Name: Modificazione genetica e ricombinazione delle Culture organo ghiandola salivare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Scopri la manipolazione genetica delle cellule epiteliali nelle ghiandole salivari submandibolari embrionali di topo mediante trasferimento genico virale. Questo metodo consente di studiare la morfogenesi ramificata senza creare organismi transgenici.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Deirdre Nelson per gli utili commenti e per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH DE019244, DE019197 e DE021841 a ML, F32DE02098001 di SJS e C06 RR015464 all&#39;Università di Albany, SUNY.

Il protocollo prevede quattro fasi principali, come illustrato nella Figura 1. Tutti i passaggi sono descritti in dettaglio. Costruzione adenovirus e purificazione virale deve essere fatto prima della raccolta di organi per l&#39;uso nella trasduzione genetica di sezionati rudimenti epiteliali. Tutti gli standard di BSL-2 misure di sicurezza devono essere seguite quando si lavora con adenovirus. 1. Embrionali di topo sottomandibolare Gland (SMG) Raccolta e Microdissection <ol><li> Eutanasia topi di sesso femminile a tempo-in stato di gravidanza (ceppo consanguinei CD-1 o ICR) con emissioni di CO 2 narcosi, seguita da dislocazione cervicale e archi raccolta di embrioni di topo al giorno embrionale 13 (E13, 3-5 gemme epiteliali) seguenti procedure approvate dal IACUC istituzionale comitato. Il giorno della scoperta tappo vaginale è designato come E0. Ghiandole salivari possono essere raccolte e coltivate nella fase E12 quando vi è un singolo germoglio primario e gambo con fessure iniziandoper iniziare. SMGs prima di questa fase, richiedono condizioni di coltura diverse da quelle indicate. </li><li> Trasferire stringhe embrioni in sterili 10 piatti tessuto centimetri coltura riempite con 25 ml di DMEM / Ham &#39;s Medio F12 (F12) manca rosso fenolo (Life Technologies), integrato con 100 U / ml di penicillina, e 100 pg / ml di streptomicina (pen-strep, Life Technologies). </li><li> Usando un bisturi sterile (# 11 pale) e pinza (# 5, Strumenti scientifici Arti, 11252-20), rimuovere gli embrioni dalle sacche in una separata 10 portata cm contenente 25 ml di DMEM/F12 + pen-streptococco. </li><li> Sever le teste di embrioni con un taglio angolato appena sotto la mascella inferiore. </li><li> Isolare le mandibole inferiori dalle teste sotto un microscopio da dissezione stereo con una base di luce trasmessa (Nikon SMZ645 o equivalente) con un taglio sotto la mascella superiore. Posizionare i tessuti sopra un ulteriore pezzo di vetro piuttosto che direttamente sul componente in vetro della base del microscopio. </li><li> Raccogliere le mandibole inferiori in 3 ml di DMEM/F12 + pen-strep in una piastra da 35 sterile cultura del tessuto mm. </li><li> Una fetta mandibola sulla scena microscopio da dissezione modo che la linguetta è sul fondo della fetta, ma è rivolta verso la posizione 12:00. </li><li> Utilizzando un lato due pinze incrociate in un movimento a forbice, rimuovere ed eliminare il rd 1/3 inferiore della fetta mandibola. </li><li> Ruotare di 90 ° sezione a destra (se la mano destra) e, con un taglio a forbice con le pinze, tagliare la parte superiore della fetta mandibola (senza il taglio della lingua) a metà strada nella fetta. </li><li> Sbucciare il tessuto in eccesso e rimuoverlo per esporre i fucili mitragliatori sotto. Ci sarà uno su ciascun lato vicino alla base della lingua. </li><li> Usando un paio di pinze a tenere premuto il tessuto con la lingua, usare il forcipe altri a prendere in giro la SMG di distanza dalla lingua. Ripetere l&#39;operazione per la ghiandola altro. </li><li> Raccogliere le ghiandole salivari microdissezione in 3 ml di DMEM/F12 + pen-strep in un nuovo tessuto sterile 35 millimetricultura piatto. Nota: le ghiandole sottomandibolari più grandi (3-5 gemme epiteliali) insieme al più piccolo collegato ghiandola sublinguale (1 auricolari) possono essere coltivate intatto saltando al punto 4 ed eseguito le fasi 4.1, 4.3, e 4.4, come descritto in precedenza 2,8. </li></ol> 2. SMG separazione epiteliale Rudiment <ol><li> Posto 5 (o più) ghiandole salivari in un fondo di vetro, diametro 50 mm micropozzetti piatto (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) contenente 200 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS privo di Ca + + e Mg + +, Life Technologies) contenente 0,4% (v / v) dispasi (Life Technologies, cat. no. 17.105-041) e incubare per 15 min a 37 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, utilizzando una sterile 200 microlitri punta della pipetta, aspirare accuratamente la soluzione dispasi senza disturbare le ghiandole. Immediatamente aggiungere 200 microlitri di DMEM/F12 supporto contenente 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, pre-sterilizzati con un filtro di 0,22 micron) per neutralizzare l&#39;dispasi. </li> &lt;li&gt; Sotto un microscopio da dissezione, usando un paio di pinze con le punte fini (# 5 Dumostar, Strumenti scientifici Arti, 11295-20), separare delicatamente il mesenchima allentato intorno ai germogli SMG epiteliali e condotti, avendo cura di lasciare l&#39;epitelio intatto . </li><li> Pre-wet una sterile 200 ml con puntale DMEM/F12-BSA media e pipettare delicatamente i rudimenti epiteliali in un nuovo piatto di 50 mm di diametro pozzetto contenente 200 ml di DMEM/F12 + pen-streptococco. Utilizzare una punta di alta qualità 200 microlitri pipetta con un bordo liscio. </li><li> Nel piatto che contiene i pezzi mesenchima, scartare qualsiasi non-tessuto mesenchimale comprese le ghiandole sublinguali e le gemme staccate ghiandola sottomandibolare. </li></ol> 3. L&#39;infezione adenovirale di Rudimenti epiteliali <ol><li> Marca 200 pl di supporti infezione virale diluendo l&#39;adenovirus di interesse in DMEM/F12 + pen-strep in una provetta da microcentrifuga modo che il titolo della soluzione risultante è 1x10 8 -10 9 PFUs. Iltitolo ottimale necessaria per diversi virus possono variare. È importante usare cloruro di cesio (CsCl)-preparazioni purificate virali per efficienza assorbimento ottimale. </li><li> Rimuovere il supporto dal piatto contenente i cinque rudimenti epiteliali. Rapidamente aggiungere 200 microlitri di media infezione, mantenendo i rudimenti sempre umida. Prendere le necessarie precauzioni nel maneggiare il virus e lo smaltimento dei puntali contaminati. Disinfettare eventuali virus superfici contaminate con soluzione di candeggina al 10%. </li><li> Spostare i rudimenti epiteliali lontani l&#39;uno dall&#39;altro con una pinza per evitare che si attacchino e consentire loro di depositarsi sul fondo della piastra. Incubare rudimenti in media virali per 1 ora a temperatura ambiente. Durante l&#39;incubazione, separare i rudimenti, se si muovono vicini. Dondolo eccessivo o movimento permetterà le ghiandole ad ammassarsi. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, rimuovere delicatamente le virali contenenti i media ed eliminare in modo appropriato, facendo attenzione a non disturbare il rudiments. Aggiungere 200 ml di DMEM/F12 + pen-streptococco. Ripetere il lavaggio almeno altre due volte e sostituirlo con 200 ml di DMEM/F12 + pen-strep media. I lavaggi sono fondamentali per rimuovere eventuali virus che non è fortemente collegato al epitelio e per prevenire l&#39;infezione del mesenchima. </li><li> Incubare rudimenti epiteliali con 200 ml di DMEM/F12 contenente 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356.231) per 20 min. Troviamo che questo breve incubazione in Matrigel minimizza la regressione di fessure esistenti durante il periodo di coltura iniziale, ma questo passaggio può essere omesso se l&#39;esposizione a Matrigel non è desiderato. </li></ol> 4. Ex vivo di cultura fucili mitragliatori ricombinato <ol><li> Posizionare ogni rudimento, uno alla volta, utilizzando un pre-wet 200 microlitri punta della pipetta, sopra un intaglio (piccolo taglio) 13 mm, 0,1 um Nuclepore Track-Etch membrana filtro (Whatman) galleggianti su 200 microlitri di terreni di coltura ( 5 rudimenti / filtro) in un fondo di vetro per micropiastre. La cultura dei mediaè: DMEM/F12 + pen-strep contenente 50 ug / ml di transferrina e 150 ug / ml di acido ascorbico, come precedentemente descritto 2,8. La transferrina è noto per stimolare la sopravvivenza e la ramificazione morfogenesi delle ghiandole salivari e espianti di organi di altri 9. Aggiunta di acido ascorbico è stato mostrato per stimolare SMG ramificazione. 10 E &#39;noto per agire come cofattore in molte reazioni di idrossilazione di vie metaboliche (come idrossilazione prolina durante la formazione di fibre collagene 11) e stimola anche la produzione di fibronectina e laminina in espianti altri organi 12. </li><li> Rimuovere come media molto sulla parte superiore del filtro possibile dopo l&#39;aggiunta di ogni rudimento epiteliale. Quantità eccessiva di supporti sulla parte superiore del filtro può causare il filtro di affondare, mentre meno dei media, rende il posizionamento dei rudimenti e mesenchima molto più facile. Supporti in eccesso può essere rimosso o con una pipetta o utilizzando pinze per afferrare il materiale tra le punte. </li><li> Luogo pezzi mesenchima derivato from 3-4 ghiandole sulla parte superiore e / o intorno ad ogni rudimento epiteliale. Rimuovere eventuali supporti aggiuntivi che circonda le ghiandole per evitare movimenti del mesenchima lontano dai rudimenti. Mesenchima deriva dal più ghiandole non è utile ma meno può essere dannoso per la crescita epiteliale rudimento. </li><li> Incubare SMGs ricombinati in un incubatore umidificato (95% aria / 5% CO 2) a 37 ° C per 48 -72 ore, come desiderato. </li><li> Acquisire campo chiaro e / o immagini fluorescenti di ghiandole in scena a 0 ore (se lo si desidera), 2 ore dopo la ricombinazione e ogni 24 ore in seguito con microscopio ottico invertito, in posizione verticale, o stereo dotato di una fotocamera digitale con un obiettivo di ingrandimento 4X o 5X per catturare l&#39;intera ghiandola ricombinato in un singolo fotogramma di vista. Immagini della ghiandola salivare mostrano il miglior contrasto utilizzando l&#39;impostazione campo chiaro o l&#39;anello di fase eventualmente montata un certo punto del percorso della luce (che non è possibile a completamente automatizzati microscopi). Contrasto di fase standard non èt necessario poiché la ghiandola è spesso e crea contrasto. </li><li> I desiderati punti temporali, SMGs ricombinati possono essere fissate per 20 minuti con soluzione fissativa realizzati 2% paraformaldeide (PFA) in 1X PBS contenente 5% (w / v) di saccarosio (per preservare meglio la struttura cellulare interna, mantenendo le cellule in uno stato isosmotic). Diversamente 4% PFA, 2% PFA manterrà una quantità significativa del segnale GFP se il fissativo è completamente rimosso dopo fissazione. Le ghiandole possono essere conservati per un massimo di 1 settimana in 1X PBS al buio a 4 ° C fino intera immunocitochimica montaggio e di imaging confocale viene eseguita, come riportato precedentemente 3,6,13-15. Idealmente, immunocitochimica e di imaging deve essere eseguita subito dopo la fissazione per ottenere le migliori immagini. Ghiandole possono anche essere lisate in tampone RIPA per SDS-PAGE seguita da Western blotting. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;ex vivo epitelio-mesenchimale tecnica di ricombinazione è stato pubblicato per la sottomandibolare ghiandole salivari nel 1981 16. In questo protocollo, si ampliano il metodo originale, usando l&#39;infezione adenovirale per manipolare cellule epiteliali espressione genica nel contesto di una ghiandola ricombinato. Abbiamo dimostrato che una percentuale delle cellule epiteliali sono infettati con l&#39;adenovirus, mentre la percentuale di cellule che sono infettate dipende dalle proprietà del p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12 americano senza rosso fenolo </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina e streptomicina </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> Magazzino 10X </td></tr><tr><td> Dispasi </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Congelare aliquote monouso a-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> Frazione V, endotossine basso </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Dovrebbe essere alto titolo (1x10 10 pfu / ml). CsCl virus purificate sono più efficaci di virus purificato su colonna in questo saggio. </td></tr><tr><td> 16% paraformaldeide </td><td&gt; Scienze della microscopia elettronica </td><td> 15710 </td><td> Diluita al 2% in PBS con 5% di saccarosio (w / v) </td></tr><tr><td> 1X tampone fosfato salino (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Preparato da stock 10X </td></tr><tr><td> Sale di Hank soluzione equilibrata </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> no Calcio, Magnesio no, no rosso fenolo </td></tr><tr><td> Transferrina </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml di soluzione in magazzino DMEM/F12 media. Congelare monouso aliquote a-20C </td></tr><tr><td> Acido L-ascorbico (vitamina C) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> 75 mg / ml di soluzione concentrata in DMEM/F12 media.Freeze monouso aliquote a-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Elenco dei reagenti necessari per SMG protocollo ricombinazione. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 piatti centimetri plastica sterili </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Piastre di coltura di tessuti-non-trattata può anche essere usato. </td></tr><tr><td> Stereo microscopio da dissezione con base a luce trasmessa </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Ogni dissezione stereo microscopio può essere utilizzato che ha una base a luce trasmessa. </td></tr><tr><td> 35 millimetri di tessuto di coltura piatti </td><td> Falco </td><td> 353001 </td><td> Piastre di coltura di tessuti-non-trattata può anche essere usato. </td></tr><tr><td> Diametro 50 mm micropozzetti piatti </td><td> MatTek Corporation </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch filtri a membrana </td><td> Whatman </td><td> 110405 </td><td> Diametro di 13 mm, 0,1 millimetri dimensione dei pori </td></tr><tr><td> Widefield microscopio a fluorescenza </td><td> Carl Zeiss, Stati Uniti d&#39;America </td><td> Axio Observer Z1 </td><td> Ogni microscopio a fluorescenza (in posizione verticale, inverted o stereo microscopio da dissezione) può essere utilizzato per monitorare l&#39;espressione della GFP a basso ingrandimento con una fotocamera digitale allegata. </td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Microscopia confocale è necessario vedere le strutture cellulari dettagliate. Qualsiasi microscopio confocale può essere utilizzato. </td></tr><tr><td> Topi di sesso femminile in stato di gravidanza, a tempo-deformazione CD-1 o ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Gli embrioni sono raccolti il ​​giorno 13 (con il giorno della scoperta spina designato come giorno 0). </td></tr><tr><td> Bisturi # 11 </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Manico bisturi # 3 </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinze in lega di acciaio inox, 0,05 millimetri 0,02 millimetri X </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11252-20 </td><td> Ideale per la raccolta di ghiandole da embrioni </td></tr><tr><td&gt; Dumont # 5 forcipe dumostar lega, 0,05 millimetri 0,01 millimetri X </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11295-20 </td><td> Punta fine sono necessari per la rimozione di mesenchima da epitelio. Aghi tungsteno può anche essere usato. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 2. Apparecchiatura utilizzata nelle SMG protocollo di ricombinazione. </td></tr></tbody></table>

modificazione genetica e ricombinazione delle culture organo ghiandola salivare

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morfogenesi avviene durante lo sviluppo di molti organi, e l&#39;embrione ghiandola sottomandibolare mouse (SMG) è un modello classico per lo studio di branching morfogenesi. Nel SMG sviluppo, questo processo comporta fasi iterative di gemma epiteliale e formazione condotto, per dare infine origine a una complessa rete ramificata di acini e condotti, che servono per produrre e modificare / trasportare la saliva, rispettivamente, nella cavità orale 1 - 3. Il epiteliale associata membrana basale e aspetti del compartimento mesenchimale, comprese le cellule mesenchimali, fattori di crescita e la matrice extracellulare, prodotti da queste cellule, sono fondamentali per il meccanismo di ramificazione, anche se come gli eventi cellulari e molecolari sono coordinate rimane poco compresa 4 . Lo studio dei meccanismi molecolari di guida anticipi morfogenesi epiteliali la nostra comprensione dei meccanismi di sviluppo e permette di comprendere meglio possibile rigeapprocci di medicina ative. Tali studi sono stati ostacolati a causa della mancanza di metodi efficaci per la manipolazione genetica dell&#39;epitelio salivare. Attualmente, trasduzione adenovirale rappresenta il metodo più efficace per il targeting cellule epiteliali in ghiandole adulti in vivo 5. Tuttavia, in espianti embrionali, mesenchima denso e la membrana basale che circonda le cellule epiteliali ostacolo all&#39;accesso virale alle cellule epiteliali. Se il mesenchima viene rimosso, l&#39;epitelio possono essere trasfettate con adenovirus, e può riprendere rudimenti epiteliali branching morfogenesi in presenza di Matrigel o laminina-111 6,7. Mesenchima-free crescita epiteliale rudimento richiede anche una ulteriore integrazione con fattori di crescita solubili e non pienamente ricapitolare morfogenesi ramificazione come si verifica in ghiandole intatti 8. Qui si descrive una tecnica che facilita adenovirale trasduzione delle cellule epiteliali e la cultura del e transfettatepithelium con mesenchima associati. Dopo microdissezione dei fucili mitragliatori embrionali, la rimozione del mesenchima, e l&#39;infezione virale dell&#39;epitelio con una GFP contenente adenovirus, si dimostra che l&#39;epitelio ricombina spontaneamente con mesenchima non infetti, ricapitolando intatta la struttura ghiandolare SMG e la ramificazione morfogenesi. La popolazione geneticamente modificato delle cellule epiteliali possono essere facilmente monitorato con metodi standard di microscopia a fluorescenza, fluorescenza se-tagged costrutti adenovirali sono utilizzati. Il metodo di ricombinazione tessuto descritto è attualmente il metodo più efficace ed accessibile per la trasfezione di cellule epiteliali con un vettore wild-type o mutanti all&#39;interno di un costrutto complesso tessuto 3D che non richiede la generazione di animali transgenici.

Il flusso delle fasi principali sperimentali è descritto nella Figura 1. Un esempio di un SMG intatto, un rudimento isolato epiteliale, e il mesenchima corrispondenti sono mostrati nella Figura 2. Immagini brightfield di SMGs ricombinati, che continuano a subire branching morfogenesi quando coltivate ex vivo per i tempi riportati, sono mostrati in Figura 3. Ghiandole ricombinati coltivate per 48 ore esprimere GFP epiteliale sono mostrati in Figura 4.</s...

Una tecnica per manipolare geneticamente le cellule epiteliali in tutta<em&gt; Ex vivo</em&gt; Embrionali di topo in coltura ghiandole sottomandibolari (SMG) con il trasferimento del gene virale è descritto. Questo metodo sfrutta la capacità innata di SMG epitelio e mesenchima di ricombinare spontaneamente dopo la separazione e l&#39;infezione dei rudimenti epiteliali con vettori adenovirali.

Modificazione genetica e ricombinazione delle Culture organo ghiandola salivare

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di alterare l'espressione di una proteina desiderata nell'epitelio del topo, ghiandola salivare embrionale sottomandibolare utilizzando costrutti adenovirali. Ciò si ottiene raccogliendo gli embrioni al giorno 13 dell'embrione e sezionando le ghiandole salivari sottomandibolari. Successivamente, i rudimenti epiteliali vengono separati dal mesenchima circostante e immersi in coltura contenente virus.Il terreno dopo il lavaggio del rudimento viene incubato in matrigel contenente terreno e abbiamo combinato con tre dei mesenchimi per colture ex vivo i cambiamenti nei livelli di proteine bersaglio e il suo effetto sulla morfogenesi ramificata può essere analizzato utilizzando l'immunochimica e la microscopia standard o l'analisi del sangue occidentale. Questa tecnica ci consente di modificare geneticamente un solo compartimento tissutale in un organo complesso e di monitorare i cambiamenti in un intero organo riassemblato explan senza creare un organismo transgenico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che rende possibile l'espressione di una proteina wild type o dominante negativa all'interno del co

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Un protocollo ottimizzato per l'isolamento di cellule staminali dalla ghiandola salivare del mouse è descritto. Il metodo impiega digestione enzimatica e meccanica, e permette l'isolamento di salispheres contenenti cellule con caratteristiche di cellule staminali.

Isolamento di cellule staminali del mouse ghiandole salivari

Un protocollo per l'incannulazione della ghiandola salivare sottomandibolare del mouse tramite il dotto di Wharton è descritto. Per questo esperimento, la soluzione trypan blu è usato come un tintore per dimostrare quanto questa tecnica offre efficacemente infusi nella ghiandola mirati, e di suggerire l'affidabilità di questo nuovo approccio clinico come un potenziale farmaco / terapia cellulare per la rigenerazione delle ghiandole salivari.

Incannulazione della ghiandola salivare sottomandibolare del mouse tramite il Duct Wharton

Questo video presenta il protocollo per la coltura delle salisfere, gli sferoidi tridimensionali derivati dalle ghiandole salivari. Le salisfere possono essere ulteriormente utilizzate per valutare l'impatto del cancro della testa e del collo sulla produzione di saliva dalle ghiandole salivari dei pazienti umani affetti.

Coltura di salisfere dal tessuto delle ghiandole salivari: un metodo per sviluppare salisfere da cellule epiteliali derivate dalle ghiandole salivari umane

Ipofunzione delle ghiandole salivari, un importante effetto avverso della radioterapia della testa e del collo diminuisce la qualità della vita di un paziente. La dimostrazione dell'efficacia di nuove terapie in modelli animali è un prerequisito prima della transizione clinica. Questo protocollo descrive la somministrazione retroduttale e l'irradiazione locale delle ghiandole sottomandibolari di ratto.

Retroductal ghiandola sottomandibolare instillazione e localizzati frazionato irradiazione in un modello murino di salivare Ipofunzione

Vi presentiamo un approccio dettagliato dell'esecuzione di raccolta della saliva, compreso il tracheostomy murino ed all'isolamento di tre ghiandole salivari maggiori.

Valutazione funzionale salivare murina attraverso dopo stimolazione Pilocarpina frazionato radiazione

L'uso di colture organotipiche tridimensionali per visualizzare la morfologia e i marcatori funzionali delle ghiandole salivari può fornire nuove intuizioni sui meccanismi del danno tissutale dopo la radiazione. Qui di seguito è riportato un protocollo per sezioni, colture, irraggiamento, macchia e immagini di 50 – 90 μm di spessore di sezione della ghiandola salivare prima e dopo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti.

Trattamento radiante delle colture organotipiche da ghiandole salivari Sottomandibulari e parotidi modelli chiave in vivo caratteristiche

Presentiamo un metodo per isolare e coltivare cellule epiteliali derivate dalla ghiandola umana primaria. Queste cellule presentano modelli di espressione genica coerenti con loro di origine epiteliale salivari e possono essere coltivate come salisfere su matrici di membrana seminterrato derivate da cellule tumorali Engelbreth-Holm-Swarm o come monostrati su piatti di coltura trattati.

Isolamento delle cellule epiteliali salivari dalle ghiandole salivari umane per la crescita in vitro come Salispheres o Monostrati

Le ghiandole salivari sono state proposte come sito bersaglio tissutale per la terapia genica, specialmente nell'area della vaccinazione mediante trasferimento genico. Dimostriamo la consegna genica in un modello di primate non umano utilizzando l'infusione retrograda di parotidi.

Infusione retrograda della ghiandola parotide attraverso il dotto di Stensen in un primate non umano per la consegna di geni vettoriali

L'imaging immunofluorescente è limitato dalla capacità di osservare processi biologici complessi e dipendenti dal tempo in una singola istantanea nel tempo. Questo studio delinea un approccio di imaging dal vivo condotto su fette di ghiandola sottomandibolare di topo tagliate con precisione. Questo approccio consente l'osservazione in tempo reale delle interazioni cellula-cellula durante l'omeostasi e i processi di rigenerazione e riparazione.

Interrogazione delle interazioni cellula-cellula nella ghiandola salivare tramite imaging di cellule vive ex vivo

Il midgut zanzara e delle ghiandole salivari sono di entrata e di uscita principali per il vettore di agenti patogeni come il Plasmodium falciparum ed il virus dengue. Questo video mostra le tecniche di dissezione per la rimozione delle ghiandole salivari e midgut da zanzare Aedes aegypti.

Dissezione delle ghiandole salivari e midgut da Ae. aegypti zanzare

Scopri la manipolazione genetica delle cellule epiteliali nelle ghiandole salivari submandibolari embrionali di topo mediante trasferimento genico virale. Questo metodo consente di studiare la morfogenesi ramificata senza creare organismi transgenici.

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