Name: Rilevamento di palmitoilazione proteina in colture di neuroni ippocampali di immunoprecipitazione e di acil-Biotina Exchange (ABE) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Impara a rilevare la palmitoilazione proteica in colture di neuroni ippocampali utilizzando l'assaggio ABE. Questo metodo biochimico offre maggiore sensibilità e rapidità rispetto alle tecniche esistenti.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal Canadian Institutes of Health Research MOP-81158.

1. Estrazione di proteine ​​target da colture di neuroni primari ippocampali <ol><li> Prima raccolta proteina endogena da cellule primarie ippocampali, preparare un tampone di lisi (LB, Tabella 1) con inibitori della proteasi. A 10 ml di tampone di lisi, aggiungere 0,1 ml di soluzione phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF) ad una concentrazione finale di 10 mM, e aggiungere 1 inibitore della proteasi cocktail compressa. </li><li> Preparare N-etilmaleimmide (NEM) soluzione (Tabella 1) dalla polvere liofilizzata. Sciogliere delicatamente in EtOH al 100% a temperatura ambiente (RT). Sempre preparare soluzione NEM fresco per il giorno dell&#39;esperimento. </li><li> Successivo combinare il tampone di lisi e NEM. Aggiungere 0,5 ml di soluzione 2M NEM in una nuova tubo da 50 ml. Aggiungere 20 ml di LB più alto, e rapidamente luogo LB + NEM (concentrazione finale di 50 mM) su una piattaforma oscillante a 4 ° C per mescolare completamente per 5 min. Aggiungere sempre NEM / EtOH secondi prima soluzione e LB, così da miscelare correttamente i due. </li><li> Rimuovere neuroni in coltura da incubatore e posto su ghiaccio *. Delicatamente rimuovere i supporti cellulari, e delicatamente lavare due volte con fosfato freddo soluzione salina tamponata (PBS) 1x. Aggiungere 300 ml di LB + NEM 50 mM al primo pozzo di neuroni ippocampali e cellule, raschiare con un sollevatore usa e getta cella. Raccogliere il lisato cellulare, quindi scaricare il lisato nel pozzo successivo di quel gruppo. Raschiare le cellule all&#39;interno del secondo pozzo di azionare il sollevatore cella, raccogliere, e ripetere con un pozzo terzo, se necessario, per concentrare ulteriormente il lisato. </li><li> Raccogliere lisato cellulare in un pre-raffreddata (su ghiaccio), 1,5 ml microprovetta. Ripetere il passaggio 1,4 con 100 ml di LB + NEM 50mM a raccogliere tutte le rimanenti lisato cellulare. Passare lisato totale della cella attraverso una siringa da 26 ½ calibro 5-6 volte per facilitare la lisi meccanica, facendo attenzione a non soffiare bolle nella soluzione. Si può invece ultrasuoni per 15 secondi su ghiaccio, se l&#39;apparecchiatura è disponibile. Nutate lisato cellulare per ≥ 30 min a 4 ° C. </li><li> Chiarire il Lysa cellate per centrifugazione a 16.000 xg / 30 min, in modo da pellet un-cellule lisate e detergente-insolubili materiale. </li><li> Raccogliere azzerato lisato cellulare (surnatante) in una nuova pre-raffreddato 1,5 ml tubetto sul ghiaccio. Ripetere il protocollo di raccolta per tutti i gruppi di cellule. Misura la concentrazione di proteine ​​in tutti i campioni lisati mediante saggio BCA, e normalizzare il volume di tutti i campioni del lisato da gruppi di cellule di avere esattamente uguale proteine ​​totali, con una minima raccomandata di 500 mg. Riempire tutti i campioni con LB + NEM 50 mM a 500 microlitri di volume totale. </li><li> Aggiungere 1-5 pg di anticorpo primario diretto contro la proteina bersaglio per ciascun campione di lisato. Nutate anticorpo-lisato campioni misti notte a 4 ° C. </li></ol> Neuroni ippocampali di ratto primari * devono essere coltivate ad una densità di circa 250.000 cellule / pozzetto in un 6-ben piatto, in un siero mezzi privi contenenti un integratore B27 neuronale, come precedentemente descritto 5, e coltivate per il desideriolunghezza d di tempo, tipicamente 14-16 giorni in vitro (DIV) per raggiungere la maturità. Un minimo di 500 pg di proteina totale è consigliabile successo immunoprecipitare e biotinylate una proteina bersaglio neuronale, che richiede in genere 2-3 pozzetti di una 6-ben piatto. 2. Precipitazione di anticorpo legato proteina bersaglio <ol><li> Prima di precipitare e immobilizzare una proteina bersaglio, preparare un impasto al 50% di proteina A o proteina G-sefarosio perle rivestite. In particolare, aggiungere ≥ 60 ml di perline sefarosio per campione in provette da 1,5 ml, assicurando che tutti i campioni hanno la stessa quantità di perline. Branelli magnetici sono adatti anche se l&#39;apparecchiatura è disponibile. </li><li> Aggiungere un volume uguale del 50% slurry per ciascun anticorpo-lisato campione, e nutate ≥ per 1 ora a 4 ° C. </li></ol> 3. Acil-Biotina Exchange: Hydroxylamine (HAM) Cleavage <ol><li> Durante l&#39;esecuzione passo 2.2, preparare un certo numero di tubi con tampone di lisi (LB) di dipH fferent. Il pH è molto importante per i passaggi e deve sempre essere regolata usando un pH-metro. Preparare 2 ml di LB pH 7,2 per campione, e 0,5 ml di tampone per campione Stringente (Tabella 1). Anche preparare 0,5 ml di LB + NEM 10mM per campione, come nei passi 1,1-1,3. Aggiungi PMSF e compresse con inibitori della proteasi per tutti i buffer di lisi, come al punto 1.1. </li><li><ol class="lalpha"><li> Idrossilammina (HAM) è un potente agente riducente, quale clivaggio di palmitato di cisteine ​​è richiesto per biotinilazione (Figura 1), e l&#39;omissione del clivaggio HAM serve come controllo negativo. Dividere ogni campione di perline in due campioni, uno omettendo la fase HAM clivaggio (-HAM), e uno comprendente la fase HAM (+ HAM). Per normalizzare per la degradazione delle proteine ​​causata dal trattamento HAM, si dovrebbe dividere ogni campione in terzi, con 1/3 delle sfere usate per il controllo del-HAM, ed i restanti 2/3 utilizzato per il trattamento HAM +. </li><li> Preparare ulteriore 1.Provette da 5 ml su ghiaccio, etichettati come controllo della HAM-per ogni campione. Seguendo passo 2.2, centrifugare delicatamente perle tutti i campioni &quot;a 0.5 xg / 1 min a 4 ° C (centrifuga a questa velocità, la durata e la temperatura per tutti i passaggi rimanenti salvo diversa indicazione), posizionare i tubi in ghiaccio, rimuovere il supernatante e risospendere le sfere in 600 ml di LB + NEM 10mM. </li></ol></li><li> Dopo la ri-sospensione i campioni &quot;perle in tampone di lisi + NEM 10mM, immediatamente raccogliere 200 ml di del campione lisato-tallone liquami, e scarico in quel campione-HAM provetta in ghiaccio. Aggiungere un ulteriore 300 ml di LB + NEM 10mM a campione-HAM, e un ulteriore 100 pl di campione HAM + per un totale di 500 microlitri in ciascun campione. Incubare per 10 min in ghiaccio. </li><li> Risospendere (lavaggio) il-HAM e campioni di prosciutto + delicatamente con 0,5 ml di tampone rigorose, per campione. Eseguire questo passaggio velocemente, come incubazione più SDS comporterà la rimozione di anticorpo legato dalperline. </li><li> Lavare delicatamente tutti i campioni per tre volte in 0,5 ml / campione di pH LB 7.2, e spin down tra un lavaggio e come in 3.2b passo. </li><li> Durante l&#39;esecuzione passo 3.5, preparare un buffer HAM (Tabella 1). Aggiungere volume appropriato di soluzione di idrossilammina in una nuova provetta, per ottenere una concentrazione finale di 1 M in un volume di 0,5 ml LB pH 7,2, per esempio + HAM. Sempre preparare il buffer HAM fresco per il giorno dell&#39;esperimento. Aggiungere 0,5 ml / campione di pH 7,2 a LB-HAM tutti i campioni, e 0,5 ml / campione di tampone a campioni HAM HAM tutti +. </li><li> Nutate tutti i campioni per 1 ora a temperatura ambiente (RT). Non superare 1 ora. </li></ol> 4. Acil-Biotina Exchange: Biotina-BMCC Etichettatura <ol><li> Durante l&#39;esecuzione di passo 3,6, preparare 2 ml di LB pH 6,2 per campione (Tabella 1), come nel passo 3,1. Posizionare il pH LB 6.2 su ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. Anche preparare una soluzione stock di Biotina-BMCC (Tabella 1) immediatamente prima dell&#39;uso. Pesare exacTLY 2,1 mg di biotina-BMCC, raccogliere in una provetta da 1,5 ml, e delicatamente sciogliere in 0,5 ml di dimetil solfossido (DMSO), mettendo su una piattaforma oscillante a temperatura ambiente, per raggiungere la concentrazione 8mm (non usare una pipetta per rompere la polvere ). </li><li> Una volta che passo 3.6 è terminato, lavare delicatamente le perle una volta in pH 6,2 tampone di lisi, per rimuovere i residui di tampone HAM. Rimuovere il surnatante e mettere i campioni in ghiaccio. </li><li> Biotina-BMCC è una molecola maliemide biotina coniugata che ha una elevata affinità per i gruppi tiolici liberi di cisteine ​​(Figura 1). Durante l&#39;esecuzione di passo 4,2, preparare 0,5 ml di Biotina-BMCC Buffer (Tabella 1) per campione, a concentrazione di lavoro tra 0,5 pM a 5 micron. Concentrazioni superiori a 5 pM probabilmente saturare la proteina bersaglio 6, e in genere non deve essere superato, tuttavia questo può variare a seconda della proteina bersaglio desiderato. Aggiungere 0,5 ml di Biotina-BMCC tampone a ciascun campione, e nutate esattamente per 1 ora a 4 &amp;deg; C. Non superare 1 ora. </li></ol> 5. Eluizione di biotina-coniugato proteina bersaglio e SDS-PAGE <ol><li> Una volta che passo 4.3 è terminato, lavare delicatamente tutti i campioni una volta in LB pH 6.2. Tenere tutti i campioni in ghiaccio tra lavaggi. Rimuovere 2x Sample Buffer SDS senza agenti riducenti (Tabella 1) da -20 ° C di stoccaggio e lentamente sciogliere il ghiaccio. </li><li> Lavare delicatamente i campioni per tre volte di pH 7.5 + LB PMSF / Inibitori, e mantenere i campioni in ghiaccio tra lavaggi. </li><li> Rimuovere il surnatante del terzo risciacquo, lasciando le sferette pellet in un impasto liquido con buffer residuo sul fondo della provetta. Immergere una pipetta con un piccolo diametro di punta (una punta di carico gel o P2 puntale sono sufficienti) nella parte inferiore del tubo attraverso il liquame, e rapidamente raccogliere qualsiasi buffer residuo, facendo attenzione a non prendere le perline. </li><li> Supplemento il 2x soluzione tampone SDS con DL-Dithiothreitol (DTT) per ottenere una concentrazione finale di 5 mM. Aggiungere40-50 ml di soluzione tampone 2x + DTT 5 mM per ogni campione. Se necessario, le perline vortice per mescolare completamente con il tampone del campione, e subito centrifugare ad alta velocità per raccogliere tutti perline in un pellet, immersi in tampone campione. </li><li> Tutti i campioni bollire per 10 minuti a 75-80 ° C. Lasciate raffreddare i campioni a temperatura ambiente per ≥ 10 minuti sul banco, e centrifugare a 16000 xg / 3 min a pellet completamente le perline. </li><li> Aggiungere il volume totale di proteine ​​eluite (supernatante) da ciascun campione di una sola corsia di un gel di poliacrilammide adatto per western blotting, usando SDS-PAGE 7. Organizza tutti i campioni in modo che la HAM-eluente controllo e HAM eluente + per un solo campione vengono eseguiti immediatamente adiacenti l&#39;uno all&#39;altro durante la SDS-PAGE (Fig. 2). Seguendo SDS-PAGE, si trasferiscono in PVDF o membrana di nitrocellulosa. </li></ol> 6. Western Blotting e rilevamento della palmitoilazione della proteina bersaglio <ol><li> Dopo 5,6 passo è completato, lavare la membranadue volte in soluzione salina tamponata Tris (TBS 1x) per 10 min su una piattaforma oscillante a RT. </li><li> Preparare un tampone di bloccaggio per bloccare non specifica etichettatura pesando sieroalbumina bovina (BSA), per raggiungere il 3% in peso di un volume di 1x TBS + Tween-20 0,05% (TBS-T), che è sufficiente per sommergere completamente la membrana . Per streptavidina blotting, bloccare sempre con BSA e non il latte in polvere. Bloccare la membrana per 1 ora a RT su una piattaforma oscillante. </li><li> Preparare una soluzione di anticorpo TBS-T + 0,3% BSA. Aggiungere streptavidina-HRP anticorpo ricostituito a 1 mg / ml in acqua distillata, diluito al 1:5,000-1:10,000. Una volta completata passo 6.2, lavare la membrana volta in TBS-T per 10 minuti, poi incubare la membrana in soluzione di anticorpi Streptavidina su una piattaforma oscillante per entrambi per 1 ora a RT, o per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare la membrana per tre volte in TBS-T per 10 min su una piattaforma oscillante. Al fine di rilevare il segnale palmitoilazione, esporre la luminescenza HRP utilizzando un chemsubstrato kit iluminescent. </li><li> Al fine di normalizzare i livelli palmitoilazione alla quantità della proteina di interesse che è stato immunoprecipitato, togliere la membrana utilizzando tampone western blot strippaggio per 5-10 minuti su una piattaforma oscillante a RT. Ripetere i passaggi 6,1-6,4 usando l&#39;anticorpo primario contro la proteina di interesse che è stato originariamente utilizzato per l&#39;immunoprecipitazione. </li><li> Quantificare palmitoilazione della proteina di interesse utilizzando software di analisi di immagini, e normalizzare i livelli palmitoilazione alla quantità di proteine ​​immunoprecipitato. </li></ol>

<ol><li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).</li>
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<li>Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+protein+palmitoylation+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling.</a> Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;IP-ABE saggio qui presentato è un metodo semplice e molto sensibile per la rilevazione di proteine ​​palmitoylated in una coltura di neuroni primari ippocampali, utilizzando tecniche biochimiche per lo più standard. Questo rende il test facilmente adattabile per i laboratori già equipaggiati con materiali occidentali blotting. L&#39;IP-ABE test combina un protocollo standard per isolare immunoprecipitazione e immobilizzare la propria proteina bersaglio, seguito da precedentemente descritto ABE chimica 2-4 per rilevare rapidamente livelli di palmitato su un substrato proteico. La tecnica ABE ha una vasta gamma di applicazioni per l&#39;esame di proteine ​​palmitoilato in vari tessuti e linee cellulari, inclusi i grandi palmitoil-proteomica screening di profili palmitoilazione globali e rilevamento rapido di palmitoilazione livelli di una proteina bersaglio singolo. Descrizioni precedenti di ABE chimica hanno utilizzato diversi metodi di lisi cellulare ed estrazione detergente di prot neuronaleEins 2, 9, tiolo libero-blocco 10, 11, biotinilazione, e purificazione della proteina bersaglio 4, a seconda dell&#39;applicazione dell&#39;esperimento. L&#39;aggiunta di palmitato di proteine ​​neuronali risultati nel proprio targeting verso membrane cellulari, e la rilevazione della frazione palmitoilato di una proteina bersaglio richiederà la sua estrazione da tali membrane. Precedentemente descritte metodologie ABE hanno utilizzato una varietà di 9 ionici e non-ionici detergenti 8 per estrarre proteine ​​bersaglio desiderate, e l&#39;uso di un particolare detersivo dipende la proteina bersaglio e il suo traffico di membrana nota. Qui, utilizziamo la non denaturante e detergente non ionico IGEPAL CA-630 per estrarre proteine ​​palmitoilato, che abbiamo convalidato per l&#39;estrazione e la rilevazione della proteina neuronale palmitoilato δ-catenina (Figura 2). La struttura di IGEPAL CA-630 comprende un ingombrante e rigido non polare gruppo di testa che nonperturbare conformazione nativa o interazioni proteina, ma che permette la sua associazione con le regioni idrofobiche di proteine ​​associate alla membrana, conferendo in tal modo miscibilità a loro e permettendo loro estrazione. Molte proteine ​​neuronali localizzate alla membrana sinaptica o post-sinaptica densità di sinapsi deve essere estratto usando IGEPAL CA-630, tuttavia alcuni possono non solubilizzare completamente, e può richiedere l&#39;uso di un diverso non denaturante detergente come Triton X-100, che ha stati precedentemente utilizzati per ABE chimica 2, 8. Descrizioni Diversi ABE chimica hanno anche utilizzato un diverso tiolo reattivo reattivo biotinilazione dalla molecola che descriviamo qui, chiamato biotina-HPDP (Thermo Scientific), che richiede anche un modo diverso di purificazione della proteina 4. Biotin-HPDP è un&#39;altra tiolo reattivo, maliemide-coniugato biotina molecola che contiene un legame disolfuro nel braccio linker maliemide, strutturalmente differentiating da biotina-BMCC, che non contiene tale legame disolfuro. Seguendo tiolo-biotinilazione di cisteina libera o palmitoilato una proteina da Biotin-HPDP, il legame disolfuro risultante tra la proteina bersaglio e il gruppo biotina può essere scisso riducendo reagenti per rilasciare il gruppo biotina e rigenerare la proteina nella sua forma originale, rendendo biotinilazione di Biotina-HPDP transitorie e reversibili. Pertanto, l&#39;uso di questo reagente biotinilazione richiede purificazione di una proteina bersaglio con reagenti immobilizzati avidina, streptavidina come perle rivestite. Tuttavia, tiolo-biotinilazione di una proteina bersaglio con biotina-BMCC, come descritto qui, è stabile e relativamente permanente, e richiede la purificazione della proteina bersaglio con un anticorpo diretto contro il bersaglio, e immobilizzato su perline sefarosio. Entrambe le tecniche ABE sono stati precedentemente utilizzati per grandi schermi, e il rilevamento di palmitoilazione di proteine ​​singole 2, 8-10, 12, e laIP-ABE test che descriviamo qui è ottimale per la rilevazione rapida di palmitoilazione di singole proteine ​​bersaglio neuronali. La stragrande maggioranza dei palmitoilazione cellulare comporta l&#39;aggiunta reversibile palmitato al gruppo tiolo di cisteine ​​(chiamato S-palmitoilazione, che generalizziamo come &#39;palmitoilazione&#39; in questo protocollo), ma un gruppo molto limitato di proteine ​​sono soggette a palmitoilazione irreversibile a glicina residui di cisteina e attraverso la formazione di legami ammidici stabili, chiamato N-palmitoilazione 13. Una limitazione di ABE chimica è la sua incapacità di rilevare N-palmitoilazione causa della stabilità del legame ammidico, e così lo screening di una proteina nuovo bersaglio per palmitoilazione dovrebbe essere confermata usando 3H-palmitato marcatura metabolica 1. Come precedentemente accennato, il IP-ABE dosaggio può essere facilmente adattato per l&#39;esame palmitoilazione in estratti proteici da molteplici fonti, comprese transfected linee di cellule eterologhe, il tessuto primario e colture primarie neuronali provenienti dalle regioni cerebrali multiple. L&#39;IP-ABE test è stato utilizzato per l&#39;esame della sufficienza palmitoilazione mutati cisteina-to-serina proteine ​​per identificare la posizione di una cisteina palmitoilato lungo una proteina bersaglio 8, per l&#39;esame fatturato dinamica palmitato sulle proteine ​​sinaptiche in neuroni in coltura in condizioni basali 10, e cambiamenti nei livelli di proteine ​​neuronali palmitoilazione dopo induzione dell&#39;attività neuronale 9. La sensibilità e l&#39;adattabilità della IP-ABE test rendono ideale per l&#39;esame di profili palmitoilazione di proteine ​​neuronali, e ottimale per la rilevazione di cambiamenti dinamici in palmitoilazione.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> IGEPAL CA-630 </td><td> Sigma </td><td> I8896 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluka </td><td> 93482 </td><td></td></tr><tr><td> Proteasi Inhibitor Cocktail </td><td> Roche Mini completo </td><td> 11 836 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> NEM </td><td> Sigma </td><td> E3876 </td><td></td></tr><tr><td> HAM soluzione </td><td> Sigma </td><td> 46780-4 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td> Garantire la compatibilità con un detergente scelto </td></tr><tr><td> Proteine ​​G / A-rivestito sefarosio perline </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6002-35 </td><td></td></tr><tr><td> Biotina-BMCC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21900 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidina-HRP </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21126 </td><td> Ricostituire a 1 mg / ml in acqua </td></tr><tr><td> Western Blot Buffer Spogliarello </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21059 </td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento di palmitoilazione proteina in colture di neuroni ippocampali di immunoprecipitazione e di acil-biotina exchange (abe)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoilazione è una modificazione post-traduzionale di lipidi che coinvolge l&#39;apposizione di 16 atomi di carbonio acido grasso saturo, palmitato, di residui di cisteina delle proteine ​​substrato attraverso un labile legame tioestere [recensione in 1]. Palmitoilazione di una proteina substrato aumenta la sua idrofobicità, e facilita tipicamente suo traffico verso membrane cellulari. Recenti studi hanno dimostrato palmitoilazione essere una delle modifiche lipidici più comuni in neuroni 1, 2, suggerendo che turnover palmitato è un importante meccanismo attraverso cui queste cellule regolano la destinazione e traffico di proteine. L&#39;identificazione e rilevazione di substrati palmitoilato può pertanto migliorare la nostra comprensione della tratta proteina nei neuroni. Rilevamento di proteine ​​palmitoilazione in passato è stata tecnicamente ostacolato a causa della mancanza di una sequenza consenso tra proteine ​​substrato, e la dipendenza metabolica labeling di palmitoil-proteine ​​con 3 H-palmitato, un tempo saggio biochimico con bassa sensibilità. Sviluppo della acil-Biotina Exchange (ABE) test consente di rilevare la sensibilità più rapido ed elevato di proteine ​​palmitoylated 2-4, ed è ottimale per misurare la dinamica del fatturato palmitato sulle proteine ​​neuronali. Il dosaggio ABE comprende tre passi biochimici (figura 1): 1) blocco irreversibile di gruppi non modificati tiolo della cisteina con N-ethylmaliemide (NEM), 2) clivaggio specifico e smascheramento del gruppo tiolo della cisteina palmitoilato da parte idrossilammina (HAM), e 3) l&#39;etichettatura selettiva della cisteina palmitoylated con un tiolo reattivo reattivo biotinilazione, biotina-BMCC. Purificazione delle tiolo-biotinilati proteine ​​secondo le fasi ABE è stato diverso, a seconda l&#39;obiettivo generale di questo esperimento. Qui, si descrive un metodo per purificare una proteina di interesse in palmitoilato ippocampo primarianeuroni AL di una immunoprecipitazione iniziale (IP) utilizzando un anticorpo diretto contro la proteina, seguita dal dosaggio ABE e western blotting per misurare direttamente palmitoilazione livelli di tale proteina, che è definito il IP-ABE saggio. A bassa densità colture di neuroni ippocampali embrionali di ratto sono stati ampiamente utilizzati per studiare la localizzazione, la funzione, e il traffico di proteine ​​neuronali, che li rende la soluzione ideale per lo studio delle proteine ​​palmitoilazione neuronale utilizzando l&#39;IP-ABE saggio. L&#39;IP-ABE test richiede principalmente IP standard e reagenti occidentali blotting, ed è solo limitata dalla disponibilità di anticorpi contro il substrato bersaglio. Questo dosaggio può essere facilmente adattato per la purificazione e la rilevazione di proteine ​​palmitoilato trasfettati in colture cellulari eterologhi, colture neuronali primarie derivate da vari tessuti cerebrali di entrambi topo e ratto, e tessuto cerebrale anche primario stesso.

L&#39;IP-ABE saggio rileva specificamente tiolo-palmitoilazione di residui di cisteina lungo proteine ​​substrato, e può essere utilizzato per rilevare palmitoilazione di immunoprecipitate proteine ​​neuronali in modo rappresentato nella figura 1. Trattamento della proteina neuronale immunoprecipitato con HAM (Figura 1) scinde il legame tioestere tra palmitato e gruppo tiolo una cisteina, permettendo per incorporazione specifica di biotina-BMCC sul gruppo appena disponibile tiolo, che può essere successivamente rilevata tramite western blotting. L&#39;omissione di HAM (meno-HAM) scissione impedisce l&#39;incorporazione di biotina-BMCC e funziona come un controllo negativo per specifici palmitoil-biotinilazione del plus-HAM campione e deve quindi sempre essere eseguito vicino al plus-HAM campione per occidentale blotting mediante SDS-PAGE (Figura 2). In un esperimento ottimizzato (Figura 2A), il palmitoilazionesegnale della proteina neuronale δ-catenina 2 può essere facilmente rilevato da blotting per biotina-BMCC ad una concentrazione di 1 mM, utilizzando streptavidina coniugata con HRP, contro i campioni meno parallele e-plus-HAM. Il segnale palmitoilazione specifico per δ-catenina appare nella sua dimensione prevista di 160kD, solo nel plus-HAM campione. La specificità di questo segnale è stato confermato da reprobing per δ-catenina con l&#39;anticorpo specifico che è stato inizialmente utilizzato per immunoprecipitare esso, risultando in un segnale in entrambi i trattamenti prosciutto al predetto stessa dimensione. Ottimizzazione del IP-ABE test (Figura 2A) si tradurrà in un profilo western blotting di un minus-HAM campione che è facilmente distinguibile dal plus-HAM campione, e mostra una minima di alcun segnale palmitoilazione. La concentrazione di biotina-BMCC utilizzato per etichettare cisteine ​​palmitoilato richiede un&#39;attenta ottimizzazione, e se una super-saturante concentrazione di biOtín-BMCC viene utilizzato durante le fasi chimica Abe (Figura 2B), fondo eccessiva e non specifici segnali sarà visibile. Una curva di risposta lineare per biotinilazione di una proteina palmitoilato neuronale, la α7 recettore nicotinico, utilizzando biotina-BMCC è stata preventivamente fissata 6, e mostra vicino completa saturazione ad una concentrazione di 5-10 uM. Sebbene la concentrazione ottimale di biotina-BMCC sarà deviare leggermente a seconda della proteina bersaglio neuronale, il trattamento con biotina-BMCC ad una concentrazione superiore a 5 pM probabilmente super-saturare la proteina bersaglio, e il risultato in un profilo western blot con sfondo visibile e non specifici segnali. Una concentrazione di 0,5 pM di biotina-BMCC è stato precedentemente utilizzato per rilevare palmitoilazione di altre proteine ​​neuronali compresi SNAP-25, huntingtina, subunità dei recettori AMPA GluA1 e GluA2, paralemmin e 8, e la determinazione della concentrazione ottimale per un romanzoproteina bersaglio può essere effettuata per tentativi in ​​modo lineare, partendo nell&#39;intervallo di 0,5-5 pM che descriviamo qui. I risultanti streptavidina profili western blot tra i campioni meno-e plus-HAM per δ-catenina palmitoilazione essere simile se trattati con 4 mM biotina-BMCC (Figura 2B), con segnali di fondo aggiuntivi in diverse dimensioni, il che indica che si è verificato biotinilazione inappropriato. Idrossilammina è un potente agente riducente che provoca la degradazione limitata della proteina bersaglio in aggiunta alla sua scissione efficiente di tioestere linkage. Di conseguenza, l&#39;ottimizzazione delle ABE chimica richiede uno per normalizzare la quantità di proteine ​​immunoprecipitato utilizzato per campioni e meno-più-HAM (passi 3,2-3,3). Normalizzazione richiede l&#39;uso del doppio della quantità di proteina bersaglio immobilizzata nel plus-vs-minus HAM campione, che si traduce in realtà in Wester indistinguibilin blotting profili per la proteina bersaglio, come mostrato per δ-catenina (Figura 2A, B). Tuttavia, se la quantità di proteina bersaglio immobilizzato non viene normalizzato tra campioni e meno-più-HAM, il segnale risultante western blot per la proteina bersaglio in plus-HAM campione può essere perso, come mostrato per δ-catenina quando la stessa quantità di proteina sono stati utilizzati in entrambi i trattamenti HAM (Figura 2C). La specificità di ABE chimica per l&#39;etichettatura di proteine ​​palmitoylated è molto sensibile e richiede l&#39;ottimizzazione. Gli errori più comuni riscontrati durante il PI-ABE test includono i risultati non ottimali illustrati nelle figure 2B e 2C, e la degradazione della proteina bersaglio, indipendentemente dal trattamento HAM, che sono generalmente causati da vecchi reagenti e tamponi, e il pH corretto. Per evitare questi inconvenienti e per correggere sub-ottimale chimica ABE, la freschezza e la concentrazione dei reagenti necessari per l&#39;buffer di cui alla tabella 1 deve sempre essere esaminato, e le regolazioni del pH di tutti i buffer deve essere sempre controllato prima di eseguire l&#39;esperimento. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Buffer </td><td> Concentrazione di lavoro </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Lysis Buffer (LB) </td><td> In distillata H 2 O: 1% IGEPAL CA-630 50 mM Tris-HCl 150 mM pH7.5 Glycerol NaCl 10% </td><td> N / A </td><td> Preparare prima di sperimentare e conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> NEM Soluzione </td><td> In% EtOH 100: NEM polvere liofilizzata </td><td> 2 M </td><td> Preparare fresco, immediatamente prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Buffer stringente </td><td> In LB: 10 mM MEM 0.1% SDS </td><td> N / A </td><td> Preparare poco prima dell&#39;uso, tenerla in ghiaccio. </td></tr><tr><td> LB pH 7.2 </td><td> In LB: Portare il pH esattamente a 7,2 </td><td> N / A </td><td> Utilizzare un misuratore di pH per regolare il pH immediatamente prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> HAM Buffer </td><td> In LB pH 7.2: soluzione HAM Fotografico </td><td> 1 M (concentrazione finale HAM) </td><td> Preparare al momento dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> LB pH 6,2 </td><td> In LB: Regolare il pH esattamente a 6,2 </td><td> N / A </td><td> Come per pH 7,2 LB </td></tr><tr><td> Foto biotina-BMCC Solution </td><td> In DMSO: 2,1 mg Biotina-BMCC soluzione </td><td> 8 mM </td><td> Preparare al momento dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Biotina-BMCC Buffer </td><td> In LB pH 6.2: Aggiungi biotina-BMCC soluzione </td><td> 1-5 mM (finali biotina-BMCC concentrazione) </td><td> Preparare al momento dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> 2x SDS Sample Buffer, non agenti riducenti </td><td> In distillata H 2 O: 5% SDS 5% glicerolo 125mm Tris-HCl pH 6,8 0,01% blu di bromofenolo </td><td> N / A </td><td> Preparare prima dell&#39;esperimento, e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Supplemento con 5 mM DTT prima dell&#39;uso. </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Tamponi e reagenti necessari per l&#39;IP-ABE dosaggio. Molti dei buffer di lisi può essere preparato prima di iniziare l&#39;esperimento, tuttavia il pH deve essere controllato e regolato immediatamente prima dell&#39;uso con un misuratore di pH, per assicurare il successo della chimica ABE. La maggior parte delle soluzioni madre deve essere preparato per ogni esperimento, immediatamente prima dell&#39;uso. Molti dei buffer richiede reagenti comuni alla maggior parte dei laboratori attrezzati per biochimica, e reagenti speciali con informazioni venditore sono elencati nella tabella dei reagenti e apparecchiature. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1highres.jpg" /> Figura 1. Schematica della immunoprecipitazione e acil-Biotin Exchange (IP-ABE) saggio per purificare e rilevare palmitoilazione di proteine ​​neuronali. Colture di neuroni ippocampali vengono lisate, (1) una proteina bersaglio viene quindi purificato utilizzando un anticorpo specifico bersaglio e immobilizzato su sefarosio perline rivestite con proteina G o A. La proteina purificata è poi destinazione (2) trattata con N-ethylmaliemide (NEM) di legarsi irreversibilmente e bloccare liberi tiolo (-SH) gruppi lungo cisteine ​​non modificati (C). La proteina bersaglio viene poi (3) sottoposti a trattamento con idrossilammina (HAM), con conseguente scissione specifico di legami tioestere in cisteine ​​palmitoylated e lo smascheramento di un libero gruppo palmitoylated tiolo (-SH). Successivamente, la proteina bersaglio è (4) treated con un tiolo reattivo molecola di biotina, biotina-BMCC, con conseguente biotinilazione specifico della cisteina palmitoilato. Infine, (5) la proteina bersaglio biotinilato viene eluito e rimosso dal anticorpo e tallone. La proteina bersaglio con la sua cisteina palmitoylated (s) codificata con biotina ora è adatto per SDS poliacrilammide gel elettroforesi (SDS-PAGE) e western blotting con streptavidina per rilevare per palmitoilazione della proteina purificata neuronale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2highres.jpg"/> Figura 2. Rilevamento palmitoilazione della proteina neuronale δ-catenina utilizzando l&#39;IP-ABE saggio. Neuroni dell&#39;ippocampo di ratto primarie sono state coltivate come preprecedentemente descritto 5, ad una densità di 130 cellule / mm 2 fino a maturità 14DIV, sono state poi lisate, e sottoposto al IP-ABE test di rilevare palmitoilazione di un substrato recentemente identificato palmitoilato neuronale, δ-catenina 2. Purificato immunoprecipitati (IP) di δ-catenina (proteina bersaglio) sono stati isolati con 5 mg di δ-catenina anticorpo per campione (Transduction Laboratories BD), e sono stati sottoposti a SDS-PAGE in parallelo meno-e plus-idrossilammina (HAM) campioni. Palmitoilazione stato rilevato mediante western blotting (WB) con streptavidina-HRP (palmitoilazione), e la membrana è stata spogliato e sottoposto ad un WB reprobe per δ-catenina. (A) Un rappresentante ottimizzata IP-ABE risultato palmitoylated δ-catenina (punta di freccia) trattati con 1 pM biotina-BMCC, illustrando la specificità di ABE chimica per rilevare tiolo palmitoylated proteine ​​da campioni IP. (B) Un sub-ottimale rappresensentante IP-ABE risultato δ-catenina, in cui è stato utilizzato un eccessiva concentrazione di 4 mM biotina-BMCC, con conseguente non specifici segnali e priorità bassa in entrambi i campioni meno-e plus-HAM (frecce). (C) Un altro sub-ottimale rappresentante IP ABE-WB per δ-catenina, dove è stata utilizzata una eccessiva concentrazione 4 pM di biotina-BMCC, e la quantità di proteina utilizzata per il plus-HAM campione IP non è stata normalizzata per HAM-mediata degradazione delle proteine, con un conseguente segnale perso nel WB reprobe per δ-catenina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

L&#39;aggiunta di palmitato reversibile alle proteine ​​è un importante regolatore del traffico intracellulare delle proteine. Questo è di particolare interesse in neuroni dove sono palmitoilato molte proteine ​​sinaptiche. Utilizziamo un metodo semplice biochimico per rilevare le proteine ​​palmitoilato in neuroni in coltura, che possono essere adattati per più tipi di cellule e tessuti.

Rilevamento di palmitoilazione proteina in colture di neuroni ippocampali di immunoprecipitazione e di acil-Biotina Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e rilevare proteine neuronali correlate ai poid da neuroni in coltura utilizzando un saggio biochimico semplice e adattabile. Ciò si ottiene estraendo e immobilizzando la proteina bersaglio in presenza di etile o NEM per garantire il blocco di tutti i gruppi tiolici liberi. Il secondo passo consiste nel trattare la proteina bersaglio immobilizzata con ossidrile medio o ham, per scindere il legame tioestere tra il residuo di cisteina palmata e la molecola di palmitato.In questo modo si libera il gruppo di stile cistina palmata e lo si rende disponibile per l'etichettatura nella terza fase. La proteina bersaglio immobilizzata viene incubata con biotina B-M-C-C-A molecola specifica del file marcata con biotina, questa biotina ela e tagga, il gruppo di Thile che era originariamente pyl. Il passo finale consiste nel rilevare il livello di pation della proteina bersaglio mediante SDS page e western blotting per Strp Aden.In definitiva, il test IP A BE viene utilizzato per mostrare i livelli del palmitato lipidico attaccato in modo reversibile a una proteina bersaglio neuronale e può anche rilevare sottili cambiamenti nelle proteine bersaglio. Livelli di pazione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il rilevamento delle proteine, la mutilazione del palmo della mano utilizzando la marcatura metabolica con il tratto A palmato è che il test di scambio acil-biotina è più sensibile e richiede meno tempo.Il test A BE consente anche stime più quantitative delle mutilazioni del palmo ed è particolarmente adatto per rilevare piccoli cambiamenti nei livelli di mutilazione del palmo. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'identificazione delle proteine palmate e dei neuroni ippocampali in coltura, può essere applicato anche ad altri sistemi come colture neurali primarie provenienti da altre regioni del cervello, linee cellulari eterologhe e persino tessuti primari. Per iniziare l'estrazione della proteina bersaglio dai neuroni primari dell'ippocampo in coltura, preparare il tampone di lisi e la soluzione NEM come descritto nella procedura scritta che accompagna questo video.Quindi, combinare il tampone di lisi e la soluzione NEM aggiungendo 0,5 millilitri di soluzione NEM a due molari a una provetta conica fresca da 50 millilitri. Aggiungere 20 millilitri di tampone di lisi sopra. Aggiungere sempre prima la soluzione di etanolo NEM e poi il tampone di lisi, in modo da miscelare correttamente i due in una cella frigorifera a quattro gradi Celsius, posizionare rapidamente la miscela su una piattaforma a dondolo per mescolare completamente per cinque minuti.Rimuovere i neuroni primari dell'ippocampo di ratto in coltura dall'incubatrice, istruzioni su come coltivare. I neuroni possono essere trovati nel testo dopo aver posizionato i neuroni coltivati sul ghiaccio. Rimuovere delicatamente il supporto cellulare.Lavare delicatamente i neuroni due volte con soluzione salina tamponata con fosfato freddo. Quindi, aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi più 50 millimolari di NEM al primo pozzetto dei neuroni dell'ippocampo e raschiare le cellule utilizzando un sollevatore di cellule usa e getta. Raccogli il lisato cellulare e poi scarica il lisato nel pozzetto successivo di quel gruppo.Raschiare le cellule all'interno del secondo pozzetto utilizzando il sollevatore di cellule. Raccogliere e ripetere utilizzando un terzo pozzetto, se necessario. Per concentrare ulteriormente il lisato, raccogliete il lisato cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri pre-raffreddata.Aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi più 50 millimolari di NEM al primo pozzetto e ripetere il processo di raschiatura della saldatura per raccogliere il lisato cellulare rimasto. Passare il lisato cellulare totale attraverso una siringa da 26 gauge e mezzo da cinque a sei volte per facilitare la lisi meccanica. Facendo attenzione a non soffiare bolle nella soluzione.Mutare il lisato cellulare per almeno 30 minuti a quattro gradi Celsius dopo la centrifugazione. Raccogli il lisato cellulare eliminato in una nuova provetta pre-raffreddata da 1,5 millilitri su ghiaccio. Ripetere il protocollo di raccolta dimostrato per tutti i gruppi di cellule.Misurare la concentrazione di proteine in tutti i campioni di lisato utilizzando il test BCA. Secondo le istruzioni del produttore. Normalizzare il volume di tutti i campioni di lisato provenienti da gruppi di cellule per avere esattamente la stessa proteina con un minimo raccomandato di 500 microgrammi.Rabboccare tutti i campioni con tampone di lisi più 50 millimolari di NEM per un volume totale di 500 microlitri. Successivamente, aggiungere da uno a cinque microgrammi di anticorpi primari diretti contro la proteina bersaglio a ciascun campione di lisato. Mutare i campioni misti di lisato di anticorpi durante la notte a quattro gradi Celsius prima di precipitare e immobilizzare una proteina bersaglio.Preparare un impasto al 50% di proteina A o SRO rivestita di proteina G come descritto nel protocollo scritto. Come passaggio finale, aggiungere un volume uguale del 50% di liquame a ciascun campione di lisato anticorpale e mutare per almeno un'ora a quattro gradi Celsius. Nell'esecuzione dell'ael, lo scambio del pH e della temperatura corretti di tutti i tamponi e reagenti, nonché la loro freschezza, sono fondamentali.Per garantire il successo dell'esperimento. Iniziare la scissione del prosciutto con la preparazione di una serie di provette con tampone di lisi di diversi phs. Il pH è molto importante per questi passaggi e dovrebbe essere sempre regolato.Utilizzando un pHmetro per campione, preparare due millilitri di tampone di lisi pH 7,2 e 0,5 millilitri di tampone stringente preparato nel tampone di lisi. Preparare anche 0,5 millilitri di tampone di lisi più 10 millimolari di NEM per campione. AGGIUNGERE compresse di PMSF e inibitori della proteasi a tutti i tamponi di lisi.L'ossidrile medio o prosciutto viene utilizzato per scindere il legame tioestere tra la cisteina palmata e l'acido grasso palmitato. Questo è essenziale per liberare il gruppo di tipo cisteina palmata e renderlo disponibile per l'etichettatura con biotina. L'omissione della scissione del prosciutto può quindi fungere da utile controllo negativo.Preparare ulteriori provette da 1,5 millilitri su ghiaccio etichettate come controllo meno prosciutto per ciascun campione dopo l'incubazione dell'anticorpo con il lisato cellulare. E poi con le perle, centrifugare delicatamente tutte le perle campione a 0,5 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius con le provette sul ghiaccio. Rimuovere il surnatante e sospendere nuovamente le perle in 600 microlitri di tampone di lisi più 10 millimolari di NEM.Dopo aver sospeso tutte le perle del campione, raccogliere immediatamente 200 microlitri di liquame di perle di lisato dei campioni e scaricarlo nel tubo di prosciutto meno di quel campione su ghiaccio, lasciando 400 microlitri di perle di lisato di ciascun campione nella provetta per il campione di prosciutto più. Questo per tenere conto della limitata degradazione della proteina bersaglio causata dal trattamento con prosciutto. Un terzo delle perle viene utilizzato per il trattamento con prosciutto meno e i restanti due terzi per il trattamento con prosciutto positivo.Aggiungere altri 300 microlitri di tampone di lisi più 10 millimolari di NEM al campione di prosciutto meno. Pipettare altri 100 microlitri nel campione di prosciutto plus per un totale di 500 microlitri in ciascun campione. Incubare le provette per 10 minuti con ghiaccio e poi procedere al lavaggio dei campioni di prosciutto meno e prosciutto più come descritto nella procedura scritta dopo il lavaggio del campione a 0,5 millilitri per campione di tampone di lisi pH 7,2 su tutti i campioni di prosciutto meno.Aggiungere 0,5 millilitri per campione di tampone per prosciutto a tutti i campioni di prosciutto plus. Quindi mutare tutti i campioni per un'ora a temperatura ambiente. Non superare l'ora successiva al trattamento con prosciutto.Eseguire lo scambio acil-biotina mediante marcatura BMCC della biotina come discusso nella procedura scritta. Una volta completata l'etichettatura BMCC della biotina, lavare delicatamente i campioni come descritto nel testo. Rimuovere il surnatante del lavaggio finale, lasciando le perle pellettate in un impasto liquido con il tampone rimanente sul fondo del tubo.Immergere una pipetta con una punta di piccolo diametro nella parte inferiore della provetta attraverso l'impasto e raccogliere rapidamente il tampone rimanente. Facendo attenzione a non raccogliere perline. Aggiungere da 40 a 50 microlitri di due tamponi per campioni più cinque millimolari DTT a ciascun campione.Se necessario. Agitare le perle per mescolarle completamente con il tampone del campione e centrifugare immediatamente ad alta velocità per raccogliere tutte le perle in un pellet immerso nel tampone del campione. Dopo aver fatto bollire i campioni e aver centrifugato nuovamente, aggiungere l'intero volume di proteina elusa nel surnatante di ciascun campione in una singola corsia all'interno di un gel di poliacrilammide adatto per il western blotting.Utilizzando la pagina SDS, organizzare tutti i campioni in modo che il meno ham control elu e il plus ham elu per un singolo campione vengano eseguiti immediatamente adiacenti l'uno all'altro. Durante la pagina SDS dopo la pagina SDS trasferita su A-P-V-D-F o membrana di NITROCELLULOSA, iniziare il western blotting con lavaggio e blocco come descritto nella procedura scritta, preparare una soluzione anticorpale di TBST più 0,3% BSA, aggiungere l'anticorpo HRP della streptavidina, che è stato ricostituito a un milligrammo per millilitro in acqua distillata. Lavare la membrana una volta in TBST per 10 minuti.Quindi incubare la membrana in una soluzione di anticorpi STREPTAVIDIN su una piattaforma oscillante per un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Lavare la membrana tre volte in TBST per 10 minuti su una piattaforma a dondolo. Per rilevare il segnale del patione, esporre la luminescenza HRP utilizzando un kit di substrato chemiluminescente al fine di normalizzare i livelli di patione alla quantità della proteina di interesse che è stata immunoprecipitata.Sverniciare la membrana utilizzando il tampone di stripping Western blott per cinque-10 minuti su una piattaforma oscillante a temperatura ambiente. Ripetere le fasi di western blotting utilizzando l'anticorpo primario contro la proteina di interesse originariamente utilizzata per l'immunoprecipitazione. Quantificare la patione della proteina di interesse utilizzando il software di analisi delle immagini e normalizzare i livelli di pation alla quantità di proteina immunoprecipitata.Il test I-P-A-B-E rileva specificamente la presenza di residui di cistina lungo le proteine del substrato e può essere utilizzato per rilevare la presenza di proteine neuronali immunoprecipitate. Trattamento della proteina neuronale immunoprecipitata con cleaves di prosciutto, il legame tioestere tra palmitato e gruppo Sistine Thal che consente l'incorporazione specifica della biotina BMCC nel gruppo di file appena disponibile, che può essere successivamente rilevata utilizzando il western blotting. L'omissione della scissione del prosciutto impedisce l'incorporazione della biotina BMCC e funge da controllo negativo per l'euforia specifica della biotina poidica del campione di prosciutto plus.Pertanto, il controllo meno ham deve essere sempre eseguito adiacente al campione di prosciutto più per la pagina Western blotting by SDS. In un esperimento ottimizzato, il segnale di patione della proteina neuronale delta catenina può essere facilmente rilevato mediante blotting per la biotina BMCC a una concentrazione di un micromolare utilizzando streptavidina coniugata con HRP contro campioni paralleli di prosciutto meno e più. Il segnale di pation specifico per delta Kain appare alla sua dimensione prevista di 160 kilodalton solo nel campione della mano positiva.La specificità di questo segnale è stata confermata dal riesame della catenina delta con l'anticorpo specifico inizialmente utilizzato per l'immunoprecipitazione, risultando in un segnale in entrambi i trattamenti con prosciutto alla stessa dimensione prevista. L'ottimizzazione del test I-P-A-B-E si tradurrà in un profilo di western blotting di un campione di prosciutto meno che è facilmente distinguibile dal campione di prosciutto più e mostra un segnale di pation minimo o nullo. La concentrazione di biotina BMCC utilizzata per marcare le CISTINE PALMATE richiede un'attenta ottimizzazione e se viene utilizzata una concentrazione super saturante di biotina BMCC durante le fasi chimiche di A BE, saranno visibili un fondo eccessivo e segnali non specifici.I profili risultanti di avid spogliato in Western blob tra i campioni di prosciutto meno e plus per la mutilazione di delta catina e palma appaiono simili quando trattati con BMCC di biotina a quattro micromolari con segnali di fondo aggiuntivi a diverse dimensioni, il che indica che si è verificata una biotina inappropriata. Poiché l'idrossilammina è un potente agente riducente che provoca una degradazione limitata della proteina bersaglio, è necessario normalizzare la quantità di proteina immunoprecipitata utilizzata per i campioni di prosciutto meno e più. La normalizzazione richiede l'uso del doppio della quantità di proteina bersaglio immobilizzata nel campione di prosciutto più rispetto a quello meno, il che si traduce in profili di western blotting indistinguibili per la proteina bersaglio come mostrato per la delta catenina.Tuttavia, se la quantità di proteina bersaglio immobilizzata non viene normalizzata tra i campioni di prosciutto meno e più, il segnale di western blot risultante per la proteina bersaglio nel campione di prosciutto più può essere perso come mostrato per la catenina delta quando sono state utilizzate quantità uguali di proteine in entrambi i trattamenti con prosciutto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre la proteina neuronale scelta dai neuroni dell'ippocampo in coltura. Utilizzare una chimica BE per rilevare se si tratta di un substrato per la mutilazione del palmo in un tempo minimo ed essere in grado di adattare questo protocollo per l'uso in altre linee cellulari e tessuti.

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Questo articolo presenta un protocollo modulare per la lipidomica e la trascrittomica tissutale e la lipidomica plasmatica in modelli murini di malattie neurologiche che mirano ai lipidi sottostanti l'infiammazione e l'attività neuronale, i lipidi di membrana, i messaggeri a valle e gli enzimi / recettori che codificano per l'mRNA alla base della funzione lipidica. Vengono delineate le procedure di campionamento, elaborazione dei campioni, estrazione e quantificazione.

Lipidomica e trascrittomica nelle malattie neurologiche

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) è un metodo altamente sensibile, affidabile e facile da eseguire per rilevare la modifica reversibile dei lipidi dei residui di cisteina (S-acylation) in una varietà di campioni biologici.

Rilevamento di Protein S-Acylation utilizzando Acyl-Resin Assisted Capture

Palmitoylation comporta l'incorporazione di una moiety palmitativa 16-carbonio ai residui di cisteina delle proteine bersaglio in modo reversibile. Qui, descriviamo un approccio biochimico, l'analisi ApegS (acyl-PEGyl exchange gel shift), per studiare lo stato di palmitoylation di qualsiasi proteina di interesse nei lismi cerebrali dei topi.

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Analisi per la Determinazione Quantitativa della Palmitoylation delle Proteine della Membrana Cerebrale

Lo studio dell'acilazione grassa ha importanti implicazioni nelle interazioni proteiche cellulari e nelle malattie. Qui viene presentato un protocollo modificato per migliorare il rilevamento della chimica dei clic delle proteine acilate grasse, che può essere applicato in vari tipi di cellule e combinato con altri saggi, tra cui pulse-chase e spettrometria di massa.

Incorporazione ottimizzata di analoghi degli acidi grassi alchinici per il rilevamento di proteine acilate grasse utilizzando la chimica dei clic

Un protocollo di proteomica di marcatura di prossimità del lisosoma neuronale è descritto qui per caratterizzare il microambiente lisosomiale dinamico nei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Le proteine lisosomiali di membrana e le proteine che interagiscono con i lisosomi (stabilmente o transitoriamente) possono essere quantificate con precisione in questo metodo con un'eccellente risoluzione spaziale intracellulare nei neuroni umani vivi.

Caratterizzazione dell'interattoma del lisosoma neuronale con proteomica di marcatura di prossimità

Il protocollo presenta un metodo per l'attaccamento covalente in vivo della biotina alle proteine in base alla loro vicinanza a una biotina ligasi fusa a una proteina di interesse. Questa modifica consente un arricchimento selettivo delle proteine utilizzando perle di streptavidina come necessario negli studi di interazione proteica.

In vivo Biotinilazione di prossimità per studi di interazione proteica in Paramecium tetraurelia

Impara a rilevare la palmitoilazione proteica in colture di neuroni ippocampali utilizzando l'assaggio ABE. Questo metodo biochimico offre maggiore sensibilità e rapidità rispetto alle tecniche esistenti.

Rilevamento di palmitoilazione proteina in colture di neuroni ippocampali di immunoprecipitazione e di acil-Biotina Exchange (ABE) (Video) | JoVE Journal

Rilevamento di palmitoilazione proteina in colture di neuroni ippocampali di immunoprecipitazione e di acil-Biotina Exchange (ABE)

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