sospensione neuronale è conteggiato con un emocitometro. Neuroni vengono quindi seminate su ciascun vetrino ad una densità di 0,4 x 10 6 cellule per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti e coltivate in un incubatore a 37 ° C overnight (neuroni sono DIV 0). </li><li> Per preparare inserti per coltura glia condizionamento le colture neuronali, il supporto viene rimosso dal glia inserti di coltura glia e medie placcatura fresco è aggiunto (2 ml nell&#39;inserto e 2 ml sotto l&#39;inserto). </li><li> Il giorno successivo (DIV 1), coprioggetto con i neuroni sono posti sotto inserti di coltura glia, un vetrino in ciascun pozzetto. </li><li> I neuroni sono alimentati con la metà del volume di nuove pre-riscaldate supporti di alimentazione (con B-27) ogni 3-4 giorni fino a quando non sono pronti per esperimenti di trasfezione e di imaging. </li></ol> 3. Transfection <ol><li> Trasfezione neuronale viene eseguita utilizzando Lipofectamine 2000. Per ogni cultura neuronale (una cultura per vetrino), 2 microlitriLipofectamine 2000 e 1 pg di DNA vengono utilizzati. Fresco media Neurobasal senza supplemento viene utilizzato per diluire Lipofectamine e DNA. </li><li> DNA e Lipofectamine sono incubate per 20 minuti a temperatura ambiente dopo la miscelazione. </li><li> Salva 1 ml di mezzi di comunicazione da sotto ogni inserimento cultura glia, e 1 ml da dentro ogni inserimento, e trasferire i media a un tubo conico. Aggiungere lo stesso volume di mezzi di alimentazione + B27 al mezzo salvato e incubare a 37 ° C. Questo mezzo è utilizzato per colture neuronali dopo trasfezione. </li><li> Seguendo il 20-min Lipofectamine / DNA incubazione, inserti di coltura glia vengono rimossi momentaneamente dai piastre da 6 pozzetti. Il 200 pl Lipofectamine / DNA miscela viene aggiunta a ciascun coprioggetto con i neuroni. Gli inserti glia coltura vengono poi restituiti a ciascun pozzetto, sopra i neuroni. Generazione di bolle sotto la membrana di inserti di coltura deve essere evitato. Neuroni sono incubate con l&#39;Lipofectamine / DNA miscela a 37 ° C per 2-4 ore. </li><li> Dopo the 2-4 ore periodo di incubazione, inserti glia vengono rimossi di nuovo. I terreni di coltura con il Lipofectamine / DNA miscela viene rimosso da ogni pozzetto. I media salvati al passo 3.3) è aggiunto neuroni (2 ml per pozzetto). Inserti di coltura glia vengono restituiti a ciascun pozzetto, e il supporto glia di ogni inserto viene rimosso, e 2 ml del terreno di passo 3,3) viene aggiunto in ogni inserto. </li><li> I neuroni sono coltivate per ulteriori 24-72 ore per permettere l&#39;espressione di cDNA trasfettate prima TIRF immagini viene eseguita su questi neuroni. </li></ol> 4. TIRF Imaging <ol><li> Artificiale liquido cerebrospinale (aCSF: 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 30 mM di glucosio, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, pH = 7,4) sarà utilizzato per vivo-imaging esperimenti. Il nostro sistema di imaging TIRF è personalizzato set-up con 100 mW Ciano laser per l&#39;eccitazione, e una carica dell&#39;elettrone Moltiplicando Coupled Device (EMCCD) fotocamera per un rivelatore. </li><li> Prima di esperimenti di imaging, il aCSF è avvertito in un 37 &amp; dad esempio, l&#39;acqua bagno C per almeno 30 minuti. L&#39;inserto di riscaldamento per l&#39;imaging in tempo reale viene posto sul piatto microscopio, e l&#39;inserto di riscaldamento, laser, e la fotocamera sono riscaldati per almeno 30 minuti prima dell&#39;inizio degli esperimenti di imaging. </li><li> Un coprioggetto con i neuroni trasfettati viene trasformata in live-imaging camera. Preriscaldata aCSF viene collocato nella camera dopo la camera è assemblato; questo passo dovrebbe essere completata il più rapidamente possibile. </li><li> Una volta che la camera è posizionato sull&#39;inserto riscaldamento sul palco microscopio, neuroni trasfettati sono identificati visivamente sotto epi-fluorescenza modalità di imaging. </li><li> Dopo sani neuroni trasfettati sono identificati (vedi figure 1 e 2), di solito effettuare 1 min di foto-candeggina per eliminare preesistente fluorescenza pHluorin sulla membrana plasmatica, come pHluorin recettori sulla membrana plasmatica hanno livelli di fluorescenza molto elevato quando TIRF immagini è appena partito, che interferisce con la visualizzazione dei singoli componentiertion eventi. </li><li> Dopo fotosbiancante, l&#39;impostazione del guadagno del moltiplicatore di elettroni sulla fotocamera EMCCD è impostato al massimo, e la registrazione viene eseguita per 1 min a 10 Hz. </li><li> Ogni registrazione conterrà 600 immagini. I singoli eventi di inserzione sono identificati giocando dietro registrazione con ImageJ. Eventi di inserimento individuali sono analizzati manualmente utilizzando ImageJ. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Coerentemente cultura neuronale è la chiave del successo dal vivo-imaging esperimenti. Figura 1 mostra i neuroni dell&#39;ippocampo di topo coltivate utilizzando il nostro protocollo da 11 a DIV DIV 18. E &#39;chiaro dalle immagini che i neuroni hanno sviluppato processi estensivi e che i processi dendritici sono coperte densamente di spine dendritiche, le indicazioni che questi neuroni sono sani di cultura. Nostro protocollo cultura potrebbe essere utilizzato anche per altri tipi di neuroni nel cervello. Ad esempio, abbiamo recentemente utilizzato questo protocollo alla culturastriatali neuroni spinosi medi in uno studio per esaminare recettore della dopamina D2 (DRD2) inserimento in colture di neuroni striatali medio del mouse spinosi 9. Figura 2 mostra il mouse medie neuroni spinosi striatali coltivate utilizzando il nostro protocollo a DIV 8. Abbiamo anche eseguito con successo TIRF imaging superecliptic DRD2s pHluorin-etichetta in questo tipo di neurone. Figura 3 mostra l&#39;espressione di pHluorin-etichettato DRD2 (pH-DRD2) in un neurone spinoso medio e visualizzazione di pH-DRD2 inserimento in questo neurone. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" /> Figura 1. Mouse cultura hippocampal utilizzando il metodo cultura dell&#39;interfaccia. DIV: giorni in vitro, il giorno della cultura è considerato come DIV 0. Dalle immagini, è evidente che i neuroni ippocampali maturi in questo tipo di coltura tra 11 e DIV DIV 15. A DIV 11 e 13, dendriti neuronali sono coperti di spine filipodia e immaturi. A 15 e DIV18, dendriti neuronali sono coperti di spine di grandi dimensioni, l&#39;indicazione di più neuroni maturi. I pannelli a sinistra: bassa ingrandimento immagini di neuroni ippocampali di topo di diverse età. Pannelli di destra: le immagini ad alto ingrandimento (zoom su dendriti neuronali del pannello di sinistra) di processi neuronali dendritiche con spine dendritiche di diverse età. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" /> Figura 2. Mouse striatale terreno spinoso neurone cultura utilizzando il metodo cultura dell&#39;interfaccia. I neuroni delle immagini sono in DIV 8. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" /> Figura 3. Un neurone striatale topo medio spinoso trasfettate con super eclittica pHluorin-tag del recettore D2 della dopamina (pH-DRD2). Immagine a sinistra è la proiezione massima intensità di un time-lapse (600 immagini, 100 msec per immagine). Frecce bianche indicano individuale inserimento vescicolare del pH-DRD2. Questa immagine conserva le informazioni di inserimento nella dimensione xy ma perde le informazioni sull&#39;ora. Immagine a destra mostra yt sporgenza massima intensità, in cui la pila XYT è ruotato di 90 gradi intorno all&#39;asse y, e il pixel massimo su ciascun asse x linea viene proiettata su un unico asse y pixel. Questa immagine mantiene informazioni inserimento lungo l&#39;asse yt ma perde l&#39;asse x informazioni.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per ragioni sconosciute, i neuroni di topo sono sempre più difficili da coltivare di neuroni di ratto. Nella nostra esperienza, una coltura mista di neuroni e glia funziona bene per primari neuroni di topo in coltura. Tuttavia, una tale coltura mista non è adatto per esperimenti di imaging TIRF, come in questo tipo di neuroni cultura ei processi tendono a crescere sopra cellule gliali, situando il somata neuronale e processi dendritici fuori dalla portata della microscopia TIRF. Pertanto, una densità minore colture neur...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nome del reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Azienda</strong</td&gt;<td<strong&gt; Numero di catalogo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commenti</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Purificato soluzione di collagene bovino (Purecol)</td&gt;<td&gt; Avanzate Biomatrix</td&gt;<td&gt; 5005-B</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hank soluzione salina bilanciata (HBSS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14185-045</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicillina-streptomicina (Pen Strep)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 15140-122</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sodio piruvato</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 11360-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM glucosio Alta</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 10313-021</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Siero fetale bovino (FBS)</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glutamax</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 35050-061</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Papaina</td&gt;<td&gt; Worthington Biochemical Corp.</td&gt;<td&gt; LS003126</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ho Deoxyribonuclease dal pancreas bovino (DNasi I)</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; DN25-10MG</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdFosfato&gt; Dulbecco Buffered Saline (DPBS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14190-144</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tripsina 0,05%</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 25300-054</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poli-L-lisina bromidrato</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; P2636-1G</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Acido borico</td&gt;<td&gt; Fisher-Scientifica</td&gt;<td&gt; BP 168-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Medio Neurobasal</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 21103-049</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B-27 siero-Free Supplemento</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Siero di cavallo calore inattiva</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 26050-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lipofectamine 2000</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11668 019</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Fisher-Scientifica</td&gt;<td&gt; BP310-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cultura Inserisci</td&gt;<td&gt; Millipore</td&gt;<td&gt; PICM03050</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

imaging phluorin-tagged inserimento recettore alla membrana plasmatica nella primaria neuroni mouse coltivate

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Una migliore comprensione dei meccanismi che regolano il traffico tra il recettore di membrana plasmatica (PM) e compartimenti intracellulari richiede un approccio sperimentale con ottime risoluzioni spaziali e temporali. Inoltre, tale approccio deve inoltre essere in grado di distinguere recettori localizzati sulla PM da quelli in compartimenti intracellulari. Soprattutto, rilevando recettori in una vescicola singola richiede spiccata sensibilità di rilevamento, poiché ogni vescicola trasporta soltanto un piccolo numero di recettori. Approcci standard per l&#39;esame di traffico recettore includono biotinilazione superficie seguita da rilevamento biochimiche, che manca sia le necessarie risoluzioni spaziali e temporali, e l&#39;esame al microscopio a fluorescenza di recettori di superficie immunolabeled, che richiede la fissazione chimica delle cellule e quindi manca di sufficiente risoluzione temporale 1-6. Per superare questi limiti, noi e altri hanno sviluppato e utilizzato una nuova strategia che consente la visualizzazione di inserimento dinamico di recettori in PM con eccellenti risoluzioni spaziali e temporali 7-17. Il metodo comprende la codifica di un pH-sensibile GFP, la superecliptic pHluorin 18, al N-terminale del dominio extracellulare del recettore. Superecliptic pHluorin ha la proprietà unica di essere fluorescente a pH neutro e non fluorescente a pH acido (pH &lt;6.0). Pertanto, i recettori sono contrassegnati non fluorescente quando all&#39;interno del lume di vescicole acide traffico intracellulare o compartimenti endosomali, e diventano facilmente visualizzato solo quando esposta all&#39;ambiente extracellulare pH neutro, sulla superficie esterna del PM. La nostra strategia permette quindi di distinguere recettori di superficie PM da quelle che, nell&#39;ambito del traffico vescicole intracellulari. Per raggiungere sufficienti risoluzioni spaziali e temporali, nonché la sensibilità necessaria per studiare il traffico dinamica dei recettori, abbiamo impiegato interna totale rifletteremicroscopia a fluorescenza di ioni (TIRFM), che ci ha permesso di ottenere la risoluzione ottimale spaziale di imaging ottico (~ 170 nm), la risoluzione temporale di video-tasso di microscopia (30 fotogrammi / sec), e la sensibilità per rilevare la fluorescenza di GFP unico molecola. Con immagini pHluorin-tagged recettori sotto TIRFM, siamo stati in grado di visualizzare direttamente i singoli eventi recettore inserimento nel PM in neuroni in coltura. Questo approccio di imaging può potenzialmente essere applicato a qualsiasi proteina di membrana con un dominio extracellulare che potrebbe essere etichettato con pHluorin superecliptic, e consentirà dissezione dei meccanismi principali modalità per l&#39;inserimento di differenti proteine ​​di membrana (recettori, canali ionici, trasportatori, ecc) per il PM.

Etichettando i domini extracellulari dei recettori di membrana con pHluorin superecliptic, e da imaging questi recettori di fusione in neuroni di topo in coltura, si può visualizzare direttamente i singoli eventi di inserzione vescicolari dei recettori della membrana plasmatica. Questa tecnica sarà determinante per chiarire i meccanismi molecolari che regolano l&#39;inserimento recettore alla membrana plasmatica.

Imaging pHluorin-tagged inserimento recettore alla membrana plasmatica nella Primaria neuroni mouse coltivate

Una migliore comprensione dei meccanismi che regolano il traffico dei recettori tra la membrana plasmatica (PM) e i compartimenti intracellulari richiede un...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare i recettori neuronali mentre vengono inseriti nella membrana plasmatica di neuroni primari murini coltivati. A tale scopo, i GL murini vengono ottenuti dalla corteccia cerebrale di topi embrionali o neonati e coltivati su inserti per coltura rivestiti di collagene e semipermeabili. Le colture gliali vengono sospese sopra neuroni ippocampali embrionali primari posti su coprioggetti.Successivamente, dopo sette giorni di condizionamento, i neuroni vengono trasfettati con un recettore della dopamina D2 etichettato con una fluorina super eclittica. Il recettore marcato si localizza nei vescicoli intracellulari, ma rimane non fluorescente nell'ambiente acido dei vescicoli. Tuttavia, quando il vescicolo si fonde con la membrana plasmatica, la fluorina viene esposta al pH neutro dell'ambiente extracellulare e diventa fortemente fluorescente, permettendone la rilevazione mediante microscopia a fluorescenza con riflessione totale.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo del traffico delle proteine di membrana, permettendoci di visualizzare il traffico di qualsiasi proteina di membrana che possa essere marcata con fluorocromo, come i recettori del glutammato e i recettori accoppiati a proteine G. A dimostrazione della procedura insieme a me oggi saranno presenti Breeding Dry e, e noi uno, due altri membri del nostro gruppo di ricerca. Il giorno precedente la procedura di dissezione, riempire fiasche T75 con soluzione di collagene, posizionare le fiasche in posizione verticale e lasciarle asciugare tutta la notte. Il giorno della coltura di cellule gliali, riscaldare il mezzo per le cellule gliali per almeno 30 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius; dopo l'eutanasia, dissezionare le cortici cerebrali di topi embrionali o neonati al microscopio stereoscopico.Posizionare le cortecce rimosse in un tubo conico da 15 millilitri riempito con liquido cerebrospinale artificiale freddo di ghiaccio, o LCR. Successivamente, rimuovere tutto il liquido tranne due millilitri di LCR e aggiungere 100 microlitri di soluzione di pepasina e 20 microlitri di DNAsi al 1%. Porre il tubo in un bagno termocontrollo a 37 gradi Celsius e lasciare digerire il tessuto per 20 minuti.Dopo la digestione, lavare attentamente i tessuti cerebrali rimuovendo con cura la soluzione di proteasi e aggiungendo 10 millilitri di mezzo gliale preriscaldato. Quindi, avendo cura di non disturbare il tessuto, rimuovere quanta più parte possibile del mezzo gliale.Aggiungere due millilitri di mezzo gliale fresco e, utilizzando una pipetta di vetro liscia ottenuta con la fiamma, pipettare fino a quando il tessuto non è più visibile. Evitare la formazione di bolle una volta che il tessuto è completamente dissociato. Aggiungere altri otto millilitri di mezzo gliale fresco e pipettare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 70 micron.Raccogliere il flusso in un tubo conico da 50 millilitri. Trasferire le cellule dissociate da due a tre embrioni in una fiasca T75 rivestita di collagene e coltivare a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari durante la notte; il giorno successivo aspirare il mezzo. Lavare le cellule una volta con 10 millilitri di PBS.Quindi aggiungere da 10 a 15 millilitri di mezzo gliale fresco a ciascun flacone. Incubare le colture per 10-12 giorni, sostituendo il mezzo ogni tre o quattro giorni. Una volta raggiunta la confluenza, risciacquare le cellule gliali con PBS.Quindi aggiungere cinque millimetri di tripsina 0,05% nel flacone e lasciare che le cellule si distacchino per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione breve, aggiungere il mezzo per cellule gliali e pipettare per staccare le cellule GL dal fondo del flacone. Suddividere le cellule in due nuovi flaconi T75 rivestiti di collagene.Una volta raggiunta la confluenza, trattare con tripsina come in precedenza e seminare il contenuto di ogni fiala in piastre a sei pozzetti contenenti inserti per colture rivestiti con collagene. Posizionare gli inserti sopra due millilitri di mezzo di coltura per cellule gliali e coltivare le cellule per uno a sette giorni. Questi inserti con colture gliali verranno utilizzati per condizionare le colture neuronali.Aggiungere quattro millilitri di mezzo di semina in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente coverslip rivestiti con polilisina puliti e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Questo passaggio aumenta la probabilità di sopravvivenza neuronale, probabilmente rimuovendo la polilisina residua il giorno successivo. Rimuovere il mezzo di semina e sostituirlo con due millilitri di mezzo di semina fresco.Mezzo contenente il 2% del mezzo. Intintura B 27 per la coltura di neuroni ippocampali. Sotto un microscopio stereoscopico, dissezionare gli ippocampi dal tessuto cerebrale di quattro topi embrionali da E 15 a 18. Posizionare gli ippocampi in un tubo conico da 15 millilitri con tampone di dissezione freddo su ghiaccio.Successivamente, dissezionare il corpo striato dal tessuto cerebrale di tre topi embrionali E15-E18 e posizionarli in un tubo conico separato da 15 millilitri contenente buffer di dissezione freddo di ghiaccio. Digestire il tessuto con pepaina come in precedenza. Quindi utilizzare un emocitometro.Determinare il numero di cellule in ciascuna sospensione neuronale e seminare. Ogni coprislip con 0,4 volte 10 alla sesta cellule e coltivare in un incubatore a 37 gradi Celsius durante la notte. Per preparare gli inserti di coltura gliale per la condizionatura delle colture neuronali, aspirare il mezzo dagli inserti di coltura gliale e dalla piastra, e sostituirlo con due millilitri di mezzo fresco.Il giorno successivo, posizionare i coverslip con i neuroni in ciascun pozzetto della piastra al di sotto degli inserti con colture gliali. Continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius, sostituendo ogni tre o quattro giorni la metà del mezzo con mezzo di alimentazione fresco, preriscaldato, contenente B 27, fino a quando non saranno pronti per esperimenti di trasfezione e di imaging.I neuroni verranno trasfettati al settimo giorno e osservati al microscopio all'ottavo giorno di coltura. Una coltura neuronale costante è fondamentale per esperimenti di imaging vitale di successo. Questa figura mostra neuroni ippocampali di topo coltivati con questo protocollo da 11 giorni in vitro fino a 18 giorni in vitro.È evidente dalle immagini che i neuroni hanno sviluppato processi estesi e che i processi dendritici sono densamente ricoperti da spine dendritiche. Indicazioni che questi neuroni sono sani in coltura per ogni coltura neuronale. Combinare due microlitri di lipezione in 2001 microgrammi di DNA e codificare il recettore della dopamina D2 marcato con florina super eclittica.Mescolare e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, rimuovere e trasferire un millilitro di mezzo da sotto e un millilitro dall'interno di ciascun inserto di coltura gliale nello stesso tubo conico. Successivamente, aggiungere lo stesso volume di mezzo di alimentazione contenente B 27 al mezzo conservato e incubare a 37 gradi Celsius.Questo mezzo verrà utilizzato per la coltura neuronale successivamente alla trasfezione, dopo l'incubazione momentanea del DNA per 20 minuti con l'effetto lip. Rimuovere gli inserti della coltura gliale dalle piastre a sei pozzetti. Aggiungere la miscela di DNA lipectomica da 200 microlitri a ciascun coverslip con neuroni.Evitare la formazione di bolle sotto la membrana della coltura. Sostituire gli inserti per coltura gliale e incubare a 37 gradi Celsius per due o quattro ore. Al termine dell'incubazione, rimuovere nuovamente gli inserti gliali ed aspirare la soluzione di trasfezione da ogni pozzetto, quindi aggiungere i due millilitri di mezzo precedentemente conservati ai neuroni e reinserire gli inserti per coltura gliale.Infine, rimuovere il mezzo gliale da ogni inserto e aggiungere due millilitri del mezzo conservato a ciascuna coltura. Lasciare le cellule per ulteriori 24-72 ore per consentire l'espressione del CD NA transfettato. Il sistema di imaging TIRF utilizzato in questo video è un allestimento personalizzato dotato di un laser ciano da 100 milliwatt per l'eccitazione e una telecamera CCD a moltiplicazione elettronica come rivelatore. Trenta minuti prima dell'inizio dell'imaging, riscaldare l'ACSf a 37 gradi Celsius in un bagno termocontrollato. Accendere inoltre il laser, la telecamera e l'inserto riscaldante, quindi posizionare l'inserto riscaldante sul palchetto del microscopio.Posizionare un vetrino con neuroni trasfettati in una camera per imaging in vivo e aggiungere rapidamente A CSF preriscaldato. Posizionare la camera sull'inserto riscaldante del palchetto del microscopio in modalità di imaging epi fluorescente, identificare i neuroni trasfettati. Quindi, in modalità di imaging TIRF, effettuare il fotobiancamento dei neuroni per un minuto per eliminare qualsiasi fluorescenza preesistente del fluorocromo sulla membrana plasmatica.Successivamente, impostare il guadagno del moltiplicatore elettronico sulla camera E-M-C-C-D al valore massimo e iniziare ad acquisire immagini per un minuto a 10 hertz. Ogni registrazione conterrà 600 immagini una volta completata l'acquisizione. Analizzare i dati utilizzando Image J per determinare l'inserzione nella membrana del recettore della dopamina D due.Un neurone medio-spinoso di topo è stato trasfettato con il recettore della dopamina D2 marcatore super eclittico Florin. È stata quindi eseguita un'immagine TIRF in tempo reale, acquisendo 600 immagini a una frequenza di un'immagine ogni 100 millisecondi. Questa immagine mostra la proiezione dell'intensità massima della registrazione in time-lapse; la freccia bianca indica i punti in cui singole vescicole contenenti pH DD2 si sono fuse con la membrana plasmatica.Questa immagine mostra la proiezione di intensità massima YT in cui lo stack XYT è ruotato di 90 gradi attorno all'asse Y e il pixel massimo su ciascuna linea dell'asse X viene proiettato su un singolo pixel dell'asse y. Per fornire informazioni sulla cronologia dell'inserzione, questi dati dimostrano che questo metodo può essere impiegato con successo per esaminare la regolazione dell'inserzione nella membrana plasmatica dei recettori nei neuroni murini in coltura dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del traffico dei recettori neuronali per esplorare la regolazione di altri recettori, canali e trasportatori della membrana plasmatica neuronale.

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Neuroscienze

Questo protocollo delinea i passaggi necessari per analizzare, attraverso trasfezione elettroporazione e neuroni dell'ippocampo e del mouse cultura corticale. Colture a breve termine possono essere utilizzati per gli studi della crescita degli assoni e la guida, mentre a lungo termine le culture possono essere utilizzati per studi di sinaptogenesi e analisi spine dendritiche.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Questo rapporto descrive l'uso di imaging cellulare dal vivo e le tecniche di fotosbiancante per determinare l'espressione di superficie, vie di trasporto e la cinetica di traffico esogeno espresso, sensibile al pH GFP-tagged proteine ​​a livello della membrana plasmatica dei neuroni.

Diffusione laterale e esocitosi delle proteine ​​di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

Fonte: Schönherr, S., et. al. Immunomarcatura combinata optogenetica e replica di frattura da congelamento per esaminare la disposizione specifica dell'input dei recettori del glutammato nell'amigdala di topo. J. Vis. Exp. (2016)Questo video dimostra l'immunomarcatura di repliche fratturate da congelamento di tessuto cerebrale di topo per la microscopia elettronica. Le repliche fratturate e rivestite vengono digerite per esporre i recettori. Gli anticorpi primari e secondari marcati con oro...

Immunomarcatura delle proteine della membrana neuronale in un campione di tessuto cerebrale di topo con frattura da congelamento

Fonte: Lacin, E., et al. Costruzione di reporter ingegnerizzati fluorescenti per neurotrasmettitori cellulari (CNiFER) per il rilevamento ottico di neurotrasmettitori in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra una tecnica per l'imaging del rilascio di neurotrasmettitori in vivo utilizzando reporter ingegnerizzati fluorescenti di neurotrasmettitori basati su cellule (CNiFER), cellule reporter specializzate pre-iniettate nella corteccia del topo. Posizionato sotto un microscopio a due...

Imaging del rilascio di neurotrasmettitori utilizzando reporter ingegnerizzati fluorescenti con neurotrasmettitore basato su cellule

Qui, viene presentata una procedura per attivare selettivamente una proteina neuronale con un breve impulso di luce codificando geneticamente un amminoacido innaturale foto-reattivo in una proteina neuronale bersaglio espressa in neuroni in coltura o in vivo.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

Etichettare il dominio extracellulare di una proteina di membrana con un fluoroforo sensibile pH, superecliptic pHluorin (SEP), permette la localizzazione subcellulare, espressione, e il traffico da determinare. proteine ​​Imaging SEP-etichettato con riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM) consente la quantificazione dei livelli di proteine ​​nella membrana ER e nel plasma periferico.

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Qui è presentato un protocollo per indagare gli effetti precoci dell'amiloide-β (Aβ) nel cervello.  Questo dimostra che Aβ induce endocytosis clathrin-mediato e crollo dei coni di crescita assonale. Il protocollo è utile per studiare effetti precoci di Aβ sui coni di crescita assonale e può facilitare la prevenzione del morbo di Alzheimer.

Visualizzazione di collasso del cono di crescita assonale ed effetti precoci β amiloide in neuroni coltivati del topo

In questa relazione, descriviamo un semplice protocollo per studiare la escrescenza di neurite nei neuroni corticali embrionali del ratto co-traducendo con EGFP e la proteina di interesse.

Un saggio basato sulle proteine con fluorescenza verde potenziato per studiare la crescita neurite nei neuroni primari

Qui presentiamo un protocollo per misurare i flussi in vitro di Ca2 nei neuroni midbrain e i loro effetti a valle sulla caspase-3 utilizzando colture midbrain topo primario. Questo modello può essere utilizzato per studiare i cambiamenti patofsiologici legati all'attività anormale di Ca2 nei neuroni midbrain e per lo screening di nuove terapie per le proprietà anti-apoptotiche.

Quantificare i flussispontanei di Ca 2 e i loro effetti a valle nei neuroni Midbrain del topo primario

Qui, descriviamo un protocollo che combina l'iniezione di virus adeno-associato con l'impianto di finestre craniche per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Impara a visualizzare l'inserimento del recettore D2 dopaminergico nella membrana plasmatica di neuroni primari di topo coltivati. Questo metodo consente l'osservazione in tempo reale del traffico recettoriale mediante microscopia TIRF.

Imaging pHluorin-tagged inserimento recettore alla membrana plasmatica nella Primaria neuroni mouse coltivate

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