Name: 稀疏的头骨皮层的窗口技术 em在体内 /em光学相干断层成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 了解稀疏头骨皮层窗口技术，通过光学相干断层成像实现小鼠大脑活体成像。该方法比传统开颅手术创伤更小，能更好地保持大脑生物活性，为神经疾病诊断提供高分辨率结构功能信息。

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本工作得到了加州大学发现计划概念验证基金和美国国立卫生研究院（NIH，项目编号R00 EB007241）的资助。作者还感谢Jacqueline Hubbard在本实验中的协助。

1. 手术准备
<ol>
	<li>实验中使用6至8周龄的雌性CD 1小鼠。</li>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪混合物（80 mg/kg氯胺酮/10 mg/kg赛拉嗪）对小鼠进行麻醉。将小鼠置于恒温垫上，以维持约37 °C的适宜体温。通过检测动物的反射（例如，用钝头镊子轻夹脚趾）持续监测麻醉深度，并在必要时追加麻醉剂。</li>
	<li>使用人工泪液软膏润滑双眼。用剃刀去除头皮上的毛发，并用70%酒精棉片清除残留毛发。在头皮上涂抹一层薄薄的Nair脱毛膏，静置2分钟使其发挥作用。用生理盐水浸湿的棉签和酒精棉片轻轻擦去Nair及残留毛发。此时头皮应完全无毛。</li>
	<li>使用聚维酮碘棉签对头皮进行消毒，再用70%乙醇棉片清洁。</li>
	<li>小心地用手术巾包裹动物，以维持约37 °C的适宜体温，并将动物固定于立体定位仪上以固定颅骨。轻敲颅骨以确认其稳定性。所用材料清单见表1。</li>
</ol>
2. 薄化颅骨皮层窗制备
<ol>
	<li>从两眼之间的中点开始切口，向后沿中线延伸至两耳之间的中点。用镊子分开皮肤。</li>
	<li>在解剖显微镜下定位需变薄的区域，用镊子轻轻去除筋膜。在制作变薄的皮层窗之前，用无菌棉签将颅骨表面擦干。在本实验中，我们在前囟后方及侧方约1 mm处制作一个4 × 4 mm的变薄颅窗。</li>
	<li>使用直径为0.75 mm的圆形碳化钨钻头，在外科手钻上以轻柔的扫动方式开始磨薄颅骨，切勿对颅骨施加直接压力。每钻20-30秒应暂停一次，用无菌生理盐水和棉签清除骨屑，并防止颅骨过热。生理盐水也有助于热量在颅骨内均匀散失。</li>
	<li>当外层致密骨完全去除后，中间的松质骨层应已可见。由于松质骨层中的血管更为明显，可能会出现轻微出血。此时应更换为绿色砂轮钻头，并格外小心地继续钻磨，因为松质层更为脆弱。绿色砂轮钻头可减少骨组织去除量，同时使颅窗表面更加均匀。应不时暂停钻磨，以清除骨屑并冷却颅骨。</li>
	<li>最后，当颅骨变得较为透明且脑表面的血管结构可见时，开始使用抛光钻头对颅骨进行抛光。此步骤可在进一步精确减薄的同时使颅骨表面更加平滑。可用镊子轻轻敲击颅骨以检查其薄度。当颅骨变得略有弹性时，停止抛光。</li>
	<li>此时，变薄的颅窗应完全光滑且具有反光性，已准备好用于成像（图1）。由于脑组织具有高度散射特性，为获得最佳成像深度，颅骨应至少磨薄至55 μm。所用材料清单见表1。</li>
</ol>
3. 光学相干断层扫描成像
<ol>
	<li>手术完成后，检查动物的呼吸频率和反射，以确认麻醉深度是否合适，必要时追加麻醉剂。将动物从立体定位仪上取下，保持其包裹在手术单中，并转移至成像工作站。</li>
	<li>成像前检查动物的反射情况，必要时涂抹人工泪液。将动物固定在立体定位仪上，以稳定颅骨。</li>
	<li>将动物置于OCT相机下，并将TSCW置于光束下方（图2）。此时可观察到颅骨与脑组织的横截面图像（图3）。</li>
	<li>定位感兴趣区域后即可开始数据采集。为实现成像，我们使用振镜获得宽度为4.0 mm的成像视野。在入射功率为6 mW、聚焦点位于减薄颅骨下方1 mm的条件下，可达到2 mm的成像深度。每个横截面由2,048条轴向扫描线组成，图像采集速率为每幅0.14秒。</li>
	<li>通过使用两组振镜进行x-y方向扫描，可采集一系列二维横截面图像，从而获得脑组织的三维扫描图像，其中第一组振镜使光束在矢状方向扫描，第二组振镜在冠状方向扫描。</li>
</ol>

<ol><li>Bizheva, K., Unterhuber, A., Hermann, B., Povazay, B., Sattmann, H., Drexler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+ex+vivo+and+in+vitro+brain+morphology+in+animal+models+with+ultrahigh+resolution+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Imaging ex vivo and in vitro brain morphology in animal models with ultrahigh resolution optical coherence tomography.</a> Journal of Biomedical Optics. 9, 719-724 (2004).</li>
<li>Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+for+ultrahigh+resolution+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography for ultrahigh resolution in vivo imaging.</a> Nature Biotechnology. 21, 1361-1367 (2003).</li>
<li>Wantanabe, H., Rajagopalan, U. M., Nakamichi, Y., Igarashi, K. M., Kadono, H., Tanifuji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+source+optical+coherence+tomography+as+a+tool+for+real+time+visualization+and+localization+of+electrodes+used+in+electrophysiological+studies+of+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Swept source optical coherence tomography as a tool for real time visualization and localization of electrodes used in electrophysiological studies of brain in vivo.</a> Biomedical Optics Express. 2, 3129-3134 (2011).</li>
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<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5, (2010).</li>
<li>Lu, M., Majewska, S., K, A., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Thin-skull+Window+Technique+for+Chronic+Two-photon+In+vivo+Imaging+of+Murine+Microglia+in+Models+of+Neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. (43), e2059(2010).</li>
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<li>Liang, C., Wierwille, J., Moreira, T., Schwartzbauer, G., Jafri, M. S., Tang, C., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forward-imaging+needle-type+OCT+probe+for+image+guided+stereotactic+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">A forward-imaging needle-type OCT probe for image guided stereotactic procedures.</a> Opt Express. 19, 26283-26294 (2011).</li>
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<li>Galetta, K. M., Calabresi, P. A., Frohman, E. M., Balcer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Coherence+Tomography+%28OCT%29%3A+imaging+the+visual+pathway+as+a+model+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Society+for+Experimental+NeuroTherapeutics%22%5BJournal%5D)">Optical Coherence Tomography (OCT): imaging the visual pathway as a model for neurodegeneration.</a> The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 8, 117-132 (2011).</li>
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<li>Gill, A. S., Rajneesh, K. F., Owen, C. M., Yeh, J., Hsu, M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+optical+detection+of+cerebral+edema+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Early optical detection of cerebral edema in vivo.</a> J. Neurosurg. 114, 470-477 (2011).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

使用OCT和磨薄颅骨进行成像是一种新型神经成像技术，近年来才开始受到研究15, 16在我们的实验中，我们通过小鼠模型证明了利用TSCW进行SD-OCT成像的可行性 体内根据我们的结果，颅骨被减薄至约55 μm，成像轴向和横向分辨率分别为8 μm和20 μm，穿透深度可达约1 mm。在信号强度分布中，与正常颅骨相比，通过TSCW进行OCT成像可提高信号强度和穿透深度图4相比之下，使用TSCW在颅骨厚度约为10–15 μm时进行双光子成像，可达到皮层表面下150–250 μm的成像深度10, 11, 13 轴向分辨率为约 3 μm10 而厚度约为20 μm的颅骨成像深度可达大脑皮层内300–400 μm12总体而言，光学相干断层扫描（OCT）作为一种成像模式展现出良好的应用前景，可在组织透明化切片（TSCW）减薄过程中允许更厚的样本厚度，同时相比多光子显微镜具有更深的成像穿透深度。
采用去薄颅骨法在光学成像（如OCT15, 16</su...

自20世纪90年代初引入以来，光学相干断层扫描（OCT）已广泛用于生物组织结构与功能的成像2OCT 通过测量后向散射光的回波时间延迟来生成横截面图像4 通过采用低相干光源与光纤迈克耳孙干涉仪相结合的方式2,4SD-OCT，也称为傅里叶域OCT（FD-OCT），于1995年首次被提出5 与传统的时域光学相干断层扫描（TD-OCT）相比，提供更优越的成像方式。在SD-OCT中，参考臂保持静止，从而实现高速和超高分辨率的图像采集6-9.
目前，TSCW模型主要被用于 体内 双光子显微镜在脑成像中的应用，替代传统的开颅手术。这些经颅窗口（TSCW）可与定制颅骨板或玻璃盖玻片同时使用。10-13 以提供额外的成像稳定性。在我们的研究中，观察到当使用TSCW时，此类附件对于OCT成像并非必需。因此，无需颅骨板或玻璃盖玻片，可避免其对光束的干扰以及对OCT图像的改变，从而允许更大范围的成像窗口尺寸。
一种去薄颅骨制备方法在利用双光子显微镜进行脑部成像的研究中已显示出优势10-13在我们的实验中，我们利用谱域光学相干断层成像系统（SD-OCT）对皮层进行成像 体内 通过TSCW。我们定制的SD-OCT成像系统包含一个宽带低相干光源，该光源由两个中心波长为1295 nm、带宽为97 nm的超发光二极管（SLD）组成，可实现8 μm的轴向分辨率和20 μm的横向分辨率14利用我们的光学成像设备，我们预计通过TSCW进行成像在识别和可视化光学致密脑组织中的结构与功能方面具有巨大潜力。

<table><tbody><tr><td>氯胺酮</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>57319-542-02</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Akorn, Inc.</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>人工泪液软膏</td><td>Rugby</td><td>0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏（Nair）</td><td>Church &amp; Dwight Co., Inc.</td><td>4010130</td><td></td></tr><tr><td>无菌酒精消毒片</td><td>Kendall Healthcare</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-115</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液涂抹棒</td><td>Purdue Products</td><td>67618-153-01</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水溶液，0.9%</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>57319-555-08</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高速外科手柄钻</td><td>Foredom</td><td></td><td>38,000 rpm</td></tr><tr><td>碳化钨圆磨头</td><td>Stoelting</td><td></td><td>0.75 mm</td></tr><tr><td>Dura-Green 磨石</td><td>Shofu</td><td></td><td>柄部：HP&lt;br/&gt; 形状：BA1</td></tr><tr><td>CompoMaster 粗磨头与 CompoMaster 抛光头</td><td>Shofu</td><td></td><td>形状：Mini-Pt.</td></tr><tr><td>SpaceDrapes 手术铺巾</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

减薄颅骨皮层窗技术 体内 光学相干断层成像

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

光学相干断层扫描（OCT）是一种具有高时空分辨率的生物医学成像技术。由于其微创特性，OCT 已广泛应用于眼科、皮肤科和胃肠病学领域。1-3. 采用减薄颅骨皮层窗（TSCW），我们利用谱域光学相干断层成像（SD-OCT）技术作为成像工具对皮层进行成像 体内通常，开颅手术已用于神经成像，因其具有更高的灵活性；然而，经颅窗（TSCW）方法侵入性更小，是神经病理学研究中进行长期成像的有效手段。本文介绍了一种在小鼠模型中建立经颅窗的方法 体内 大脑皮层的OCT成像

在大脑皮层上创建减薄窗后，血管结构应变得更加清晰可见（图1），并可实现更深的成像深度（可达1 mm）。右侧皮层减薄至约55 μm，而正常颅骨厚度为140 μm（图1），从而提供了更高的光学透明度。进一步减薄至10–15 μm是可行的11，但由于本实验未使用玻璃盖玻片或颅骨盖板，因此并不必要（图1和图2）。该特定方法使我们能够在OCT横断面图像中识别特定结构（大脑皮层、胼胝体）（图3）。图中展示了正常颅骨（图3A）与减薄颅骨（图3B）的旁矢状面OCT图像，以比较成功实施TSCW后的OCT成像效果。此外，还获取了冠状面OCT横断面图像，以辅助识别中线结构（图3C）。图3的最大信号强度比噪声基底高45 dB。对未减薄颅骨与减薄颅骨的强度分布进行比较，显示TSCW模型具有更高的信号强度和更深的穿透深度（图4）。
...

我们介绍一种在小鼠模型中制备薄颅骨皮层窗（TSCW）的方法 体内 大脑皮层的OCT成像

光学相干断层扫描（optical coherence tomography, OCT）是一种具有高时空分辨率的生物医学成像技术。由于其微创特性，OCT 已广泛应用于……

本实验方案的总体目标是在小鼠模型中制备薄颅骨颅窗，以实现对大脑的活体光学相干断层扫描成像。首先对动物进行麻醉并做好手术准备，随后使用不同类型的牙科磨头对颅骨进行打磨减薄。最后一步是通过薄颅骨颅窗在活体中获取大脑的OCT图像。最终，可以从所得的OCT图像中获得大脑的结构和功能信息。与现有的开颅术或盖玻片颅窗等方法相比，该技术的主要优势在于，薄颅骨颅窗侵入性更小，更有可能保持大脑的生物学完整性和活性。该技术的应用前景涉及神经系统疾病的诊断，因为光学相干断层扫描（OCT）具有高空间和时间分辨率，并且与共聚焦显微镜和双光子显微镜相比，具有更优的组织穿透深度。通常，初次使用该方法的研究人员在制备均匀且薄的颅骨表面时会遇到困难，容易导致颅骨骨折或硬脑膜下出血。开始此操作前，需对一只6至8周龄的CD小鼠通过腹腔注射给予氯胺酮和赛拉嗪混合物进行麻醉。然后将小鼠置于恒温垫或保温毯上，以确保手术准备期间体温维持在约37摄氏度的适宜水平；通过检测动物的反射持续监测麻醉深度，并在必要时追加麻醉剂。接着，用人工泪膏润滑双眼。使用电推剪去除头皮上的毛发。然后用纱布垫或棉签清除残留的剪余毛发。之后，在头皮上涂抹一层薄薄的脱毛膏。两分钟后，使用生理盐水浸湿的棉签和酒精消毒片轻轻擦去脱毛膏及残留毛发。现在使用碘伏棉签对头皮进行消毒，并用70%乙醇擦拭垫清洁。然后将动物固定在立体定位仪上以固定头骨。轻敲头骨以确认其稳定性。在此操作中，从两眼之间的中点处开始做头皮切口。继续沿中线向两耳之间的中点延伸，用镊子牵起皮瓣。接下来，在解剖显微镜下确定需要减薄的区域。使用镊子刮除颅骨以去除任何残留的筋膜。然后用无菌棉签擦干颅骨，再于前囟后方及外侧约一毫米处制作一个四乘四毫米的薄皮质窗。使用带有圆形碳化钨钻头的外科手钻，以轻柔的扫动方式磨薄颅骨。切勿对颅骨施加直接压力。每钻孔20至30秒后暂停一次，使用无菌生理盐水和棉签清除骨屑，并避免颅骨过热。生理盐水还有助于将热量分散至整个颅骨。当致密骨的外层被完全去除后，应可见中间的松质骨层。由于松质骨层中的血管更为明显，可能会出现轻微出血。此时应更换为绿色砂石钻头，并格外小心地继续钻孔。由于疏松层较为脆弱，使用绿色石钻头可在确保颅窗均匀的同时去除更少的骨质。钻孔过程中应不时暂停，以清除骨屑并冷却颅骨。最后，当颅骨变得较为透明且脑部血管清晰可见时，开始用抛光钻头对颅骨进行抛光，并用镊子轻轻敲击颅骨以检查其厚度，当达到所需厚度时停止抛光。当颅骨变得略有弹性时，此时减薄的颅骨窗口应完全平滑且具有反光性，可进行成像。由于脑组织属于高度散射性组织，为获得最佳的成像穿透深度，颅骨应减薄至至少55微米。手术完成后，通过视觉观察动物的呼吸频率和反射情况，以确认麻醉水平是否适当，必要时追加麻醉剂。随后将动物置于OCT相机下，并将减薄颅骨的颅窗部位对准光学光束。现在可以观察到颅骨和大脑的横截面视图。数据采集可以开始。一旦确定了用于成像的目标区域，我们便将OCT光束扫描过一个宽度为4.0毫米的皮层成像窗口，并在入射功率为六毫瓦、焦点位于薄颅骨下方0.1毫米处的条件下，获得两毫米的成像深度。每个横截面由2048次轴向扫描组成，图像采集速率为每幅图像0.14秒。该特定方法使我们能够识别OCT横截面图像中的特定结构。此图显示了在正常颅骨下的大脑皮层的旁矢状位OCT图像，此处显示了在薄颅骨下的旁矢状位OCT图像。与正常颅骨相比，薄颅骨颅窗下脑部结构在视觉上更为明显。此外，还可获取冠状面的光学相干断层成像（OCT）横截面图像，以辅助识别中线结构。通过使用两组检流计振镜（galvo mirrors）进行XY扫描，其中第一组检流计振镜使光束在矢状方向扫描，第二组检流计振镜在冠状方向扫描，从而采集一系列二维横截面图像，获得脑部的三维容积扫描图像。一旦掌握，该技术可在10分钟内完成，前提是操作得当。在实施该过程时，重要的是要均匀地磨薄颅骨，以确保在OCT成像期间有充分的信号穿透。观看本视频后，您应能充分理解如何为OCT成像制备薄颅骨皮层窗。

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稀疏的头骨皮层的窗口技术<em在体内</em光学相干断层成像

我们描述了一种用于反复观察小鼠小胶质细胞和循环单核细胞的方法 体内...

一种用于慢性双光子成像的薄颅窗技术 体内 神经炎症模型中鼠类小胶质细胞的成像

在本视频及补充材料中，我们展示了一种利用磨薄颅骨制备法对完整大脑进行长期在体成像的实验方案。...

使用磨薄颅骨制备法对小鼠视觉皮层进行长期成像

我们介绍一种在小鼠颅骨上制备成像窗口的方法，该窗口可跨越数毫米，并且在数月内保持稳定，且不会引起脑部炎症。该方法非常适合利用双光子显微镜进行血流、细胞动态以及细胞/血管结构的长期研究。...

一种经过抛光和加固的减薄颅窗，用于小鼠大脑的长期成像

通过结合抛光加固的薄颅骨（PoRTS）颅窗和胶质母细胞瘤（GBM）细胞注射，我们能够对活体小鼠脑内注射的GBM细胞所引发的胶质瘤发生及生长过程进行长期纵向观察。...

成像胶质瘤起始过程 在体 内 通过抛光并加固的薄颅骨颅窗

在活体动物中进行延时成像可为完整大脑内的结构重组提供重要信息。本文介绍一种颅骨减薄制备方法，该方法可通过双光子显微镜对活体小鼠大脑皮层中荧光标记的突触结构进行经颅成像。...

双光子 体内 使用颅骨变薄制备法对小鼠皮层树突棘进行成像

本文介绍了一种半侵入性光学显微技术，用于在活体小鼠的体感皮层中诱导玫瑰红光栓塞凝块。in...

孟加拉红光栓塞的共聚焦光学成像 体内单血管卒中模型

本文描述了一种在淀粉样斑块积聚过程中追踪脑血管重塑的方法 体内...

纵向的 体内 脑血管成像：与中枢神经系统疾病的相关性

我们描述了一种通过双侧初级躯体感觉皮层（S1）上方的双光窗记录神经元活动的实验方法 Thy1- 使用双光子（2P）显微镜的GCaMP6s转基因小鼠 体内.

使用 Thy1-GCaMP6s 转基因小鼠对初级躯体感觉皮层中的神经活动进行成像

本文介绍了一种用于在清醒且头部固定的活体小鼠中对脑细胞进行长期成像的慢性颅窗植入实验方案。...

植入颅窗以实现重复观察 在体实验 清醒小鼠成像

我们介绍了一种名为光学多层干涉断层成像（Optical Multilayer Interference Tomography,...

一种与扫描电子显微镜兼容的光学成像方法用于介观全细胞脑图谱绘制

了解稀疏头骨皮层窗口技术，通过光学相干断层成像实现小鼠大脑活体成像。该方法比传统开颅手术创伤更小，能更好地保持大脑生物活性，为神经疾病诊断提供高分辨率结构功能信息。

减薄颅骨皮层窗技术体内光学相干断层成像

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减薄颅骨皮层窗技术 体内 光学相干断层成像

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