Name: Modificazione genetica e ricombinazione delle Culture organo ghiandola salivare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Scopri la manipolazione genetica delle cellule epiteliali nelle ghiandole salivari submandibolari embrionali di topo mediante trasferimento genico virale. Questo metodo consente di studiare la morfogenesi ramificata senza creare organismi transgenici.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Deirdre Nelson per gli utili commenti e per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH DE019244, DE019197 e DE021841 a ML, F32DE02098001 di SJS e C06 RR015464 all&#39;Università di Albany, SUNY.

Il protocollo prevede quattro fasi principali, come illustrato nella Figura 1. Tutti i passaggi sono descritti in dettaglio. Costruzione adenovirus e purificazione virale deve essere fatto prima della raccolta di organi per l&#39;uso nella trasduzione genetica di sezionati rudimenti epiteliali. Tutti gli standard di BSL-2 misure di sicurezza devono essere seguite quando si lavora con adenovirus. 1. Embrionali di topo sottomandibolare Gland (SMG) Raccolta e Microdissection <ol><li> Eutanasia topi di sesso femminile a tempo-in stato di gravidanza (ceppo consanguinei CD-1 o ICR) con emissioni di CO 2 narcosi, seguita da dislocazione cervicale e archi raccolta di embrioni di topo al giorno embrionale 13 (E13, 3-5 gemme epiteliali) seguenti procedure approvate dal IACUC istituzionale comitato. Il giorno della scoperta tappo vaginale è designato come E0. Ghiandole salivari possono essere raccolte e coltivate nella fase E12 quando vi è un singolo germoglio primario e gambo con fessure iniziandoper iniziare. SMGs prima di questa fase, richiedono condizioni di coltura diverse da quelle indicate. </li><li> Trasferire stringhe embrioni in sterili 10 piatti tessuto centimetri coltura riempite con 25 ml di DMEM / Ham &#39;s Medio F12 (F12) manca rosso fenolo (Life Technologies), integrato con 100 U / ml di penicillina, e 100 pg / ml di streptomicina (pen-strep, Life Technologies). </li><li> Usando un bisturi sterile (# 11 pale) e pinza (# 5, Strumenti scientifici Arti, 11252-20), rimuovere gli embrioni dalle sacche in una separata 10 portata cm contenente 25 ml di DMEM/F12 + pen-streptococco. </li><li> Sever le teste di embrioni con un taglio angolato appena sotto la mascella inferiore. </li><li> Isolare le mandibole inferiori dalle teste sotto un microscopio da dissezione stereo con una base di luce trasmessa (Nikon SMZ645 o equivalente) con un taglio sotto la mascella superiore. Posizionare i tessuti sopra un ulteriore pezzo di vetro piuttosto che direttamente sul componente in vetro della base del microscopio. </li><li> Raccogliere le mandibole inferiori in 3 ml di DMEM/F12 + pen-strep in una piastra da 35 sterile cultura del tessuto mm. </li><li> Una fetta mandibola sulla scena microscopio da dissezione modo che la linguetta è sul fondo della fetta, ma è rivolta verso la posizione 12:00. </li><li> Utilizzando un lato due pinze incrociate in un movimento a forbice, rimuovere ed eliminare il rd 1/3 inferiore della fetta mandibola. </li><li> Ruotare di 90 ° sezione a destra (se la mano destra) e, con un taglio a forbice con le pinze, tagliare la parte superiore della fetta mandibola (senza il taglio della lingua) a metà strada nella fetta. </li><li> Sbucciare il tessuto in eccesso e rimuoverlo per esporre i fucili mitragliatori sotto. Ci sarà uno su ciascun lato vicino alla base della lingua. </li><li> Usando un paio di pinze a tenere premuto il tessuto con la lingua, usare il forcipe altri a prendere in giro la SMG di distanza dalla lingua. Ripetere l&#39;operazione per la ghiandola altro. </li><li> Raccogliere le ghiandole salivari microdissezione in 3 ml di DMEM/F12 + pen-strep in un nuovo tessuto sterile 35 millimetricultura piatto. Nota: le ghiandole sottomandibolari più grandi (3-5 gemme epiteliali) insieme al più piccolo collegato ghiandola sublinguale (1 auricolari) possono essere coltivate intatto saltando al punto 4 ed eseguito le fasi 4.1, 4.3, e 4.4, come descritto in precedenza 2,8. </li></ol> 2. SMG separazione epiteliale Rudiment <ol><li> Posto 5 (o più) ghiandole salivari in un fondo di vetro, diametro 50 mm micropozzetti piatto (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) contenente 200 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS privo di Ca + + e Mg + +, Life Technologies) contenente 0,4% (v / v) dispasi (Life Technologies, cat. no. 17.105-041) e incubare per 15 min a 37 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, utilizzando una sterile 200 microlitri punta della pipetta, aspirare accuratamente la soluzione dispasi senza disturbare le ghiandole. Immediatamente aggiungere 200 microlitri di DMEM/F12 supporto contenente 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, pre-sterilizzati con un filtro di 0,22 micron) per neutralizzare l&#39;dispasi. </li> &lt;li&gt; Sotto un microscopio da dissezione, usando un paio di pinze con le punte fini (# 5 Dumostar, Strumenti scientifici Arti, 11295-20), separare delicatamente il mesenchima allentato intorno ai germogli SMG epiteliali e condotti, avendo cura di lasciare l&#39;epitelio intatto . </li><li> Pre-wet una sterile 200 ml con puntale DMEM/F12-BSA media e pipettare delicatamente i rudimenti epiteliali in un nuovo piatto di 50 mm di diametro pozzetto contenente 200 ml di DMEM/F12 + pen-streptococco. Utilizzare una punta di alta qualità 200 microlitri pipetta con un bordo liscio. </li><li> Nel piatto che contiene i pezzi mesenchima, scartare qualsiasi non-tessuto mesenchimale comprese le ghiandole sublinguali e le gemme staccate ghiandola sottomandibolare. </li></ol> 3. L&#39;infezione adenovirale di Rudimenti epiteliali <ol><li> Marca 200 pl di supporti infezione virale diluendo l&#39;adenovirus di interesse in DMEM/F12 + pen-strep in una provetta da microcentrifuga modo che il titolo della soluzione risultante è 1x10 8 -10 9 PFUs. Iltitolo ottimale necessaria per diversi virus possono variare. È importante usare cloruro di cesio (CsCl)-preparazioni purificate virali per efficienza assorbimento ottimale. </li><li> Rimuovere il supporto dal piatto contenente i cinque rudimenti epiteliali. Rapidamente aggiungere 200 microlitri di media infezione, mantenendo i rudimenti sempre umida. Prendere le necessarie precauzioni nel maneggiare il virus e lo smaltimento dei puntali contaminati. Disinfettare eventuali virus superfici contaminate con soluzione di candeggina al 10%. </li><li> Spostare i rudimenti epiteliali lontani l&#39;uno dall&#39;altro con una pinza per evitare che si attacchino e consentire loro di depositarsi sul fondo della piastra. Incubare rudimenti in media virali per 1 ora a temperatura ambiente. Durante l&#39;incubazione, separare i rudimenti, se si muovono vicini. Dondolo eccessivo o movimento permetterà le ghiandole ad ammassarsi. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, rimuovere delicatamente le virali contenenti i media ed eliminare in modo appropriato, facendo attenzione a non disturbare il rudiments. Aggiungere 200 ml di DMEM/F12 + pen-streptococco. Ripetere il lavaggio almeno altre due volte e sostituirlo con 200 ml di DMEM/F12 + pen-strep media. I lavaggi sono fondamentali per rimuovere eventuali virus che non è fortemente collegato al epitelio e per prevenire l&#39;infezione del mesenchima. </li><li> Incubare rudimenti epiteliali con 200 ml di DMEM/F12 contenente 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356.231) per 20 min. Troviamo che questo breve incubazione in Matrigel minimizza la regressione di fessure esistenti durante il periodo di coltura iniziale, ma questo passaggio può essere omesso se l&#39;esposizione a Matrigel non è desiderato. </li></ol> 4. Ex vivo di cultura fucili mitragliatori ricombinato <ol><li> Posizionare ogni rudimento, uno alla volta, utilizzando un pre-wet 200 microlitri punta della pipetta, sopra un intaglio (piccolo taglio) 13 mm, 0,1 um Nuclepore Track-Etch membrana filtro (Whatman) galleggianti su 200 microlitri di terreni di coltura ( 5 rudimenti / filtro) in un fondo di vetro per micropiastre. La cultura dei mediaè: DMEM/F12 + pen-strep contenente 50 ug / ml di transferrina e 150 ug / ml di acido ascorbico, come precedentemente descritto 2,8. La transferrina è noto per stimolare la sopravvivenza e la ramificazione morfogenesi delle ghiandole salivari e espianti di organi di altri 9. Aggiunta di acido ascorbico è stato mostrato per stimolare SMG ramificazione. 10 E &#39;noto per agire come cofattore in molte reazioni di idrossilazione di vie metaboliche (come idrossilazione prolina durante la formazione di fibre collagene 11) e stimola anche la produzione di fibronectina e laminina in espianti altri organi 12. </li><li> Rimuovere come media molto sulla parte superiore del filtro possibile dopo l&#39;aggiunta di ogni rudimento epiteliale. Quantità eccessiva di supporti sulla parte superiore del filtro può causare il filtro di affondare, mentre meno dei media, rende il posizionamento dei rudimenti e mesenchima molto più facile. Supporti in eccesso può essere rimosso o con una pipetta o utilizzando pinze per afferrare il materiale tra le punte. </li><li> Luogo pezzi mesenchima derivato from 3-4 ghiandole sulla parte superiore e / o intorno ad ogni rudimento epiteliale. Rimuovere eventuali supporti aggiuntivi che circonda le ghiandole per evitare movimenti del mesenchima lontano dai rudimenti. Mesenchima deriva dal più ghiandole non è utile ma meno può essere dannoso per la crescita epiteliale rudimento. </li><li> Incubare SMGs ricombinati in un incubatore umidificato (95% aria / 5% CO 2) a 37 ° C per 48 -72 ore, come desiderato. </li><li> Acquisire campo chiaro e / o immagini fluorescenti di ghiandole in scena a 0 ore (se lo si desidera), 2 ore dopo la ricombinazione e ogni 24 ore in seguito con microscopio ottico invertito, in posizione verticale, o stereo dotato di una fotocamera digitale con un obiettivo di ingrandimento 4X o 5X per catturare l&#39;intera ghiandola ricombinato in un singolo fotogramma di vista. Immagini della ghiandola salivare mostrano il miglior contrasto utilizzando l&#39;impostazione campo chiaro o l&#39;anello di fase eventualmente montata un certo punto del percorso della luce (che non è possibile a completamente automatizzati microscopi). Contrasto di fase standard non èt necessario poiché la ghiandola è spesso e crea contrasto. </li><li> I desiderati punti temporali, SMGs ricombinati possono essere fissate per 20 minuti con soluzione fissativa realizzati 2% paraformaldeide (PFA) in 1X PBS contenente 5% (w / v) di saccarosio (per preservare meglio la struttura cellulare interna, mantenendo le cellule in uno stato isosmotic). Diversamente 4% PFA, 2% PFA manterrà una quantità significativa del segnale GFP se il fissativo è completamente rimosso dopo fissazione. Le ghiandole possono essere conservati per un massimo di 1 settimana in 1X PBS al buio a 4 ° C fino intera immunocitochimica montaggio e di imaging confocale viene eseguita, come riportato precedentemente 3,6,13-15. Idealmente, immunocitochimica e di imaging deve essere eseguita subito dopo la fissazione per ottenere le migliori immagini. Ghiandole possono anche essere lisate in tampone RIPA per SDS-PAGE seguita da Western blotting. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;ex vivo epitelio-mesenchimale tecnica di ricombinazione è stato pubblicato per la sottomandibolare ghiandole salivari nel 1981 16. In questo protocollo, si ampliano il metodo originale, usando l&#39;infezione adenovirale per manipolare cellule epiteliali espressione genica nel contesto di una ghiandola ricombinato. Abbiamo dimostrato che una percentuale delle cellule epiteliali sono infettati con l&#39;adenovirus, mentre la percentuale di cellule che sono infettate dipende dalle proprietà del p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12 americano senza rosso fenolo </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina e streptomicina </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> Magazzino 10X </td></tr><tr><td> Dispasi </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Congelare aliquote monouso a-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> Frazione V, endotossine basso </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Dovrebbe essere alto titolo (1x10 10 pfu / ml). CsCl virus purificate sono più efficaci di virus purificato su colonna in questo saggio. </td></tr><tr><td> 16% paraformaldeide </td><td&gt; Scienze della microscopia elettronica </td><td> 15710 </td><td> Diluita al 2% in PBS con 5% di saccarosio (w / v) </td></tr><tr><td> 1X tampone fosfato salino (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Preparato da stock 10X </td></tr><tr><td> Sale di Hank soluzione equilibrata </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> no Calcio, Magnesio no, no rosso fenolo </td></tr><tr><td> Transferrina </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml di soluzione in magazzino DMEM/F12 media. Congelare monouso aliquote a-20C </td></tr><tr><td> Acido L-ascorbico (vitamina C) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> 75 mg / ml di soluzione concentrata in DMEM/F12 media.Freeze monouso aliquote a-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Elenco dei reagenti necessari per SMG protocollo ricombinazione. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 piatti centimetri plastica sterili </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Piastre di coltura di tessuti-non-trattata può anche essere usato. </td></tr><tr><td> Stereo microscopio da dissezione con base a luce trasmessa </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Ogni dissezione stereo microscopio può essere utilizzato che ha una base a luce trasmessa. </td></tr><tr><td> 35 millimetri di tessuto di coltura piatti </td><td> Falco </td><td> 353001 </td><td> Piastre di coltura di tessuti-non-trattata può anche essere usato. </td></tr><tr><td> Diametro 50 mm micropozzetti piatti </td><td> MatTek Corporation </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch filtri a membrana </td><td> Whatman </td><td> 110405 </td><td> Diametro di 13 mm, 0,1 millimetri dimensione dei pori </td></tr><tr><td> Widefield microscopio a fluorescenza </td><td> Carl Zeiss, Stati Uniti d&#39;America </td><td> Axio Observer Z1 </td><td> Ogni microscopio a fluorescenza (in posizione verticale, inverted o stereo microscopio da dissezione) può essere utilizzato per monitorare l&#39;espressione della GFP a basso ingrandimento con una fotocamera digitale allegata. </td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Microscopia confocale è necessario vedere le strutture cellulari dettagliate. Qualsiasi microscopio confocale può essere utilizzato. </td></tr><tr><td> Topi di sesso femminile in stato di gravidanza, a tempo-deformazione CD-1 o ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Gli embrioni sono raccolti il ​​giorno 13 (con il giorno della scoperta spina designato come giorno 0). </td></tr><tr><td> Bisturi # 11 </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Manico bisturi # 3 </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinze in lega di acciaio inox, 0,05 millimetri 0,02 millimetri X </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11252-20 </td><td> Ideale per la raccolta di ghiandole da embrioni </td></tr><tr><td&gt; Dumont # 5 forcipe dumostar lega, 0,05 millimetri 0,01 millimetri X </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11295-20 </td><td> Punta fine sono necessari per la rimozione di mesenchima da epitelio. Aghi tungsteno può anche essere usato. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 2. Apparecchiatura utilizzata nelle SMG protocollo di ricombinazione. </td></tr></tbody></table>

modificazione genetica e ricombinazione delle culture organo ghiandola salivare

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morfogenesi avviene durante lo sviluppo di molti organi, e l&#39;embrione ghiandola sottomandibolare mouse (SMG) è un modello classico per lo studio di branching morfogenesi. Nel SMG sviluppo, questo processo comporta fasi iterative di gemma epiteliale e formazione condotto, per dare infine origine a una complessa rete ramificata di acini e condotti, che servono per produrre e modificare / trasportare la saliva, rispettivamente, nella cavità orale 1 - 3. Il epiteliale associata membrana basale e aspetti del compartimento mesenchimale, comprese le cellule mesenchimali, fattori di crescita e la matrice extracellulare, prodotti da queste cellule, sono fondamentali per il meccanismo di ramificazione, anche se come gli eventi cellulari e molecolari sono coordinate rimane poco compresa 4 . Lo studio dei meccanismi molecolari di guida anticipi morfogenesi epiteliali la nostra comprensione dei meccanismi di sviluppo e permette di comprendere meglio possibile rigeapprocci di medicina ative. Tali studi sono stati ostacolati a causa della mancanza di metodi efficaci per la manipolazione genetica dell&#39;epitelio salivare. Attualmente, trasduzione adenovirale rappresenta il metodo più efficace per il targeting cellule epiteliali in ghiandole adulti in vivo 5. Tuttavia, in espianti embrionali, mesenchima denso e la membrana basale che circonda le cellule epiteliali ostacolo all&#39;accesso virale alle cellule epiteliali. Se il mesenchima viene rimosso, l&#39;epitelio possono essere trasfettate con adenovirus, e può riprendere rudimenti epiteliali branching morfogenesi in presenza di Matrigel o laminina-111 6,7. Mesenchima-free crescita epiteliale rudimento richiede anche una ulteriore integrazione con fattori di crescita solubili e non pienamente ricapitolare morfogenesi ramificazione come si verifica in ghiandole intatti 8. Qui si descrive una tecnica che facilita adenovirale trasduzione delle cellule epiteliali e la cultura del e transfettatepithelium con mesenchima associati. Dopo microdissezione dei fucili mitragliatori embrionali, la rimozione del mesenchima, e l&#39;infezione virale dell&#39;epitelio con una GFP contenente adenovirus, si dimostra che l&#39;epitelio ricombina spontaneamente con mesenchima non infetti, ricapitolando intatta la struttura ghiandolare SMG e la ramificazione morfogenesi. La popolazione geneticamente modificato delle cellule epiteliali possono essere facilmente monitorato con metodi standard di microscopia a fluorescenza, fluorescenza se-tagged costrutti adenovirali sono utilizzati. Il metodo di ricombinazione tessuto descritto è attualmente il metodo più efficace ed accessibile per la trasfezione di cellule epiteliali con un vettore wild-type o mutanti all&#39;interno di un costrutto complesso tessuto 3D che non richiede la generazione di animali transgenici.

Il flusso delle fasi principali sperimentali è descritto nella Figura 1. Un esempio di un SMG intatto, un rudimento isolato epiteliale, e il mesenchima corrispondenti sono mostrati nella Figura 2. Immagini brightfield di SMGs ricombinati, che continuano a subire branching morfogenesi quando coltivate ex vivo per i tempi riportati, sono mostrati in Figura 3. Ghiandole ricombinati coltivate per 48 ore esprimere GFP epiteliale sono mostrati in Figura 4.</s...

Una tecnica per manipolare geneticamente le cellule epiteliali in tutta<em&gt; Ex vivo</em&gt; Embrionali di topo in coltura ghiandole sottomandibolari (SMG) con il trasferimento del gene virale è descritto. Questo metodo sfrutta la capacità innata di SMG epitelio e mesenchima di ricombinare spontaneamente dopo la separazione e l&#39;infezione dei rudimenti epiteliali con vettori adenovirali.

Modificazione genetica e ricombinazione delle Culture organo ghiandola salivare

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di alterare l'espressione di una proteina desiderata nell'epitelio del topo, ghiandola salivare embrionale sottomandibolare utilizzando costrutti adenovirali. Ciò si ottiene raccogliendo gli embrioni al giorno 13 dell'embrione e sezionando le ghiandole salivari sottomandibolari. Successivamente, i rudimenti epiteliali vengono separati dal mesenchima circostante e immersi in coltura contenente virus.Il terreno dopo il lavaggio del rudimento viene incubato in matrigel contenente terreno e abbiamo combinato con tre dei mesenchimi per colture ex vivo i cambiamenti nei livelli di proteine bersaglio e il suo effetto sulla morfogenesi ramificata può essere analizzato utilizzando l'immunochimica e la microscopia standard o l'analisi del sangue occidentale. Questa tecnica ci consente di modificare geneticamente un solo compartimento tissutale in un organo complesso e di monitorare i cambiamenti in un intero organo riassemblato explan senza creare un organismo transgenico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che rende possibile l'espressione di una proteina wild type o dominante negativa all'interno del compartimento epiteliale.Seguendo le procedure standard, prelevare prima 13 embrioni in piastre da 10 centimetri con 25 millilitri di terreno. Successivamente, usando una pinza, rimuovere gli embrioni dai loro sacchi e trasferire gli embrioni in un piatto di 10 centimetri contenente 25 millilitri di D-M-E-M-F 12 con streptococco a penna sotto uno stereoscopio con una base a luce trasmessa, posizionare l'embrione sopra un pezzo di vetro pulito. Ora separa le teste dell'embrione con un taglio angolato appena sotto la mascella inferiore o la mandibola e isola le mandibole inferiori usando un taglio sotto la mascella superiore.Quindi trasferire le mandibole inferiori in tre millilitri di D-M-E-M-F 12 con strep a penna in una piastra di coltura tissutale da 35 millimetri. Ora rimetti una mandibola sulla lastra di vetro sul tavolino e posizionala in modo che la lingua tocchi il vetro e punti verso la posizione delle ore 12. Usando un lato di due pinze incrociate con un movimento a forbice, rimuovere e scartare il terzo inferiore della mandibola.Quindi, ruota la mandibola di 90 gradi verso la tua mano dominante e con un movimento a forbice taglia la parte superiore della mandibola. Ora stacca il tessuto in eccesso ed esponi le mitragliette sotto il tessuto. Ce ne sarà uno su ciascun lato vicino alla base della lingua su ciascun lato.Usa un paio di pinze per tenere premuto il tessuto vicino alla lingua e l'altro paio per allontanare la mitraglietta dalla lingua. A questo punto, la mitragliatrice più grande e la ghiandola sublinguale adiacente possono essere coltivate intatte con il mesenchima circostante. In caso contrario, passare alla sezione successiva.Inizia mettendo almeno cinque piante di ghiandole salivari in un piatto a micropozzetti da 50 millimetri con fondo di vetro con 200 microlitri di HBSS più pasta diss. Incubare le ghiandole per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri, estrarre con cura la soluzione di pasta diss senza disturbare immediatamente le ghiandole.Aggiungere 200 microlitri di D-M-E-M-F 12 media con BSA Per neutralizzare la dispa, utilizzare un paio di pinze numero cinque con punte sottili per separare delicatamente il tessuto mesenchimico allentato con la ghiandola sublinguale dalle gemme epiteliali e dai dotti della ghiandola sottomandibolare più grande. Fai attenzione a lasciare l'epitelio il più intatto possibile. Quindi, selezionare un puntale per pipetta da 200 microlitri di alta qualità con un bordo liscio pre sul puntale in terreni D-M-E-M-F 12 BSA.Quindi pipettare delicatamente i rudimenti epiteliali liberi da mechy in un nuovo piatto per micropozzetti di 50 millimetri di diametro contenente 200 microlitri di D-M-E-M-F 12 più streptococco a penna. Infine, nel piatto contenente i pezzi di mesenchima, scartare l'eventuale tessuto non mesenchimale. Ciò include le ghiandole sublinguali e le gemme delle ghiandole sottomandibolari staccate.Mettere da parte il mesenchima rimasto. Innanzitutto, preparare 200 microlitri di terreno di infezione alla concentrazione ottimale del titolo da una preparazione virale purificata con gradiente di cloruro di cesio. Ora, sotto il microscopio da dissezione, rimuovere il terreno dal piatto contenente i cinque rudimenti epiteliali.Quindi aggiungere rapidamente 200 microlitri di terreno di infezione, mantenendo i rudimenti sempre bagnati con una pinza. Separare i rudimenti epiteliali lontani l'uno dall'altro per evitare che si attacchino tra loro e per permettere loro di depositarsi sul fondo del piatto. Quindi lasciare che i rudimenti incubino nel terreno virale per un'ora a temperatura ambiente con il minimo disturbo.Controlla i rudimenti ogni 15 minuti per assicurarti che non si siano avvicinati l'uno all'altro. Se necessario, separarli con una pinza. Dopo l'incubazione al microscopio da dissezione, rimuovere delicatamente il terreno virale e scartarlo in modo appropriato, facendo attenzione a non interrompere i rudimenti.Quindi, lavare due volte i rudimenti con 200 microlitri di supporto fresco. Questi lavaggi sono fondamentali per rimuovere qualsiasi virus che è debole attaccato all'epitelio e per prevenire l'infezione del mesenchima. Dopo il secondo lavaggio con terreno a 200 microlitri di terreno, continuando il 2% di matrigel, di nuovo, facendo attenzione a non lasciare che i rudimenti si aggreghino.Quindi lasciare incubare i rudimenti per 20 minuti a temperatura ambiente utilizzando un puntale per pipetta Prewitt da 200 microlitri, posizionare cinque rudimenti sopra un filtro a membrana dentellato, che galleggia su 200 microlitri di terreno di coltura in una piastra a micropozzetti con fondo di vetro. Utilizzando la punta di una pipetta o una pinza, rimuovere il terreno in eccesso dalla parte superiore del filtro in modo che il filtro non affondi e i rudimenti epiteliali rimangano in posizione. Successivamente, posiziona tutti i pezzi di meine derivati da tre o quattro ghiandole attorno a ciascun rudimento epiteliale, assicurandoti che siano in contatto diretto con la ricombinazione del mesenchima da tre a quattro ghiandole con il singolo rudimento epiteliale infettato viralmente è fondamentale per la crescita e lo sviluppo della ghiandola salivare sottomandibolare ricombinata.Quindi rimuovere il terreno in eccesso che circonda le ghiandole in modo che il mesenchima non si allontani dai rudimenti. Ora incubare le ghiandole ricombinate in un'incubatrice umidificata per due o tre giorni interi utilizzando la procedura descritta. Sono stati isolati SMG embrionali intatti e, dopo il trattamento con ritmo DYS, il rudimento epiteliale è stato rimosso dal mesenchima circostante.L'imaging in campo chiaro ha rivelato che le mitragliette ricombinate continuavano a subire una morfogenesi ramificata. Quando coltivato ex vivo. Per i tempi indicati, abbiamo combinato ghiandole che sono state coltivate per 48 ore dopo il trattamento con A GFP.L'adenovirus esprimeva la GFP solo nell'epitelio. Abbiamo combinato le mitragliette sono state fissate, colorate e riprese. Dopo 72 ore, sono stati utilizzati diversi marcatori.I nuclei sono colorati da dpi, il marcatore epiteliale eco qui in rosso delimita la popolazione di cellule epiteliali dal mesenchima circostante. Le cellule epiteliali esprimono GFP adenovirale: il rilevamento della proteina della membrana basale peran nel ciano, localizzato alla periferia dell'epitelio, dimostra che esiste almeno una parziale ricostituzione della membrana basale nelle ghiandole ricombinate. Le proiezioni confocali per DPI in blu e beta tre tubulina in rosso mostrano che i gangli parasimpatici all'interno del mesenchima subiscono la crescita degli URI e innervano le ghiandole nelle colture di ricombinazione.Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione delle tecniche di coltura delle ghiandole salivari sottomandibolari embrionali. La rimozione del mesenchima dall'epitelio e la ricombinazione del mesenchima con l'epitelio infettato viralmente possono rivelarsi entrambi passaggi difficili. Tuttavia, questa procedura consente l'alterazione dell'espressione proteica utilizzando un costrutto virale che viene applicato alle cellule epiteliali.Solo l'infezione adenovirale ci permette di aggiungere proteine costitutivamente attive o dominanti negative all'epitelio per determinare come la manipolazione di una proteina specifica altererà la crescita e lo sviluppo della ghiandola salivare embrionale sottomandibolare.

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