Name: Applicazione clinica della Bella Addormentata Artificiale e cellule presentanti lantigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Scopri come modificare geneticamente le cellule T con il sistema Sleeping Beauty per esprimere recettori CAR antitumorali. Questo metodo utilizza cellule presentanti l'antigene artificiali per propagare numeri clinicamente significativi di cellule T CAR-positive per l'immunoterapia adottiva contro le neoplasie a cellule B.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Carl giugno (Università della Pennsylvania) per aiuto produzione, fornitura clone AAPC # 4 e il dottor Perry Hackett (University of Minnesota) per ottenere assistenza con il sistema SB. Concessione del sostegno: Cancer Center nucleo Grant (CA16672), RO1 (CA124782, CA120956, CA141303), R33 (CA116127), P01 (CA148600), SPORE (CA136411); Albert J Ward Fondazione; Burroughs Wellcome Fondo; Gillson Longenbaugh Foundation; la prevenzione del cancro e Research Institute del Texas; CLL Global Research Foundation, Dipartimento della Difesa, Tenuta di Noelan L. Bibler; Harry T. Mangurian, Jr., Fondo per l&#39;immunoterapia leucemia, Institute of Cancer Therapy personalizzati, Leukemia and Lymphoma Society, Research Foundation linfoma; MDACC sorella di istituzione della rete Fondo; Miller Foundation, Mr. Herb Simons, il signor e la signora Joe H. Scales, il signor Thomas Scott, Fondazione Nazionale per la Ricerca sul Cancro; Pediatric Cancer Research Foundation; assistenza ed Produzionee per le terapie cellulari (PACT), William Lawrence e Fondazione Blanche Hughes bambini.

<html> Giorno 0 o Prima 1. Isolamento di cellule mononucleate (MNC) da PB e UCB <ol><li> Diluire PB con un volume uguale, e UCB con quattro volumi di PBS-EDTA. </li><li> Lentamente sangue strato diluito (25 ml) sul Ficoll (12 ml) in una provetta da centrifuga da 50 ml (s) e centrifugare a 400 xg per 30 - 40 min (frenatura). </li><li> Raccogliere e trasferire la frazione di cellule mononucleate (interfaccia) con una pipetta di trasferimento in una nuova centrifuga tubo da 50 ml. </li><li> Portare il volume a 50 ml con PBS-EDTA e centrifugare a 450 xg per 10 min. </li><li> Aspirare il surnatante, risospendere delicatamente il pellet (s) in 50 ml di mezzo di coltura completo (CCM), e centrifugare a 400 xg per 10 min. </li><li> Risospendere delicatamente e la piscina il pellet di cellule in CCM ed eseguire una conta delle cellule con il metodo di esclusione blu Trypan (Cellometer, programma PBMC). </li><li> MNC può ora essere utilizzato per elettroporazione (Nucleofection) o crioconservati per un uso futuro. </li></ol>titolo &quot;&gt; 2. Preparazione di cellule T per elettroporazione al giorno 0 <ol><li> Se si utilizza crioconservato MNC, scongelare rapidamente le cellule sufficienti per una elettroporazione fondo scala (2 x 10 8 aggiunta di ~ 20% per tenere conto di perdita di cellule durante la centrifugazione e 2 ore di incubazione) a 37 ° C bagnomaria. Se si utilizzano appena isolati MNC passare al punto 2.3. </li><li> Risospendere delicatamente e trasferire le cellule a un tubo da centrifuga di dimensioni adeguate (s) contenuta preriscaldata Complete Fenolo-Free coltura RPMI supporti (PF-RPMI) e centrifugare a 200 xg per 10 min (senza freno), sovranatante aspirato. </li><li> Risospendere il MNC in RPMI-PF, eseguire una conta cellulare (Cellometer) e trasferire le cellule a un recipiente di dimensioni adeguate coltura cellulare (s) ad una concentrazione di 10 6 cellule / ml. </li><li> Incubare in un umidificata 37 ° C / 5% CO 2 incubatore per 2 h ± 30 min. </li><li> Trasferire il MNC per provetta da centrifuga sterile (s), rotazione a 200 xg per 5 min (senza freni), aspirare il supernatante e delicatamente re-sospendere e combinare il pellet cellulare (s) in RPMI-PF. </li><li> Eseguire una conta cellulare (Cellometer) e calcolare il volume della sospensione cellulare richiesta (2 x 10 8 MNC). </li><li> Trasferire il volume calcolato per un tubo da 50 ml sterile da centrifuga e centrifugare a 200 xg per 10 min (senza freno). </li><li> Aspirare il supernatante in modo che nessun media residua e delicatamente risospendere toccando lato del tubo. </li></ol> 3. Elettroporazione (Nucleofection) di MNC (Process Scala con 10 cuvette) il giorno 0 <ol><li> Pre-incubare a 12 sterile piastra con 10 pozzetti contenenti 4 ml di RPMI caldo PF-in un umidificata 37 ° C / 5% CO 2 incubatore. </li><li> Preparare e pre-riscaldare la soluzione Lonza Nucleofector umano T Kit cella (ricostituito secondo le istruzioni del produttore, <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) a temperatura ambiente in un cabinet sicurezza biologica (BSC). </li><li> Preparare la soluzione Nucleofector / master mix DNA adding 100 pl di soluzione integrata Nucleofector, 15 pg di trasposoni (DNA plasmidico superavvolto designato come CD19RCD28/pSBSO) e 5 pg di transposasi (DNA plasmidico superavvolto designato come pCMV-SB11) per reazione / cuvetta. </li><li> Disperdere il pellet di cellule (dal punto 2.8) battendo leggermente il lato della provetta da centrifuga e risospendere in Nucleofection soluzione / master mix di DNA (concentrazione finale cella: 2 x 10 7 cells/100 pl). </li><li> Cautela trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare (dal punto 3.4) a ciascuno dei dieci (10) Cuvette Nucleofection Lonza, facendo attenzione a evitare bolle. </li><li> Toccare la cuvetta una volta, e electroporate utilizzando il programma U-014 (per non stimolate le cellule T). </li><li> Trasferire le cuvette e dei 12 pozzetti (Fase 3.1) al BSC. </li><li> Raccogliere le cellule elettroporate da ciascuna cuvetta con una multa Amaxa pipetta punta, aggiungendo ~ 500 microlitri della pre-riscaldato terreno di coltura dal pozzetto corrispondente (12-pozzetti preparata in Step 3.1) e restituire la piastra ad un umidificata 37 ° C / 5% CO 2 incubatore per 2 h ± 30 min. </li><li> Seguendo il 2-h di incubazione, raccolto e trasferire le cellule da tutti i pozzetti in una provetta da centrifuga sterile. </li><li> Lavare le cellule per centrifugazione a 140 xg per 8 min, temperatura ambiente, senza freno e aspirare ed eliminare il surnatante in modo che nessun residuo medio copre il pellet. </li><li> Disperdere il pellet cellulare delicatamente la parte della provetta da centrifuga e delicatamente risospendere in CCM per ottenere una sospensione di cellule singole. </li><li> Effettuare conteggio delle cellule e regolare la concentrazione cellulare a 10 6 cellule / ml in CCM. </li><li> Trasferimento sospensione cellulare al pallone di coltura cellulare (s) e posto in incubatrice durante la notte. </li><li> Fasi di processo 2,1-3,8 sono state ripetute per controllo: EGFP cellule trasfettate (5 x 10 6 cellule / cuvetta con 5 pg Amaxa controllo EGFP plasmide superavvolto, pmaxGFP). </li></ol> 1 ° giorno del 1 ° e successiviStimolazione Cicli 4. Analisi di espressione CAR mediante citometria di flusso al giorno 1 <ol><li> Raccogliere le cellule elettroporate ed eseguire una conta di cellule utilizzando Trypan metodo di esclusione blu (emocitometro). </li><li> Colorazione (da 1 a 2 x 10 6) con anticorpi specifici per CD3, CD4, CD8, e umana IgG Fcy (come misura di espressione CAR). </li><li> Acquisire celle FACS Calibur e analizzare i dati utilizzando FCS software Express per calcolare espressione di CAR. <ol><li> Calcola le cellule + AUTO in coltura con la formula: (Numero di cellule vitali totali) x (AUTO% + cellule) = N. di CAR + cellule </li></ol></li></ol> 5. Preparazione di AAPC (clone # 4) al giorno 1. AAPC (clone # 4) sono stati derivati ​​da cellule K562 (linea parentale Ottenuto da American Type Culture Collection) di Co-express Desiderato cellule T Co-stimolatorio Molecule <ol><li> Scongelare una aliquota di congelati 100 AAPC Gy irradiato a 37 °, C acqua del bagno. </li><li> Le cellule vengono lavate due volte mediante centrifugazione a 400 xg, 10 min in CCM e contati utilizzando Cellometer (esclusione Trypan blu). </li><li> Calcolare il numero di AAPC vitali necessari per la stimolazione: (Numero di auto + cellule) x 2 = Numero di AAPC irradiato richiesta </li></ol> 6. AAPC-mediata stimolazione del CAR + cellule T al Day 1 Inizio del 1 ° e successivi cicli di stimolazione <ol><li> Mescolare le cellule esprimono elettroporate (CAR) e γ-irradiati AAPC (clone # 4) in un contenitore sterile con un rapporto di 1:2 (CAR + cella: vitale AAPC) in CCM. <ol><li> Si noti il rapporto AAPC è regolato per l&#39;espressione di CAR base citofluorimetria il giorno dopo l&#39;elettroporazione. </li></ol></li><li> Aggiungi IL-21 (30 ng / ml) alla sospensione cellulare. </li><li> Aliquotare in T-75 cm 2 pallone (s) e / o borse Vue Vita coltura ad una concentrazione di 10 6 cellule / ml e tornare alla incubato. </li></ol> Giorni 3, 5 7. Cultura Continua CAR + cellule T <ol><li> Eseguire un mezzo-media cambiamento, ricostituire IL-21, e mantenere le cellule T ad una concentrazione di 10 6 cellule / ml. </li></ol> 7 ° giorno 8. Fine del primo AAPC-mediata ciclo di stimolazione <ol><li> Cellule Harvest, contare e colorare per CD3, CD4, CD8, e Fcy (CAR) e passare al punto 10.1. </li></ol> 9. L&#39;esaurimento delle cellule CD56 + (di solito tra 7 e 14 giorni dopo l&#39;elettroporazione) <ol><li> Eseguire un CD56 esaurimento utilizzando perline paramagnetiche se CD56 + CD3 linfociti neg ≥ 10%. </li></ol> Cicli di stimolazione # 2, # 3, # 4 e corrispondenti a Giorni 8 → 14, giorno 15 → 21, e giorni 22 → 28 10. L&#39;aggiunta ricorsiva di AAPC propagazione delle cellule T con i numeri clinicamente sufficienti <ol><li> Ripetere la stimulatioprocesso n (4 volte), come descritto nelle fasi 4,3-8,1. </li><li> Aggiungi IL-2 (50U/ml) alle culture che iniziano nei giorni 7, 14 e 21, e quindi ad ogni cambio dei media (tre volte alla settimana, su un Lunedi-Mercoledì-Venerdì orario). </li><li> Crioconservare (archivio), le cellule T in eccesso, se necessario. <ol><li> Le cellule T congelate utilizzando congelatore Pilotato dalla frequenza. </li></ol></li></ol> Giorno 28 11. Fine Ultimo AAPC-mediata del ciclo di stimolazione: cellule T Harvest <ol><li> Crioconservare le cellule T per il test di rilascio e infusione. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Trasposone e sistemi trasposasi, come da piggyBac 12,19 e 18,20-22 SB, sono non-virali approcci alla terapia genica che sono un&#39;alternativa al virale mediata trasduzione di grado clinico CAR + cellule T. La SB è stato scelto come il sistema di trasferimento genico basato sul suo potenziale per la terapia genica umana 1,6,23. Abbiamo sviluppato le tecnologie duali di trasposizione SB (introdurre un CAR) e aggiunta ricorsiva di γ-irradiati AAPC (per recuperare geneticamente modificati cellule T che esprimono stabilmente un CAR) per servire come tecnologie di piattaforma per la fabbricazione di TAA-specifiche cellule T in conformità con cGMP per la fase I / II (Figura 4). Dopo 28 giorni (quattro-sette giorni cicli di stimolazione) di co-coltura su γ-irradiati AAPC, ci sono tipicamente in grado di generare almeno ~ 10 10 cellule geneticamente modificate T adatto per applicazioni umane. Se necessario, ulteriori cicli di stimolazione può essere intrapresa to generare un maggior numero di cellule T geneticamente modificate. Inoltre, se meno CAR + cellule T sono necessari, l&#39;approccio alla elettroporazione e propagazione può essere ridotto impiegando meno cuvette e riporto solo un sottoinsieme delle cellule T espanse numericamente per successivi cicli di proliferazione AAPC all&#39;inizio di ciascun Stimolazione ciclo. La maggior parte dei elettroporate e propagato cellule T raccolte per infusione esprimono stabilmente il CAR. La conseguenza di CD4 + e CD8 + cellule T che esprimono il nostro 2 AUTO di seconda generazione includono cellule con una memoria / ingenuo fenotipo e presentano tre caratteristiche di ri-diretto specificità. In primo luogo, le cellule T geneticamente modificate appositamente lisare CD19 + obiettivi, in secondo luogo, produrre IFN-γ in risposta a CD19 + cellule stimolatrici e in terzo luogo, proliferano in risposta a CD19 + cellule di alimentazione, il tutto in un CAR-dipendente 13,18. Il nostro approccio alla integrmangiato un transgene CAR per elettro-trasferimento non virali plasmidi di DNA dal sistema SB può essere intrapresa in cellule T quiescenti primarie derivate da PB e UCB. Noi e altri hanno modificato geneticamente cellule K562 per servire come AAPC per diffondere in modo efficiente i numeri clinicamente sufficiente di cellule T per infusione 24,25. Il AAPC e cultura ambiente tissutale (ad esempio l&#39;aggiunta di IL-21) sono stati sono stati modificati per generare paziente e donatore-CD19-derivato cellule T specifiche per infusione dopo cellule staminali ematopoietiche trapianto (Tabella 1) 13,18. Possiamo produrre CAR + cellule T dei PB semplicemente prelevati da una vena che evita il costo, il disagio, e l&#39;inconveniente di ottenere MNC da PB mediante aferesi. La possibilità di ricavare un gran numero di CAR + cellule T di un numero limitato di MNC è particolarmente interessante per l&#39;infusione delle cellule T dopo trapianto allogenico UCB. Le piccole dimensioni e l&#39;anonimato del donatore neonatale osta re-Accesso a questa persona in un punto secondo momento e solo un numero limitato di MNC raccolte sono disponibili come materiale di partenza per la produzione delle cellule T per evitare interferenze con ematopoiesi. Ulteriori progressi del processo di fabbricazione sono in corso di includere un dispositivo ad alta velocità elettroporazione accoppiato con un bioreattore WAVE completamente chiusa per ridurre al minimo la movimentazione. In totale, la SB e AAPC si appellano piattaforme per generare CD19-specifica CAR + cellule T che possono essere adattati per generare un gran numero di cellule T geneticamente modificate in grado di riconoscere alternative superficie cellulare TAA in conformità alle cGMP.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenti </td><td> Venditore </td><td> Numero di catalogo </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti </td></tr><tr><td> DNA che esprimono GFP plasmide (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 (kit) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> Fenolo gratuita RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone siero fetale bovino </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Umana ricombinante IL-21 </td><td> Peprotech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> Umana ricombinante IL-2 (Proleukin) </td><td> Novartis </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> Umano delle cellule T Kit (Soluzione Nucleofector) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS CD56 Reagente </td><td> Miltenyi </td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-coniugato con il mouse mAb specifiche per l&#39;uomo CD3 </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> APC-topo coniugato a mAb specifici per CD4 umano </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-coniugatoal mouse mAb CD8 specifiche per l&#39;uomo </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> PE-coniugato a F (ab &#39;) 2 di capra frammento di anticorpo specifico per Fcy umana </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio azide </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Monouso </td></tr><tr><td> 12-pozzetti </td><td> Corning </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75 cm 2 matraccio </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Cultura borse </td><td> Vue Vita </td><td> 290C, 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml centrifuga tubo </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><strong&gt; Attrezzatura </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Bioscience Nexcelom </td><td> Vision Cellometer </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall Legenda RT Centrifuga </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Tasso congelatore controllata </td><td> Pialla </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Irradiator </td><td> CIS bio internazionale </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> L&#39;espressione di molecole (endogena e Introdotto) </td></tr><tr><td> Linea cellulare </td> &lt;td&gt; Nome comune </td><td> Tipo di cella </td><td> Molecole espresse </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> Clone 4 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP co-espresso con membrana legato IL-15 </td></tr></tbody></table> Terreni di coltura completi (CCM) (conservati a 4 ° C per un massimo di 30 giorni) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 10% FBS 1% glutamax Flusso Buffer Citometria (conservati a 4 ° C per un massimo di 30 giorni) PBS 2% FBS 0,1% sodio azide </td></tr></tbody></table>

applicazione clinica della<em&gt; bella addormentata</em&gt; artificiale e cellule presentanti l&#39;antigene per modificare geneticamente le cellule t da sangue del cordone ombelicale e periferico

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

La potenza della clinica-grade cellule T può essere migliorata combinando la terapia genica con immunoterapia per ingegnerizzare un prodotto biologico con il potenziale per superiore (i) riconoscimento di antigeni tumore-associati (TAA), (ii) dopo infusione persistenza, (iii) possibilità di migrazione ai siti tumorali, e (iv) capacità di riciclare le funzioni effettrici nel microambiente tumorale. Maggior approcci alla manipolazione genetica di cellule T ingegnerizzate all&#39;applicazione umana hanno usato retrovirus e lentivirus per l&#39;espressione stabile di CAR 1-3. Questo approccio, anche se compatibile con le attuali buone prassi di fabbricazione (GMP), può essere costoso in quanto si basa sulla produzione e il rilascio di clinica-grade virus ricombinante da un numero limitato di impianti di produzione. L&#39;elettro-trasferimento di plasmidi virali è un&#39;alternativa interessante per trasduzione poiché specie di DNA possono essere prodotti a grado clinico a circa 1/10 di costo di recombinant GMP-grade virus. Per migliorare l&#39;efficienza di integrazione abbiamo adattato Sleeping Beauty (SB) trasposone e trasposasi per l&#39;uomo 4-8 applicazioni. Il nostro sistema SB utilizza due plasmidi che consistono di un trasposone codificante per un gene di interesse (ad esempio, 2 nd generazione CD19-specifico transgene CAR, designato CD19RCD28) e una trasposasi (es. SB11) che inserisce il transgene nel dinucleotide TA ripete 9-11 . Per generare numeri clinicamente sufficiente di cellule T geneticamente modificate usiamo K562 cellule derivate artificiali presentanti antigene (AAPC) (clone # 4) modificate per esprimere una TAA (es. CD19) nonché le cellule T molecole costimolatorie CD86, CD137L, un legato alla membrana versione di interleuchina (IL) -15 (peptide fuso modified IgG4 regione Fc) e CD64 (recettore Fc γ-1) per il caricamento di anticorpi monoclonali (mAb) 12. In questo rapporto, dimostriamo le procedure che possono essere intraprese in compliance con cGMP per generare CD19-specifica CAR + cellule T adatto per l&#39;applicazione sull&#39;uomo. Questo è stato ottenuto il sincrono elettro-trasferimento di due plasmidi, un trasposone SB (CD19RCD28) e una trasposasi SB (SB11) seguite da recupero di integranti stabili dai ogni-7-giorni aggiunte (ciclo di stimolazione) di γ-irradiati AAPC (clone # 4) in presenza di solubile IL-2 ricombinante umana e IL-21 13. Tipicamente 4 cicli (28 giorni di coltura continua) sono impegnati a generare numeri clinicamente interessanti di cellule T che esprimono stabilmente il CAR. Questa metodologia di produzione clinico-grado CD19-specifiche cellule T possono essere applicati a cellule T derivate da sangue periferico (PB) o sangue del cordone ombelicale (UCB). Inoltre, questo approccio può essere sfruttata per generare cellule T per diversi tipi di tumore con l&#39;associazione la specificità del CAR introdotto con l&#39;espressione del TAA, riconosciuto dal CAR, sulla AAPC.

Si segnala che elettro-trasferimento di plasmidi di DNA e propagazione di cellule T su γ-irradiati AAPC può essere utilizzato per generare numeri clinicamente interessanti di cellule T derivate da PB e UCB per applicazioni umane. Queste cellule geneticamente modificate T esprimere un CAR introdotto che riconosce il TAA CD19, indipendente complesso maggiore di istocompatibilità. L&#39;SB-derivati ​​plasmidi DNA per esprimere il (i) trasposone, un CAR generazione 2 ° (CD19RCD28) che i segnali attraverso CD28 e CD3-ε 14, e (ii) trasposasi, SB11 15, sono stati descritti in precedenza 13, 16,17 . I plasmidi utilizzati in questo studio sono stati prodotti commercialmente da Fondo Biomanufacturing Waisman Clinica (Madison, WI). Il AAPC (clone # 4), derivato da cellule K562 (linea parentale ottenuto da American Type Culture Collection), co-esprimono desiderato cellule T molecole co-stimolatorie (ogni molecola introdotta 3 90% sulla superficie cellulare di AAPC),come precedentemente descritto 12. Qui mostriamo che CD19-specifiche cellule T possono essere generati da cellule mononucleate (MNC) derivati ​​da PB o UCB utilizzando trasposizione SB per introdurre il CAR seguita da aggiunta di AAPC numericamente per espandere le cellule T in un modo dipendente CAR (figure 1 , 4) 13,18. Dieci cuvette (2x10 7 MNC / cuvetta) sono elettroporata per ciascun destinatario usando 15 pg di DNA plasmidico (CD19RCD28/pSBSO) codificante per trasposoni (CAR) e 5 mg di DNA plasmidico (pCMV-SB11) codificante per transposasi (SB11). Il numero di cuvette può essere ridotto se MNC stanno limitando o ridimensionato per il lavoro di laboratorio. Il giorno di elettroporazione è definito come &quot;0 Day&quot; del ciclo di stimolazione # 1. Come controlli per citometria di flusso e condizioni di coltura, cellule T autologhe sono finto elettroporata (senza DNA plasmidico) e numericamente esteso su γ-irradiati AAPC (clone # 4) che erano stati pre-caricato con OKT3 per reticolare CD3 per sostenere cellule T proliferazione. We routinely valutare l&#39;efficienza di electrotransfer e la vitalità delle cellule T il giorno dopo l&#39;elettroporazione (Figura 2B). L&#39;espressione di EGFP dal DNA plasmide di controllo (designato pmaxGFP) e CAR, a questo punto tempo iniziale riflette l&#39;espressione della proteina dal plasmide integrato e episomale. In genere, il giorno dopo l&#39;elettroporazione si misura l&#39;espressione EGFP a ~ espressione 60% ​​e CAR al ~ 40% (Figura 2A) con la vitalità delle cellule T tra il 40-50%. Aggiunte ricorsive di γ-irradiati AAPC in presenza di solubile IL-2 ricombinante umana e IL-21 recuperare le cellule T che esprimono stabilmente CAR (CD19RCD28). CD3 neg CD56 + cellule NK sono esaurite dalla coltura mediante CD56-specifici perline paramagnetiche se la percentuale di queste cellule NK è ≥ 10% e soprattutto se la percentuale di CAR espresso sulle cellule T è bassa. Questo impedisce l&#39;esaurimento rapida crescita eccessiva di cellule NK che interferisce con la capacità di sostenere il AAPC proliferation di CAR + cellule T. In occasione, deplezione delle cellule NK da auto + cellule T è effettuato nel corso degli ultimi due cicli di stimolazione, ma questo introduce una perdita di cellule desiderate a causa di co-espressione di CD56 su alcuni CAR + cellule T. Le cellule T sono state coltivate in un sistema funzionalmente chiuso con Vue borse cultura della vita passata Giorno 14. Un sottoinsieme delle cellule geneticamente modificate e propagato T sono in genere crioconservati al giorno 14 o il giorno 21 (fine dei cicli di stimolazione # 2 o # 3) di co-coltura su AAPC per servire come fonte di materiale d&#39;archivio per future analisi e di essere scongelati in caso di problemi imprevisti in seguito si verificano durante il processo di fabbricazione. Le cellule T sono in genere raccolti il o intorno al giorno 28 di cultura (Figura 3) che normalmente esprimono AUTO&gt; 90% e sono&gt; 80% vitali (Figura 2C, D). Abbiamo precedentemente dimostrato che, dopo quattro settimane di co-coltura in AAPC media piega-espansione delle cellule T CD3 + è 19.800 ± 11.313 con CA<html> R espressione + essendo il 90% ± 7.5 13. Queste cellule T vengono crioconservati e sottoposti in-process e il rilascio di prodotti che informa sulla sicurezza e l&#39;efficacia terapeutica del prodotto finito. Test di rilascio è effettuato in conformità alle modifiche Clinical Laboratory Improvement (CLIA) per generare un certificato di analisi prima dell&#39;infusione in riceventi sulle sperimentazioni cliniche. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> Figura 1. Passaggi che delineano il processo di electroporate e propagare CAR + cellule T da PB e UCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Caratterizzazione delle cellule T geneticamente modificate da PB. (A) Espressione di EGFP al giorno 0 del ciclo di stimolazione primi a valutare l&#39;efficienza di trasferimento genico. L&#39;espressione di CD19-specifica CAR (CD19RCD28) valutata mediante citometria a flusso su CD3 +, CD8 + e cellule T CD4 + a (B) circa 24 ore dopo l&#39;elettroporazione e (C) 28 giorni dopo la co-coltura su AAPC. Espressione simile di CAR è stato osservato con UCB cellule derivate T. (D) Cinetica di espressione CAR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> Figura 3. Propagazione della PB-derivato CAR+ T cellule. Tasso di espansione numerica di CD3 + e + CAR cellule T derivate da PB da ripetute co-coltura su γ-irradiati AAPC in presenza di ricombinante umano solubile IL-2 e IL-21. Le frecce verso l&#39;alto indicano le aggiunte di γ-irradiati AAPC che segnano l&#39;inizio di ogni ciclo di stimolazione. UCB di derivazione CAR + cellule T mostrano tassi simili di espansione numerica. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> Figura 4. Schema del processo di fabbricazione con SB e sistemi AAPC di modificare geneticamente e propagare CAR + cellule T derivate da PB e UCB. CD19-specifica CAR + cellule T sono state generate da elettro-trasferimento di SB-derivati ​​plasmidi DNA superavvolto e successive co-coltura il K562-derived AAPC (clone # 4) in presenza of IL-2 ricombinante umana solubile e IL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> Cella sorgente T </td><td width="9"> Trasposone * </td><td width="9"> Trasposasi </td><td width="26"> Cellule T infusione </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> IND # </td></tr><tr><td> Autologo (paziente-derivato) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Dopo il trapianto autologo di cellule staminali ematopoietiche trapianto </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td> Allogenico (donatore-derivati) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Dopo il trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche trapianto </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><td&gt; 14577 </td></tr><tr><td> Allogenico (donatore-derivati) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Dopo il trapianto allogenico di sangue del cordone ombelicale </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> * Tabella 1. Gli studi clinici sotto l&#39;egida della FDA a MDACC di infondere CD19-cellule T specifiche CAR + propagate su AAPC. Le cellule T sono resi specifici per CD19 attraverso l&#39;espressione forzata di SB trasposone che codifica per una CAR 2 ° generazione, CD19RCD28 designato, che i segnali attraverso il CD28 e CD3-ε. ** Prova descritto in riferimento 5.

Cellule T CD19-che esprimono un recettore chimerico specifico antigene (CAR) sono infusi come trattamento sperimentale di tumori maligni delle cellule B nelle nostre prove gene first-in-umani terapia. Descriviamo modificazione genetica delle cellule T con il<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; (SB) sistema per introdurre CD19-specifica CAR e la propagazione selettiva su cellule antigene CD19 Designer + artificiali che presentano.

Applicazione clinica della<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Artificiale e cellule presentanti l&#39;antigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Questo protocollo modifica geneticamente le cellule T per introdurre recettori chimerici dell'antigene specifici per gli antigeni tumorali e quindi propaga numeri clinicamente significativi sulle cellule presentanti l'antigene artificiale. Inizia con il trasferimento elettrico della bella addormentata. Trasporre e trasporre plasmidi di DNA A in cellule mononucleate quiescenti isolate dal sangue periferico o del cordone ombelicale.Quindi misurare l'efficienza della trasfezione utilizzando la citometria a flusso. Successivamente, le cellule T trasfettate per sette giorni su cellule presentanti antigeni artificiali derivate da K 5 62 con l'aggiunta di citochine esogene in una stimolazione di quattro settimane. I cicli di proliferazione procedono per analizzare, crioconservare e rilasciare le cellule T car positive elettroporate e propagate per l'applicazione umana.Il sistema trasposivo su trasposo della bella addormentata offre un'alternativa agli approcci di trasferimento genico basati su virus per introdurre stabilmente un gene nella cellula di scelta. Uno dei principali vantaggi del sistema della bella addormentata è che si possono integrare i geni a un costo davvero ridotto rispetto ai plasmidi del DNA che si integrano attraverso la ricombinazione illegittima non omologa. Pertanto, il vantaggio è che il sistema della bella addormentata può essere utilizzato per esprimere un gene a basso costo e ad alta efficienza.In generale, gli individui nuovi a questo metodo dovranno inizialmente superare l'efficienza delle cellule T elettro nella propagazione selettiva di cellule T car positive su cellule presentanti antigeni artificiali. Entrambi i passaggi sono difficili da padroneggiare a causa della necessità di co-cultura. Cellule T geneticamente modificate su cellule presentanti antigeni artificiali.Questo metodo è utile nel campo dell'immunoterapia adottiva, in particolare nella somministrazione genica efficace e nella produzione di un numero clinicamente significativo di cellule T. L'applicazione più ampia si estende alla terapia del cancro perché le cellule T del sistema immunitario possono essere modificate per essere specifiche per il tumore. A dimostrare la procedura saranno Margaret Dawson e Matthew Fiola.Tecnici del mio laboratorio Per prima cosa diluire il sangue periferico con un volume uguale di P-B-S-E-D-T-A e il sangue del cordone ombelicale con quattro volumi di P-B-S-E-D-T-A sovrapporre lentamente 25 millilitri di sangue diluito su 12 millilitri di fial in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare la sfumatura di fiale a 400 g per 30-40 minuti senza interruzioni. Trasferire ora la frazione di cellule mononucleate in una provetta da centrifuga fresca da 50 millilitri con P-B-S-E-D-T-A.Portare il volume a 50 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Lavare delicatamente le cellule una volta ogni 50 millilitri di coltura completa, terreni e centrifugare a 400 G per 10 minuti. Quindi raggruppare i pellet cellulari in CCM, eseguire un conteggio delle cellule.Utilizzando il metodo di esclusione triam blue. Le celle mononucleate possono ora essere utilizzate per l'elettroporazione o crioconservate per un uso futuro. Se si utilizza la MNC crioconservata, scongelare rapidamente due volte 10 all'ottava cella per un'elettroporazione su larga scala, trasferire delicatamente le cellule in una provetta da centrifuga di dimensioni adeguate contenente preriscaldamento.Completare i terreni di coltura RPMI privi di fenolo e pellettare le cellule mediante centrifugazione, risospendere le cellule mononucleate In P-F-R-P-M-I, eseguire una conta cellulare e trasferire le cellule in un recipiente di coltura cellulare di dimensioni adeguate a una concentrazione di 10 delle sei cellule per millilitro. Equilibrare le cellule in un incubatore umidificato per due ore. Raccogliere la MNC mediante centrifugazione, quindi risospendere delicatamente e combinare i pellet cellulari in P-F-R-P-M-I ed enumerare le cellule Ora trasferire due volte 10 all'ottava MNC in una provetta da centrifuga sterile da 50 millilitri e centrifugare a 200 Gs per 10 minuti senza interruzioni.Aspirare il surnatante in modo che non rimangano residui di terreno intorno al pellet cellulare. Preparare una piastra sterile a 12 pozzetti con 10 pozzetti contenenti quattro millilitri di P-F-R-P-M-I caldo ed equilibrare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Quindi ricostituire la soluzione effettrice Lonzo Nucleo dal kit di cellule T umane secondo le istruzioni del produttore per ogni reazione.Q Vet preparare 100 microlitri di DNA master mix contenente la soluzione di effettore nucleare NU integrata. 15 microgrammi del plasmide trasposto e cinque microgrammi del plasmide trasposto. Successivamente, disperdere il pellet di cellule T e risospendere una miscela master di DNA in soluzione di affezione nucleare NU a una concentrazione cellulare finale di due volte il decimo delle settime cellule per 100 microlitri.Trasferire con cura 100 microlitri della sospensione cellulare in ciascuna delle 10 cuvette lonza nucleo affection facendo attenzione a evitare bolle. Ora tocca una volta il qve ed elettro usando il programma U 0 1 4 per cellule T non stimolate. Trasferire le cuvette e la piastra equilibrante a 12 pozzetti nella cappa di coltura utilizzando una pipetta per il trasferimento di puntali fini a 500 microlitri di terreno di coltura preriscaldato dal pozzetto corrispondente a ciascuna vete.Trasferire le cellule elettroporate sulla piastra e lasciare che le cellule si riprendano nell'incubatore per colture cellulari per due ore. Quindi trasferire le cellule da tutti i pozzetti in una provetta da centrifuga sterile e pellettare le cellule dopo un lavaggio, disperdere delicatamente il pellet cellulare e sospendere nuovamente in CCM per ottenere una sospensione a singola cellula. Dopo aver eseguito un conteggio delle cellule, regolare la concentrazione cellulare in modo che tenda alle sei cellule per millilitro nel CCM.Quindi trasferire la sospensione cellulare in un pallone di coltura e metterla nell'incubatore per una notte per generare cellule trasfettate con EGFP. Ripetere il protocollo di elettroporazione utilizzando cinque volte 10 delle sei cellule per veterinario con cinque microgrammi di plasmide EGFP di controllo amox. Raccogliere le celle elettroporate, quindi eseguire un conteggio delle cellule utilizzando il metodo di esclusione del blu trien.Quindi colorare da una a due volte 10 delle sei cellule con anticorpi specifici per CD tre, CD quattro, CD otto e IgG FC gamma umane come misura dell'espressione di car. Acquisisci le celle con il calibro del fax. Analizza i dati utilizzando il software FCS express per determinare l'espressione dell'auto.Quindi calcola le cellule car positive in coltura. Il clone A PC numero quattro deriverebbe da K 5 62 cellule per co-esprimere le molecole co-stimolatorie desiderate delle cellule T Scongelare un'aliquota di congelato irradiato, A A PC in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quindi lavare le cellule e il CCM enumerare le cellule vitali per esclusione blu di viaggio e calcolare il numero di A A PC vitali necessari per la stimolazione.Miscelare le cellule elettroporate che esprimono car e l'A A PC irradiato con raggi gamma in un contenitore sterile in un rapporto di uno a due. Regolare il rapporto A PC per l'espressione di car in base alla citometria a flusso il giorno dopo l'elettroporazione Aggiungere 30 nanogrammi per millilitro di IL 21 alla sospensione cellulare. Quindi Eloqua si è occupato delle sei cellule per millilitro in fiasche T 75 o ha visto le sacche di coltura della vita e il ritorno all'incubatore di coltura, l'elettrotrasferimento dei plasmidi di DNA e la propagazione delle cellule T su raggi gamma.Un PC può essere utilizzato per generare un numero clinicamente interessante di cellule T derivate dal sangue periferico e dal sangue del cordone ombelicale per applicazioni umane. In questa caratterizzazione di cellule T geneticamente modificate provenienti dall'espressione ematica periferica di EGFP al giorno zero del primo ciclo di stimolazione, i controlli per l'efficienza del trasferimento genico dell'espressione di CD 19 specifica per l'auto sono valutati mediante citometria a flusso su cellule T CD tre positive, CD otto positive e CD quattro positive a circa 24 ore dopo l'elettroporazione. E poi 28 giorni dopo la co-coltura su A A PC cinetica di espressione car su cellule T coltivate in un sistema funzionalmente chiuso.La propagazione nel tempo di cellule T car positive derivate dal sangue periferico può generare un numero clinicamente attraente di cellule T che esprimono stabilmente l'auto. Dopo quattro settimane di co-coltura su A PC, L'espansione media delle cellule T positive CD 3 è di circa 19.800 con il 90% di espressione di CAR. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eleggere la parata e propagare le cellule T che esprimono un'auto desiderata.Ricordati di monitorare la crescita eccessiva delle cellule NK. L'elettroporazione e la propagazione delle cellule T si realizzano in genere in quattro cicli di stimolazione di sette giorni. Ulteriori indagini, come il rilascio di citochine e i saggi di citotossicità, possono essere eseguiti per valutare la specificità reindirizzata delle cellule T geneticamente modificate nel campo dell'immunoterapia adottiva.Questa tecnica ci aiuta a comprendere il potenziale terapeutico delle cellule T che vengono infuse negli esseri umani.

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Immunologia e Infezioni

Un rapido, protocollo semplice e conveniente per la generazione di donatore-derivati ​​multivirus specifici CTL (RCtl) per infusione a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (HSCT) a rischio di sviluppare infezioni da CMV, EBV o Adv. Questo processo di fabbricazione è GMP e deve assicurare l'applicazione più ampia di cellule T immunoterapia al di là di centri specializzati.

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Un nuovo metodo DC indipendente per l'induzione e l'espansione di antigene-specifica delle cellule T è descritta. HLA-A2 Ig Cellule artificiali basati Antigen Presenting (aAPC) vengono caricati con HLA-A2 peptidi limitato ad ampliare in modo efficace CTL di specificità antigenica diversi. Questa tecnologia ha un grande potenziale per CTL-immunoterapia adottiva.

HLA-Ig celle in base Antigen Presenting artificiale per Efficiente Ex vivo Estensione dei diritti dell&#39;uomo e CTL

Qui si descrive la prima pratica di fabbricazione (GMP) conforme metodo per produrre virus-specifici linfociti T citotossici (CTL) da sangue del cordone ombelicale, fonte di cellule T prevalentemente ingenuo.

Espansione linfociti T citotossici da sangue del cordone ombelicale che Target Citomegalovirus, virus di Epstein-Barr virus, e Adenovirus

Generazione di linfociti T da staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule fornisce un approccio alternativo di utilizzare cellule staminali embrionali per T cell-based immunoterapia. Il metodo dimostra che utilizzando...

Differenziazione Regia di cellule staminali pluripotenti indotte verso Linfociti T

Presentiamo qui un metodo per sviluppare cellule T regolatorie (Treg) specifiche per l'antigene funzionale (Ag) da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) per l'immunoterapia dell'artrite autoimmune in un modello murino.

Lo sviluppo di cellule staminali derivate antigene-specifiche cellule T regolatorie contro autoimmunità

Cellule T antigene-specifiche sono difficili da caratterizzare o utilizzare in terapie grazie alla loro frequenza estremamente bassa. Qui, forniamo un protocollo per sviluppare una particella magnetica che si può associare a cellule T antigene-specifiche per arricchire queste cellule e quindi di espanderli diversi moltiplicati per la caratterizzazione e la terapia.

Arricchire ed espandere cellule T antigene-specifiche rara con nanoparticelle magnetiche

Questo articolo descrive un nuovo metodo per generare emigranti timici (iTE) derivati da cellule staminali specifiche dell'antigene tumorale del tumore da un sistema di coltura timica tridimensionale (3D). ITE sono un sottoinsieme omogeneo di cellule T strettamente correlate alle cellule T ingenue con la capacità di proliferazione, formazione della memoria, e la soppressione del tumore.

Un sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigrati timici derivati da murine

L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare il primate non umano CD34+ cellule dal midollo osseo innescato, gene-modificare queste cellule con vettori lentivirali e preparare un prodotto per infusione nell'ospite autologo. La lunghezza di protocollo totale è di circa 48 ore.

Preparazione e modificazione genetica di staminali ematopoietiche Nonhuman Primate e cellule progenitrici

Presentato qui è un protocollo per l'effettiva soppressione della replicazione del virus dell'epatite B (HBV) nei topi utilizzando il trasferimento di cellule adottive (ACT) di antigeni virali (Ag) specifici di cellule staminali. Questa procedura può essere adattata per una potenziale immunoterapia basata su ACT dell'infezione da HBV.

Le cellule staminali derivate dall'ag virale specifico t linfociti sopprimeno la replica HBV nei topi

Il presente protocollo descrive una procedura di coltura ottimizzata di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) per l'attecchimento robusto di cellule geneticamente modificate in vivo.

CRISPR/Cas9 Gene Editing di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche per applicazioni di terapia genica

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro semplificato per generare e testare cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano (CAR Tregs).

Generazione di cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano

Scopri come modificare geneticamente le cellule T con il sistema Sleeping Beauty per esprimere recettori CAR antitumorali. Questo metodo utilizza cellule presentanti l'antigene artificiali per propagare numeri clinicamente significativi di cellule T CAR-positive per l'immunoterapia adottiva contro le neoplasie a cellule B.

Applicazione clinica della Bella Addormentata Artificiale e cellule presentanti lantigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico (Video) | JoVE Journal

Applicazione clinica della

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