Applicazione clinica della

Questo protocollo modifica geneticamente le cellule T per introdurre recettori chimerici dell'antigene specifici per gli antigeni tumorali e quindi propaga numeri clinicamente significativi sulle cellule presentanti l'antigene artificiale. Inizia con il trasferimento elettrico della bella addormentata. Trasporre e trasporre plasmidi di DNA A in cellule mononucleate quiescenti isolate dal sangue periferico o del cordone ombelicale.

Quindi misurare l'efficienza della trasfezione utilizzando la citometria a flusso. Successivamente, le cellule T trasfettate per sette giorni su cellule presentanti antigeni artificiali derivate da K 5 62 con l'aggiunta di citochine esogene in una stimolazione di quattro settimane. I cicli di proliferazione procedono per analizzare, crioconservare e rilasciare le cellule T car positive elettroporate e propagate per l'applicazione umana.

Il sistema trasposivo su trasposo della bella addormentata offre un'alternativa agli approcci di trasferimento genico basati su virus per introdurre stabilmente un gene nella cellula di scelta. Uno dei principali vantaggi del sistema della bella addormentata è che si possono integrare i geni a un costo davvero ridotto rispetto ai plasmidi del DNA che si integrano attraverso la ricombinazione illegittima non omologa. Pertanto, il vantaggio è che il sistema della bella addormentata può essere utilizzato per esprimere un gene a basso costo e ad alta efficienza.

In generale, gli individui nuovi a questo metodo dovranno inizialmente superare l'efficienza delle cellule T elettro nella propagazione selettiva di cellule T car positive su cellule presentanti antigeni artificiali. Entrambi i passaggi sono difficili da padroneggiare a causa della necessità di co-cultura. Cellule T geneticamente modificate su cellule presentanti antigeni artificiali.

Questo metodo è utile nel campo dell'immunoterapia adottiva, in particolare nella somministrazione genica efficace e nella produzione di un numero clinicamente significativo di cellule T. L'applicazione più ampia si estende alla terapia del cancro perché le cellule T del sistema immunitario possono essere modificate per essere specifiche per il tumore. A dimostrare la procedura saranno Margaret Dawson e Matthew Fiola.

Tecnici del mio laboratorio Per prima cosa diluire il sangue periferico con un volume uguale di P-B-S-E-D-T-A e il sangue del cordone ombelicale con quattro volumi di P-B-S-E-D-T-A sovrapporre lentamente 25 millilitri di sangue diluito su 12 millilitri di fial in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare la sfumatura di fiale a 400 g per 30-40 minuti senza interruzioni. Trasferire ora la frazione di cellule mononucleate in una provetta da centrifuga fresca da 50 millilitri con P-B-S-E-D-T-A.

Portare il volume a 50 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Lavare delicatamente le cellule una volta ogni 50 millilitri di coltura completa, terreni e centrifugare a 400 G per 10 minuti. Quindi raggruppare i pellet cellulari in CCM, eseguire un conteggio delle cellule.

Utilizzando il metodo di esclusione triam blue. Le celle mononucleate possono ora essere utilizzate per l'elettroporazione o crioconservate per un uso futuro. Se si utilizza la MNC crioconservata, scongelare rapidamente due volte 10 all'ottava cella per un'elettroporazione su larga scala, trasferire delicatamente le cellule in una provetta da centrifuga di dimensioni adeguate contenente preriscaldamento.

Completare i terreni di coltura RPMI privi di fenolo e pellettare le cellule mediante centrifugazione, risospendere le cellule mononucleate In P-F-R-P-M-I, eseguire una conta cellulare e trasferire le cellule in un recipiente di coltura cellulare di dimensioni adeguate a una concentrazione di 10 delle sei cellule per millilitro. Equilibrare le cellule in un incubatore umidificato per due ore. Raccogliere la MNC mediante centrifugazione, quindi risospendere delicatamente e combinare i pellet cellulari in P-F-R-P-M-I ed enumerare le cellule Ora trasferire due volte 10 all'ottava MNC in una provetta da centrifuga sterile da 50 millilitri e centrifugare a 200 Gs per 10 minuti senza interruzioni.

Aspirare il surnatante in modo che non rimangano residui di terreno intorno al pellet cellulare. Preparare una piastra sterile a 12 pozzetti con 10 pozzetti contenenti quattro millilitri di P-F-R-P-M-I caldo ed equilibrare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Quindi ricostituire la soluzione effettrice Lonzo Nucleo dal kit di cellule T umane secondo le istruzioni del produttore per ogni reazione.

Q Vet preparare 100 microlitri di DNA master mix contenente la soluzione di effettore nucleare NU integrata. 15 microgrammi del plasmide trasposto e cinque microgrammi del plasmide trasposto. Successivamente, disperdere il pellet di cellule T e risospendere una miscela master di DNA in soluzione di affezione nucleare NU a una concentrazione cellulare finale di due volte il decimo delle settime cellule per 100 microlitri.

Trasferire con cura 100 microlitri della sospensione cellulare in ciascuna delle 10 cuvette lonza nucleo affection facendo attenzione a evitare bolle. Ora tocca una volta il qve ed elettro usando il programma U 0 1 4 per cellule T non stimolate. Trasferire le cuvette e la piastra equilibrante a 12 pozzetti nella cappa di coltura utilizzando una pipetta per il trasferimento di puntali fini a 500 microlitri di terreno di coltura preriscaldato dal pozzetto corrispondente a ciascuna vete.

Trasferire le cellule elettroporate sulla piastra e lasciare che le cellule si riprendano nell'incubatore per colture cellulari per due ore. Quindi trasferire le cellule da tutti i pozzetti in una provetta da centrifuga sterile e pellettare le cellule dopo un lavaggio, disperdere delicatamente il pellet cellulare e sospendere nuovamente in CCM per ottenere una sospensione a singola cellula. Dopo aver eseguito un conteggio delle cellule, regolare la concentrazione cellulare in modo che tenda alle sei cellule per millilitro nel CCM.

Quindi trasferire la sospensione cellulare in un pallone di coltura e metterla nell'incubatore per una notte per generare cellule trasfettate con EGFP. Ripetere il protocollo di elettroporazione utilizzando cinque volte 10 delle sei cellule per veterinario con cinque microgrammi di plasmide EGFP di controllo amox. Raccogliere le celle elettroporate, quindi eseguire un conteggio delle cellule utilizzando il metodo di esclusione del blu trien.

Quindi colorare da una a due volte 10 delle sei cellule con anticorpi specifici per CD tre, CD quattro, CD otto e IgG FC gamma umane come misura dell'espressione di car. Acquisisci le celle con il calibro del fax. Analizza i dati utilizzando il software FCS express per determinare l'espressione dell'auto.

Quindi calcola le cellule car positive in coltura. Il clone A PC numero quattro deriverebbe da K 5 62 cellule per co-esprimere le molecole co-stimolatorie desiderate delle cellule T Scongelare un'aliquota di congelato irradiato, A A PC in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quindi lavare le cellule e il CCM enumerare le cellule vitali per esclusione blu di viaggio e calcolare il numero di A A PC vitali necessari per la stimolazione.

Miscelare le cellule elettroporate che esprimono car e l'A A PC irradiato con raggi gamma in un contenitore sterile in un rapporto di uno a due. Regolare il rapporto A PC per l'espressione di car in base alla citometria a flusso il giorno dopo l'elettroporazione Aggiungere 30 nanogrammi per millilitro di IL 21 alla sospensione cellulare. Quindi Eloqua si è occupato delle sei cellule per millilitro in fiasche T 75 o ha visto le sacche di coltura della vita e il ritorno all'incubatore di coltura, l'elettrotrasferimento dei plasmidi di DNA e la propagazione delle cellule T su raggi gamma.

Un PC può essere utilizzato per generare un numero clinicamente interessante di cellule T derivate dal sangue periferico e dal sangue del cordone ombelicale per applicazioni umane. In questa caratterizzazione di cellule T geneticamente modificate provenienti dall'espressione ematica periferica di EGFP al giorno zero del primo ciclo di stimolazione, i controlli per l'efficienza del trasferimento genico dell'espressione di CD 19 specifica per l'auto sono valutati mediante citometria a flusso su cellule T CD tre positive, CD otto positive e CD quattro positive a circa 24 ore dopo l'elettroporazione. E poi 28 giorni dopo la co-coltura su A A PC cinetica di espressione car su cellule T coltivate in un sistema funzionalmente chiuso.

La propagazione nel tempo di cellule T car positive derivate dal sangue periferico può generare un numero clinicamente attraente di cellule T che esprimono stabilmente l'auto. Dopo quattro settimane di co-coltura su A PC, L'espansione media delle cellule T positive CD 3 è di circa 19.800 con il 90% di espressione di CAR. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eleggere la parata e propagare le cellule T che esprimono un'auto desiderata.

Ricordati di monitorare la crescita eccessiva delle cellule NK. L'elettroporazione e la propagazione delle cellule T si realizzano in genere in quattro cicli di stimolazione di sette giorni. Ulteriori indagini, come il rilascio di citochine e i saggi di citotossicità, possono essere eseguiti per valutare la specificità reindirizzata delle cellule T geneticamente modificate nel campo dell'immunoterapia adottiva.

Questa tecnica ci aiuta a comprendere il potenziale terapeutico delle cellule T che vengono infuse negli esseri umani.