Name: Preparazione del Tumor Antigen-caricati mature cellule dendritiche per limmunoterapia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Impara a preparare cellule dendritiche mature caricate con antigeni tumorali per l'immunoterapia. Questo metodo utilizza GM-CSF e IL-4 per differenziare i monociti, seguito da maturazione con poly ICLC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano ringraziare Andres Salazar (Oncovir, Inc.) per il dono della Poli-ICLC.

1. Isolamento e Crioconservazione di PBMC 4 <ol><li> Asetticamente Spike una delle porte di accesso nella borsa leucoaferesi utilizzando un set di trasferimento del plasma. Usando una siringa da 60 ml, trasferire il leucaferesi ottenute da pazienti in una bottiglia sterile da 500 ml. </li><li> Regolare il volume della leucaferesi a 2x il suo volume originale con temperatura ambiente RPMI. Mescolare accuratamente. </li><li> Mescolare delicatamente il flacone di Ficoll-Paque PLUS. Aggiungere 12 ml PLUS Ficoll-Paque in sterile da 50 ml tubo conico. </li><li> Strato delicatamente 30 ml di prodotto diluito leucaferesi per ogni tubo da 50 ml conica sterile contenente Ficoll. Fare attenzione a non disturbare l&#39;interfaccia tra il Ficoll e la sospensione cellulare. </li><li> Ripetere i passi 1.3 e 1.4 fino a quando tutta la leucaferesi è stato stratificato. </li><li> Centrifugare le provette coniche da 50 ml a 1.000 xg per 20 min a temperatura ambiente senza freno. </li><li> Raccolta accuratamente lo strato nuvoloso di PBMC da ciascuna provetta e transfer per nuovi ml provette sterili 50. </li><li> Aggiungere a ciascun tubo RPMI ad un volume finale di 50 ml. Mescolare delicatamente per inversione. </li><li> Centrifugare le cellule a 500 xg per 10 min a 4 ° C con freno pieno. </li><li> Rimuovere il surnatante da ogni provetta. Risospendere il pellet di cellule provenienti da ogni provetta e aggiungere RPMI ad un volume finale di 50 ml. Mescolare delicatamente per inversione. </li><li> Centrifugare le cellule a 500 g per 6 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante da ogni provetta. Risospendere e piscina insieme le sospensioni di cellule in una provetta da 50 ml. </li><li> Portare il volume delle PBMC aggregati fino a 50 ml con più RPMI. Mescolare delicatamente per inversione. </li><li> Centrifugare le cellule a 300 g per 6 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet di cellule in 50 ml di RPMI. Mescolare delicatamente per garantire la sospensione cellulare uniforme. </li><li> Contare il numero di cellule e determinare la vitalità cellulare. Calcolare il numero totale di cellule vitali. </li><li> Centrifugare le cellule a 300G per 6 minuti a 4 ° C. Preparare il supporto di congelamento. Congelamento dei media è costituito da 10% di dimetilsolfossido (DMSO; Miltenyi Biotec) in AB umana sierica (Valle Biomedica). </li><li> Rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule ad una concentrazione finale di 2 x 10 8 cellule / ml in mezzi congelamento fredde. </li><li> Fai aliquote da 1 ml a 1,8 ml cryovials. </li><li> Trasferire i cryovials nel congelatore a velocità controllata e iniziare la corsa di congelamento, Programma 1. Al termine della corsa, trasferire le cryovials congelati immediatamente nella fase vapore del congelatore azoto liquido. </li></ol> 2. Giorno 0: la differenziazione delle cellule dendritiche da monociti <ol><li> Aggiungere 30 ml di RPMI / 1% di plasma autologo di una sterile 50 ml tubo conico. </li><li> Aliquote disgelo di PBMC congelati da parte di agitazione a 37 ° C bagnomaria. Quando completamente scongelati, trasferire il contenuto dei flaconi per la sterile da 50 ml tubo conico. Mescolare accuratamente. </li><li> Centrifugare le cellule per 6 mina 500 xg a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule pellet in un piccolo volume di RPMI / 1% di plasma autologo. Poi aggiungere più RPMI / 1% di plasma autologo ad un volume finale di 50 ml. Mescolare accuratamente. </li><li> Centrifugare nuovamente le cellule per 6 min a 500 xg a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 50 ml di RPMI / 1% di plasma autologo. Mescolare accuratamente. </li><li> Contare il numero di cellule e determinare la vitalità cellulare. Calcolare il numero totale di cellule vitali. </li><li> Piastra 1,40 x 10 8 cellule in 40 ml di RPMI / 1% di plasma autologo su 225 centimetri 2 EasyFlask. Ripetere l&#39;operazione fino a che tutte le celle sono stati placcati. </li><li> Incubare le EasyFlasks piatte sul suo lato per 1-2 ore a 37 ° C in coltura tissutale incubatore contenente il 5% di CO 2 per permettere ai monociti di aderire al pallone. </li><li> Quando l&#39;incubazione, rimuovere il EasyFlask dall&#39;incubatore e lavare due volte per rimuovere le cellule non aderenti USIng 30 ml di RPMI preriscaldata. </li><li> Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 40 ml di RPMI / 1% di plasma autologo con 400-1,000 IU / ml di IL-4 e 100-1.000 UI / ml di GM-CSF 5-8. Per questo protocollo, stiamo utilizzando 400 UI / ml di IL-4 e 100 UI / ml di GM-CSF. </li><li> Incubare le EasyFlasks per 2 giorni a 37 ° C in incubatore coltura tissutale contenente il 5% di CO 2. </li></ol> 3. Giorno 2: Alimentazione delle cellule dendritiche con IL-4 e GM-CSF <ol><li> Aggiungere 4 ml di RPMI / 1% di plasma autologo con 400-1,000 IU / ml di IL-4 e 100-1.000 UI / ml di GM-CSF per ciascun EasyFlask. Mescolare accuratamente e dondolo su un fianco. </li><li> Incubare le EasyFlasks per ulteriori 3 giorni (fino al giorno 5) a 37 ° C in incubatore coltura tissutale contenente il 5% di CO 2. </li></ol> 4. Giorno 5: Raccolta di cellule dendritiche immature <ol><li> Raccogliere le culture vigorosamente vorticoso i palloni e pipettando su e giù per risospendere le cellule non aderenti e vagamente aderente. Trasferire ilcellule raccolte a nuove provette coniche da 50 ml. </li><li> Centrifugare le provette a 500 g per 6 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 50 ml RPMI / 1% di plasma autologo. Mescolare accuratamente. </li><li> Contare il numero di cellule e determinare la vitalità cellulare. Calcolare il numero totale di cellule vitali. </li><li> Centrifugare le provette a 500 g per 6 minuti a temperatura ambiente. Piastra di 1-2 x 10 6 cellule per pozzetto in 3 ml RPMI / 1% di plasma autologo con 400 IU / ml di IL-4 e 100 UI / ml di GM-CSF in piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C in coltura tissutale incubatore contenente il 5% di CO 2 durante la notte. </li></ol> 5. Giorno 6: Maturazione e Antigen Caricamento delle cellule dendritiche <ol><li> Aggiungere 10 mcg / ml KLH a 1/3 dei pozzetti nelle piastre di coltura a 6 pozzetti. Swirl le piastre per mescolare. KLH viene aggiunto solo a 1/3 dei pozzi perché KLH è usato solo per il primo vaccino DC. Successivamente DC vaccini conTain solo i peptidi antigeni tumorali. </li><li> DC può essere stimolato a maturare con stimoli diversi. Gli stimoli maturazione più comuni che è stato utilizzato in studi clinici è stato un cocktail di citochine (IL-1 β, TNFa e IL-6) e di prostaglandina E2 (PGE2) 9,10. Più di recente, l&#39;uso di agonisti dei recettori Toll-like (TLR) hanno guadagnato popolarità 11,12. In questo protocollo, aggiungere 2 mg / ml Polyinosinic-policitidilico Carbossimetilcellulosa acido poli-L-lisina (Poly-ICLC) ad ogni pozzetto e mescolare bene. Poli-ICLC è la formulazione clinico-grado di Poly-IC che viene stabilizzato con poli-L-lisina e *-carbossimetilcellulosa (fabbricato da Oncovir, Inc.). </li><li> Aggiungere 100 pg / ml antigeni peptidici lunghi (NY-ESO-1 e / o Melan-A/MART-1) nei pozzetti designati, ogni pozzetto riceve solo un singolo peptide per evitare la concorrenza 13. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C in coltura tissutale incubatore contenente il 5% di CO &lt;sub&gt; 2 O / N. </li></ol> 6. Giorno 7: Crioconservazione delle cellule dendritiche <ol><li> Preparare la soluzione di congelamento DC utilizzando plasma autologo e il 10% di DMSO. Centrifugare la soluzione di congelamento DC a 2.000 xg per 20 min a 4 ° C per rimuovere il materiale particolato. Trasferire il surnatante in una nuova etichetta da 15 ml tubo conico. Conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Quando la notte di incubazione è terminata, il raccolto e la piscina tutti i pozzetti contenenti DC pulsate con i peptidi in provette coniche da 50 ml. </li><li> Centrifugare le provette a 500 g per 6 min. Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in 5 ml di RPMI / 1% di plasma autologo. Portare il volume totale fino a 50 ml con RPMI / 1% di plasma autologo. Mescolare accuratamente. </li><li> Contare il numero di cellule e determinare la vitalità cellulare. Calcolare il numero totale di cellule vitali. </li><li> Centrifugare le provette a 500 × g per 6 min a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet in 5 ml steriLe 0,9% NaCl, USP e trasferimento in nuovi tubi da 15 ml. Portare ogni sospensione cellulare a 14 ml con più sterile di NaCl 0,9%, USP. Cap e mescolare per inversione. </li><li> Ripetere il passaggio precedente per due volte. Dopo l&#39;ultima centrifugazione, rimuovere i surnatanti, ottenendo il più vicino possibile al pellet cellulari senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in CC Solution congelamento a 4 - 20 x 10 6 cellule / ml e 1 ml aliquota ad ogni flacone CryoTube 1,8 ml. </li><li> Utilizzare il congelatore a velocità regolata, Programma 1, di congelare le aliquote di vaccini DC e trasferire immediatamente nella fase vapore di un congelatore azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol> 7. Lotto controllo del rilascio <ol><li> Ogni lotto di vaccino DC deve essere valutato e rispettare determinati criteri di lotto specifico (Tabella 1) prima di essere rilasciato per iniezione in pazienti nello studio, in genere 5-6 settimane dopo la preparazione del vaccino. </li><li> Viabilità:Valutare la sostenibilità del vaccino DC utilizzando un contatore automatico di cellule. La specifica minima redditività accettabile è&gt; 70%. </li><li> Identità: Valutare l&#39;identità della DC mature (CD11c + CD14-CD83 +) in citometria a flusso. La percentuale di cellule + CD11c deve essere&gt; 50%. La percentuale di CD11c + e CD14 + cellule dovrebbe essere &lt;30% e la percentuale di CD11c +, CD14-, CD83 + e cellule devono essere&gt; 50%. </li><li> Sterilità: test del vaccino DC per la presenza di batteri anaerobici e aerobici e funghi di cultura diretta e colorazione di Gram. Valutare la presenza di micoplasma utilizzando un sistema di coltura diretta e DNA fluorocromo Assay colorazione con indicatore Cell Line. Per queste prove, il set minimo specifica è alcuna crescita viene osservato da tutte le culture. </li><li> Endotossina: valutare il contenuto di endotossine con il Kinetic-QCL cinetico cromogenico LAL test e deve essere &lt;50 EU / ml per soddisfare i criteri minimi. </li><li&gt; Funzione: Valutare la funzione DC in una reazione linfocitaria mista mediante incubazione con cellule T allogeniche. La presenza di proliferazione rispetto alle DC non stimolate viene riportato (figura 3). </li></ol>

<ol><li>Lesterhuis, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+vaccines+in+melanoma%3A+from+promise+to+proof%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).</li>
<li>Sabado, R. L., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+dendritic+cell+immunotherapy+towards+successful+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment.</a> Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).</li>
<li>Schumacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keyhole+limpet+hemocyanin+%28KLH%29+conjugate+vaccines+as+novel+therapeutic+tools+in+malignant+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer.+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, Suppl 2. 1-2 (2001).</li>
<li>Jaatinen, T., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+from+human+cord+blood+by+Ficoll-Paque+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1(2007).</li>
<li>Eichler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+study+on+in+vitro+characterization+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells.</a> Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).</li>
<li>Feuerstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+production+of+cryopreserved+aliquots+of+antigen-preloaded%2C+mature+dendritic+cells+ready+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use.</a> J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).</li>
<li>O'Neill, D., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+autologous+peptide-+and+protein-pulsed+dendritic+cells+for+patient-specific+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy.</a> Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).</li>
<li>de Vries, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypical+and+functional+characterization+of+clinical+grade+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells.</a> J. Immunother. 25, 429-438 (2002).</li>
<li>Jonuleit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+cytokines+and+prostaglandins+induce+maturation+of+potent+immunostimulatory+dendritic+cells+under+fetal+calf+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions.</a> Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).</li>
<li>Lee, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+grade+cocktail+of+cytokines+and+PGE2+results+in+uniform+maturation+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells%3A+implications+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy.</a> Vaccine. 20, Suppl 4. A8-A22 (2002).</li>
<li>Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+immune+system+to+treat+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Harnessing the immune system to treat cancer.</a> J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).</li>
<li>Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+agonists%3A+are+they+good+adjuvants%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?</a> Cancer J. 16, 382-391 (2010).</li>
<li>Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+dominance%2C+competition+and+T+cell+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation.</a> Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).</li>
<li>Bogunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR4+engagement+during+TLR3-induced+proinflammatory+signaling+in+dendritic+cells+promotes+IL-10-mediated+suppression+of+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity.</a> Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).</li>
<li>Verdijk, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyriboinosinic+polyribocytidylic+acid+%28poly%28I%3AC%29%29+induces+stable+maturation+of+functionally+active+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells.</a> J. Immunol. 163, 57-61 (1999).</li>
<li>Rouas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28I%3AC%29+used+for+human+dendritic+cell+maturation+preserves+their+ability+to+secondarily+secrete+bioactive+IL-12%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12.</a> Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).</li>
<li>Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1-polarizing+capacity+of+clinical-grade+dendritic+cells+is+triggered+by+Ribomunyl+but+is+compromised+by+PGE2%3A+the+importance+of+maturation+cocktails%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails.</a> J. Immunother. 28, 480-487 (2005).</li>
<li>Krause, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+is+a+key+factor+for+monocyte-derived+dendritic+cell+maturation%3A+enhanced+T+cell+stimulatory+capacity+despite+IDO%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO.</a> J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).</li>
<li>Morelli, A. E., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+under+the+spell+of+prostaglandins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells under the spell of prostaglandins.</a> Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).</li>
<li>Adams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+%28DC%29+based+therapy+for+cervical+cancer%3A+use+of+DC+pulsed+with+tumour+lysate+and+matured+with+a+novel+synthetic+clinically+non-toxic+double+stranded+RNA+analogue+poly+%5BI%5D%3Apoly+%5BC%2812%29U%5D+%28Ampligen+R%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R).</a> Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).</li>
<li>Colombo, M. P., Trinchieri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-12+in+anti-tumor+immunity+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).</li>
<li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).</li>
<li>Dhodapkar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+broad+T-cell+immunity+in+humans+after+a+single+injection+of+mature+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells.</a> J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).</li>
<li>Schuler-Thurner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+of+tumor-specific+type+1+T+helper+cells+in+metastatic+melanoma+patients+by+vaccination+with+mature%2C+cryopreserved%2C+peptide-loaded+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells.</a> J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).</li>
</ol>

Gli autori hanno ricevuto un sostegno finanziario dal seguente: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 e K08 AI084578 (Miller)), la Bill and Melinda Gates Foundation, Doris Duke Charitable Foundation, Cancer Research Institute, Alliance for Lupus Research, e l&#39;Emerald Fondazione. Nina Bhardwaj è un coinventore su brevetti relativi alla preparazione e utilizzo di cellule dendritiche per manipolare l&#39;immunità. Gli autori non hanno altre affiliazioni rilevanti o coinvolgimento finanziario con qualsiasi organizzazione o ente con un interesse finanziario in conflitto o finanziaria con l&#39;oggetto o materiale discusso nel manoscritto oltre a quelle descritte.

Fase I e II di sviluppo clinico di DC derivate da monociti hanno dimostrato che inducono risposte immunitarie nei pazienti però il successo clinico è stato limitato 1. Ciò può essere dovuto in parte alla mancanza di consenso su come generare il DCS ottimali per uso immunotherapeutic tumore. Sebbene ci siano molti modi per generare DC ad uso clinico, questi metodi variano in termini di uso di citochine utilizzati per differenziare i monociti, stimoli usati per indurre la maturazione, e metodi di antigene caric...

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 terreno con L-glutammina</td><td>BioWhittaker</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES soluzione salina tamponata</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>BioWhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Albumina umana, soluzione al 25% USP</td><td>Aventis Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Hypaque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Siero AB umano</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile USP</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS DMSO </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-303</td><td></td></tr><tr><td>Leukine GM-CSF, 0,5 mg/ml</td><td>Berlex</td><td>A02266</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP IL-4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-101</td><td></td></tr><tr><td>Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml</td><td>Oncovir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>VACMUNE KLH</td><td>Biosyn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>225 cm² EasyFlasks</td><td>Nalgene Nunc</td><td>159934</td><td></td></tr><tr><td>Falcon piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Fiale CryoTube da 1,8 ml</td><td>Nalgene Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Congelatore a velocità controllata</td><td>Thermo</td><td>CryoMed</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione del tumor antigen-caricati mature cellule dendritiche per l&#39;immunoterapia

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Mentre gli studi clinici hanno dimostrato che i vaccini DC antigene-caricati sono al sicuro e promettente terapia per i tumori 1, la loro efficacia clinica rimane da stabilire. Il metodo descritto di seguito, redatto in conformità con buon processo di fabbricazione (GMP), è una ottimizzazione del metodo di preparazione ex vivo più comuni per la generazione di un gran numero di cellule dendritiche per gli studi clinici 2. Il nostro metodo utilizza il TLR sintetico 3 agonista Polyinosinic-policitidilico Carbossimetilcellulosa acido poli-L-lisina (Poly-ICLC) per stimolare i PVS. Nostro studio precedente stabilito che Poly-ICLC è il più potente stimolo maturazione individuale per DCs umane valutata da una sovraregolazione di CD83 e CD86, induzione di interleuchina-12 (IL-12), fattore di necrosi tumorale (TNF), interferone gamma-indotta proteina 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), e interferoni di tipo I (IFN), e minimale interleuchina 10 (IL-10) di produzione. </p&gt; DC sono differenziati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC congelati) ottenuti da leucaferesi. PBMC vengono isolati mediante centrifugazione su gradiente Ficoll e congelati in aliquote. Il giorno 1, PBMC vengono scongelati e piastrate su fiasche di coltura tissutale di selezionare per i monociti che aderiscono alla superficie plastica dopo 1-2 ore di incubazione a 37 ° C in incubatore coltura tissutale. Dopo l&#39;incubazione i linfociti vengono lavati via ed i monociti aderenti sono coltivate per 5 giorni in presenza di interleuchina-4 (IL-4) e granulociti macrofagi fattore stimolante le colonie (GM-CSF) per differenziare a DC immature. Il giorno 6, DC immature vengono pulsate con l&#39;emocianina di patella (KLH) keyhole proteina che serve come un controllo per la qualità del vaccino e può aumentare l&#39;immunogenicità del vaccino 3. Le cellule dendritiche sono stimolati a maturare, caricati con antigeni peptidici, e incubate per una notte. Il giorno 7, le cellule vengono lavate, e congelati in aliquote da 1 ml contenente4 - 20 x 10 6 cellule usando un congelatore a velocità controllata. Controllo del rilascio del lotto per i lotti di DCS viene eseguito e deve soddisfare requisiti minimi prima di essere iniettati nel paziente.

Tra il 10 - 20% delle PBMC partire differenziarsi in cellule dendritiche al termine del periodo di coltura. DC mature sono CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, e CCR7 + (Figura 1). Essi esprimono alti livelli di MHC di classe I e II e le molecole di molecole co-stimolatorie CD80 e CD86. Poli-ICLC anche indotto livelli inferiori di PDL-1 rispetto ad altri agonisti TLR 14. Inoltre, questi Poly-IC-maturati dendritiche secernono grandi quantità di IL-12 (Figura 2 e 15,16) e...

Il metodo più comunemente utilizzato per generare un elevato numero di cellule dendritiche autologhe (DC) per uso in immunoterapia tumore è descritto. Il metodo utilizza IL-4 e GM-CSF per differenziare DC da monociti. Le DC immature sono stimolati a maturo e poi caricato con antigeni prima di essere iniettati nel paziente.

Preparazione del Tumor Antigen-caricati mature cellule dendritiche per l&#39;immunoterapia

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la preparazione di cellule dendritiche di grado clinico per l'immunoterapia. Questo viene ottenuto innanzitutto congelando cellule mononucleate del sangue periferico isolate mediante leucaferesi. Nel secondo passaggio, gli aliquote congelati di pbmc vengono scongelati e i monociti vengono differenziati in cellule dendritiche in presenza di G-M-C-S-F e IL-4 per cinque giorni.Successivamente, le cellule dendritiche vengono raccolte, trattate con peptidi e mature durante la notte con l'agonista del TLR3 poli ICLC. Nell'ultima fase, le cellule dendritiche mature vengono raccolte e congelate in aliquote. Queste aliquote congelate di cellule dendritiche mature possono essere scongelate, trasferite in siringhe e iniettate nuovamente nei pazienti come parte della loro immunoterapia.La procedura sarà dimostrata da Merited Sedia e Farra Hassan, entrambi tecnici di ricerca nel mio laboratorio. Utilizzando un set per il trasferimento del plasma, iniziare inserendo in modo asettico uno dei porti di accesso nel sacchetto di leucoplaferesi. Successivamente, utilizzare una siringa da 60 millilitri per trasferire la leucoplaferesi in una bottigl

preparation-tumor-antigen-loaded-mature-dendritic-cells-for

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video mostra la procedura per la differenziazione delle cellule dendritiche mieloidi dal midollo osseo dei topi. Isolamento di tibia e femore del mouse, e la lavorazione del midollo osseo sono dimostrati. Immagini che dimostrano morfologia cellulare prima e dopo la differenziazione, e le figure raffiguranti fenotipo delle cellule e IL-12 maturazione di produzione utilizzando i seguenti CpG sono mostrati.

Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Presentazione dell'antigene in organi linfatici secondari da parte delle cellule dendritiche è cruciale per l'avvio della cellula T mediata risposta immunitaria adattativa. Qui mostriamo la cultura del midollo osseo derivate le cellule dendritiche murine, di attivazione e di etichettatura per 2-fotoni imaging.

Generazione di cellule derivate dal midollo osseo dendritiche murini per l&#39;uso in 2-fotone Imaging

Vi presentiamo il nostro sito ottimizzato high-throughput protocollo nucleofection come un modo efficace di trasfezione delle cellule dendritiche umane primarie derivate da monociti sia con DNA plasmidico o siRNA senza provocare la maturazione delle cellule. Abbiamo inoltre fornire le prove per il silenziamento del gene siRNA successo mirati RIG-I, sia a livelli di mRNA e proteine.

Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule

Valutato in ospiti immunocompetenti sigeneici, il vaccino a cellule dendritiche (DC) a base di cellule staminali tumorali (CSC) ha dimostrato un'immunità antitumorale significativamente più elevata rispetto ai tradizionali vaccini CC pulsati con cellule tumorali alla rinfusa eterogenee.

Generazione di un nuovo vaccino a cellule dendritiche con melanoma e cellule staminali tumorali squamose

Le cellule dendritiche immature possono essere differenziate selettivamente in cellule dendritiche tolleranti o mature per regolare l'equilibrio tra immunità e tolleranza. Questo lavoro presenta un mezzo per generare da cellule dendritiche immature derivate da monociti (moDC), moDC in vitro tollerogeniche e mature che differiscono nei fenotipi metabolici.

Generazione di Immaturo, matura e tollerogenico dendritiche cellule con differenti fenotipi metabolica

Monocito-derivate DC (MoDC) può percepire la minor quantità di molecole associate al pericolo e sono pertanto facilmente innescato. Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento di MoDC da sangue e tumori e la loro attivazione con complessi immuni evidenziando le principali precauzioni che dovrebbero essere considerate al fine di evitare loro attivazione prematura.

Protocollo di isolamento del Mouse cellule dentritiche monocito-derivate e loro attivazione successiva In Vitro con tumore immunocomplessi

Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare e caratterizzare le cellule dendritiche tollerogeniche (TolDCs) e valutare la loro utilità di immunoterapia.

Sviluppo e caratterizzazione funzionale delle cellule dendritiche tollerogeniche murino

Il dispositivo di transimmunizzazione (TI) o la piastra e i relativi protocolli sono stati sviluppati per replicare le caratteristiche chiave della fotochemioterapia extracorporea (ECP), in un ambiente sperimentale, permettendo la produzione di fisiologicamente attivato, Tunable dendritico cellule (DCs) per l'immunoterapia oncologica.

Nuovo protocollo per la generazione di cellule dendritiche fisiologiche immunogene

Il protocollo presenta un modello di immunoterapia del cancro che utilizza la vaccinazione tumorale basata su cellule con melanoma B16-F10 che esprime Flt3L. Questo protocollo dimostra le procedure, compresa la preparazione di cellule tumorali in coltura, l'impianto del tumore, l'irradiazione cellulare, la misurazione della crescita tumorale, l'isolamento delle cellule immunitarie intratumorali e l'analisi della citometria a flusso.

Modello sperimentale di immunoterapia del melanoma utilizzando la vaccinazione tumorale con una citochina ematopoietica

Viene presentato un protocollo unico e completo per generare cellule dendritiche (mo-DC) derivate da monociti umani desialilati da cellule mononucleate isolate del sangue periferico (PBMC) utilizzando un trattamento con sialidasi. Inoltre, vengono descritti metodi per valutare la caratterizzazione fenotipica e funzionale delle mo-DC e valutare come il trattamento con sialidasi migliora il livello di maturazione delle mo-DC.

Generazione di cellule dendritiche derivate da monociti con diversi fenotipi sialilati

Questo protocollo descrive la riprogrammazione in vivo di cellule tumorali di topo in cellule dendritiche di tipo 1 all'interno del microambiente tumorale attraverso l'espressione forzata dei fattori di trascrizione PU.1, IRF8 e BATF3.

Riprogrammazione trattabile in vivo di cellule tumorali in cellule dendritiche convenzionali di tipo 1

Impara a preparare cellule dendritiche mature caricate con antigeni tumorali per l'immunoterapia. Questo metodo utilizza GM-CSF e IL-4 per differenziare i monociti, seguito da maturazione con poly ICLC.

Preparazione del Tumor Antigen-caricati mature cellule dendritiche per l'immunoterapia

Esplora altri video